Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные наноматериалы в составе биосенсоров
1.1. Углеродные наноматериалы
1.1.1. Углеродные нанотрубки
1.1.2. Оксид графена и восстановленный оксид графена (графен) .
Наночастицы металлов Способы получения наночастиц металлов
Варианты современного применения наночастиц металлов
Гиперразветвленные полимеры
Общая характеристика гиперразветвленных полимеров, их типы и применение
Структура и свойства дендримеров
Использование наноматериалов при разработке некоторых биосенсоров .
Антидепрессанты как лекарственные препараты: ингибиторы каталитической активности моноаминоксидазы
Моноаминоксидаза и механизм действия
Биогенные амины как субстраты моноаминоксидазы
Методы определения некоторых лекарственных препаратов
Хроматографические методы определения антидепрессантов
Спектрофотометрические и другие методы определения антидепрессантов .
Постановка задачи, аппаратура, объекты исследования и условия эксперимента .
Постановка задачи Аппаратура и объекты анализа
Реактивы и приготовление растворов Получение гомогенатов из растительного и животного материала
Получение гомогената из свиной печени (моноаминоксидаза)
Получение гомогената из проростков пшеницы (L -цистеиндесульфгидраза)
Обработка экспериментальных данных
Глава 4. Влияние углеродных наноматериалов и наночастиц металлов на аналитические характеристики моноаминоксидазных биосенсоров 65
4.1. Природа формирования аналитического сигнала амперометрических моноаминоксидазных биосенсоров 65
4.2. Модификация поверхности печатных графитовых электродов наноструктурированными материалами 67
Углеродные наноматериалы 67
Наночастицы металлов 75 99
Особенности получения биочувствительной части сенсоров
Биосенсоры на основе электродов, модифицированных углеродными наноматериалами и наночастицами металлов
Аналитические характеристики биосенсоров на основе электродов, модифицированных углеродными нанотрубками и наночастицами металлов, для определения антидепрессантов Аналитические характеристики биосенсоров на основе электродов, модифицированных графеном и наночастицами металлов, для определения антидепрессантов
Аналитические характеристики биосенсоров на основе электродов, модифицированных оксидом графена, для определения антидепрессантов
Кинетические параметры реакции ферментативного превращения субстратов моноаминоксидазы в присутствии антидепрессантов
Ингибирование иммобилизованной моноаминоксидазы в составе биосенсоров на основе модифицированных электродов (углеродные нанотрубки/ наночастицы металлов) в присутствии антидепрессантов
Ингибирование иммобилизованной моноаминоксидазы в составе биосенсоров на основе модифицированных электродов (графен / наночастицы металлов) в присутствии антидепрессантов
Глава 5. Определение антидепрессантов в лекарственных препаратах и биологических жидкостях
Свойства некоторых антидепрессантов и лекарственных веществ с антидепресссивным действием 115
Определение лекарственных веществ в лекарственных препаратах 118
Оценка мешающего влияния лекарственных препаратов на аналитический сигнал моноаминоксидазных биосенсоров 119
5.4. Определение антидепрессантов разными методами 121
5.5. Определение антидепрессантов в урине 126
Заключение 130
Выводы 132
Список сокращений 134
Список литературы
- Наночастицы металлов Способы получения наночастиц металлов
- Хроматографические методы определения антидепрессантов
- Получение гомогената из проростков пшеницы (L -цистеиндесульфгидраза)
- Аналитические характеристики биосенсоров на основе электродов, модифицированных оксидом графена, для определения антидепрессантов
Введение к работе
Актуальность темы. Современные тенденции развития биосенсорных технологий тесно связаны с применением наноструктурированных материалов, что приводит к появлению новых возможностей для совершенствования аналитических устройств, используемых при определении широкого круга биологически активных веществ.
Наиболее часто используемыми наноструктурированными материалами в составе сенсоров являются углеродные наноматериалы и наночастицы (НЧ) металлов. К ним относятся углеродные нанотрубки (одностенные и многостенные – МУНТ), оксид графена (ГО), восстановленный оксид графена (ВГО) и наночастицы золота (НЧAu). Несколько реже для модификации поверхности сенсоров применяют наночастицы серебра (НЧAg). Такое разнообразие наноматериалов объясняется особенностями и возможностями их в плане совершенствования и придания особых свойств поверхности электродов.
Помимо углеродных наноматериалов и НЧ металлов в составе сенсоров используются и другие компоненты, в частности гиперразветвленные полиэфирополиолы (ГРПО). Преимущества их заключаются не только в самой структуре, но и в возможности применять их как стабилизаторы углеродных наноматериалов или НЧ металлов. В то же время ГРПО практически для таких целей не использовались.
Области применения наноматериалов с каждым годом только расширяются. И одно из этих направлений – развитие биосенсорных технологий, связанных с использованием модифицированных наноматериалами сенсоров в медицинских и фармацевтических целях.
В настоящее время контроль качества лекарственных препаратов осуществляют чаще всего используя различные варианты хроматографии. Однако биосенсорные технологии как альтернатива этим методам завоевывают все более прочные позиции. Особенно, если применяют биосенсоры, созданные с применением современных наноструктурированных материалов. Поэтому разработка новых ферментных электродов с использованием таких подходов является актуальной задачей.
Среди разных групп лекарственных препаратов особое место занимают антидепрессанты (АД), так как контроль за их использованием является неотъемлемой частью их применения, учитывая, что многие из них относятся к препаратам строгого учета. Определение АД становится возможным благодаря наличию эффекта ингибирования по отношению к ферменту – представителю класса оксидоредуктаз – моноаминоксидазе (МАО). В то же время примеры моноаминоксидазных биосенсоров (МАО-биосенсоров) в настоящее время очень немногочисленны и предназначены для определения биогенных аминов и до последнего времени не применялись для определения АД.
Цель работы – создание амперометрических моноаминоксидазных биосенсоров на основе печатных графитовых электродов, модифицированных наноструктурированными углеродными материалами и наночастицами металлов, для определения антидепрессантов в биологических жидкостях и в лекарственных препаратах.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
изучить способы модификации поверхности печатных графитовых электродов как основы разрабатываемых МАО-биосенсоров различными углеродными наноматериалами и НЧ металлов;
идентифицировать НЧ на поверхности первичных преобразователей различными методами;
разработать способы использования карбокси – и аминопроизводных на платформе гиперразветвленного полиэфирополиола Вoltorn второго поколения (ГРПО Вoltorn H20-COOH и Вoltorn H20-NH2) в составе биосенсоров;
сопоставить аналитические возможности разработанных амперометрических МАО-биосенсоров, модифицированных различными наноматериалами;
- разработать методики высокочувствительного определения АД, предлагаемыми МАО-
биосенсорами в лекарственных препаратах, в урине, в том числе, в присутствии
лекарственных веществ разного терапевтического действия.
Научная новизна работы заключается в том, что впервые:
- разработаны амперометрические МАО-биосенсоры на основе печатных графитовых
электродов, модифицированных наноструктурированными материалами различной природы
(МУНТ, ВГО, ГО, НЧAu, Ag, Ni, Cu), предназначенные для определения АД в сложных
органических матрицах;
- выявлены модификаторы поверхности печатных графитовых электродов (дисперсии
МУНТ, ВГО и НЧAu и Ag в хитозане, а также НЧ, полученные в режимах циклической
вольтамперометрии (ЦВА) – Au и хроноамперометрии (ХА) – Ni, обеспечивающие
наилучшие аналитические характеристики разрабатываемых МАО-биосенсоров;
ГРПО Boltorn использованы как в составе модификатора поверхности электродов (стабилизатор наноразмерного ряда углеродных материалов и НЧ металлов), так и матричного компонента в составе биочувствительного компонента;
установлены наилучшие сочетания наноструктурированного модификатора (МУНТ в хитозане / НЧAu в хитозане), стабилизатора (ГРПО Вoltorn H20-COOH) и материала матрицы (ГРПО Вoltorn H20-NH2) биочувствительного слоя биосенсоров, обеспечивающие высокочувствительное определение АД и улучшенные аналитические и операционные характеристики;
показано, что лекарственные вещества с антидепрессивным действием (имипрамин, амитриптилин, тианептин, моклобемид, флуоксетин, фабомотизол, налтрексон, феназепам, гвайфенезин) оказывают ингибирующее действие на каталитическую активность иммобилизованной МАО в составе биосенсоров: в случае биосенсоров, модифицированных МУНТ и МУНТ/НЧAu, МУНТ/НЧAg - двухпараметрически согласованное (смешанное), в случае ВГО и ВГО/НЧNi - двухпараметрически рассогласованное (бесконкурентное) ингибирование;
- разработаны способы определения АД в присутствии лекарственных веществ с
различным терапевтическим действием предложенными амперометрическими
биосенсорами.
Найденные подходы, заключающиеся в выборе способа модификации поверхности
печатных графитовых электродов за счет подбора наноструктурированного материала,
стабилизатора размера НЧ и матричного материала биочувствительной части, обеспечивают
разработку амперометрических МАО-биосенсоров с заданными аналитическими
характеристиками.
Практическая значимость. Предложены новые варианты амперометрических МАО-
биосенсоров на основе печатных графитовых электродов, модифицированных
наноматериалами (углеродными и НЧ металлов).
Разработаны и апробированы методики высокочувствительного и селективного определения АД в фармацевтических препаратах и биообъектах (урина) при минимальной пробоподготовке, в том числе, в присутствии других лекарственных препаратов, соответствующие требованиям экспрессности и точности.
Модификация поверхности электродов рассматриваемыми наноматериалами в различных сочетаниях обеспечивает более высокочувствительное определение по сравнению с немодифицированными вариантами биосенсоров.
Предложены практические рекомендации по использованию разработанных МАО -биосенсоров для контроля качества лекарственных препаратов строгого учета, позволяющие проводить лекарственный мониторинг при лечении пациентов и внедрение приемов персонализированной медицины.
На защиту выносятся:
лабораторные модели амперометрических МАО-биосенсоров на основе печатных графитовых электродов, модифицированных углеродными наноматериалами (МУНТ, ГО и ВГО) в растворах хитозана или ГРПО Вoltorn H20-COOH и Вoltorn H20-NH2 и НЧ металлов (Au, Ag, Ni, Cu), влияние модификаторов на их аналитические характеристики;
влияние сочетания НЧAg, полученных в растворе ГРПО Вoltorn H20 и Н30, или электрохимически (НЧNi, Cu) с углеродными наноматериалами (МУНТ, ГО и ВГО) в составе биосенсоров на их аналитические возможности;
условия получения биочувствительной части МАО-биосенсоров с использованием ГРПО Вoltorn Н20-NH2 для обеспечения большей величины каталитической активности иммобилизованного фермента и улучшения операционных характеристик;
кинетические параметры ферментативных реакций с участием иммобилизованной МАО в отсутствие и в присутствии некоторых АД как ингибиторов рассматриваемого фермента;
- методики количественного определения лекарственных веществ с антидепрессивным
действием в лекарственных препаратах и биологических жидкостях (урина).
Степень достоверности и апробация работы. Представленные в работе выводы и заключения получены в результате анализа большого объема экспериментального материала с применением современных физико-химических методов. Морфология рабочей поверхности электродов для биосенсоров после модификации (углеродные наноматериалы, НЧ металлов) установлена микроскопическими методами (атомно – силовой и сканирующей
электронной микроскопией – АСМ и СЭМ). Для изучения свойств модифицирующих покрытий на границах раздела фаз электрод/модификатор и электрод/раствор применяли метод спектроскопии электрохимического импеданса (СЭИ), который позволил выявить наилучшие сочетания углеродный наноматериал / НЧ металла.
Результаты исследований были доложены и обсуждены на Всероссийских и с международным участием конференциях: «Материалы и технологии XXI века» (г. Казань, 2012, 2014), «Химия под знаком Сигма: исследования, инновации, технологии» (г. Казань, 2012), «Электрохимические методы анализа - 2012» (г. Уфа, 2012), «Химия и медицина» (г. Уфа , 2013, 2015), «Менделеев 2013 - 2015» (г. Санкт-Петербург, 2013 - 2015), «Второй съезд аналитиков России» (г. Москва, 2013), «Новые химико – фармацевтические технологии» (г. Москва, 2012, 2014), «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (г. Краснодар, 2014), «Бутлеровское наследие – 2015» (г. Казань, 2015), «Химический анализ и медицина» (г. Москва, 2015).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 статей, входящих в перечень ВАК, и 17 тезисов докладов.
Личный вклад автора заключается в непосредственном участии на каждом этапе работы: от подготовки и выполнения экспериментальных исследований до обсуждения и оформления полученных результатов. Вся экспериментальная часть работы выполнена непосредственно самим соискателем.
Автор являлся исполнителем гранта Российского фонда фундаментальных исследований (грант 13-03-01101-а).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 159 страницах машинописного текста, содержит 40 таблиц и 48 рисунков. Работа состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 239 ссылок и приложения.
Наночастицы металлов Способы получения наночастиц металлов
ВГО и ГО – двумерные углеродные нанолисты. Различия между ВГО и ГО заключаются в том, что эти структуры в своем составе содержат гидроксильные группы (-OH) (для ВГО), карбонильные (-CHO), карбоксильные (-СOOH), гидроксильные (-OH) и эпоксидные (-С-O-C-) функциональные группы (для ГО). При этом у ГО преимущественно в реакциях участвуют функциональные группы, расположенные на ребрах (-CHO и -СOOH), а не в плоскости нанолиста (-OH и -С-O-C-). Это приводит к резкому различию в электропроводности наноматериалов и их способности образовывать дисперсии с различными растворителями. ВГО и ГО различаются не только функциональными группами, но и способностью диспергироваться в растворителях различной природы. ВГО образует наиболее стабильные дисперсии в неполярных и гидрофобных растворителях, ГО наоборот, в гидрофильных растворителях за счет большого количества кислородсодержащих функциональных групп [23]. ГО может образовывать стабильные дисперсии с различными органическими растворителями, например, N, N/ - диметилформамидом (ДМФА), N, N/ - диметилацетамидом и N – метил – 2 – пирролидоном [24]. По мнению авторов, также возможно диспергирование ВГО в водных растворах, например, в цетилтриметиламмоний бромиде, додецилбензилсульфонате натрия [25]. Авторы работы [26] считают, что в процессе получения дисперсий ВГО в органических растворителях для предотвращения его агломерации необходимо проводить предварительное диспегирование в смеси ДМФА – вода (9:1 по объему). При этом ВГО лучше диспергируется в ацетоне, диметилсульфоксиде (ДМСО), ацетонитриле, тетрагидрофуране, N – метил– 2 – пирролидоне и хуже в этаноле, диэтиловом эфире, толуоле.
Другие авторы считают, что N – метил– 2 – пирролидон, ДМСО и ДМФА оказывают практически одинаковый стабилизирующий эффект, лучший по сравнению с - бутиролактоном и водой [27]. Причем для повышения стабилизирующего эффекта с вышеперечисленными органическими веществами используют их сочетания с ацетоном, хлороформом, изопропанолом. В некоторых случаях такие сочетания действительно приводят к повышению стабилизирующего эффекта, однако этот эффект обычно является незначительным (увеличение примерно на 0.03 % по массе) [28].
Так как структура ВГО помимо - связей содержит и – связи, способствующие делокализации электронной плотности, то они легко взаимодействуют с органическими соединениями, что приводит к преимущественным реакциям электрофильного присоединения, чем нуклеофильного. Реакционная способность ВГО объясняется наличием дефектов в его структуре, причем наиболее способными к участию в различных реакциях являются напряженные участки [29, 30]. Для получения дисперсии ВГО в различных растворителях применяют УЗ обработку, что предовращает процессы агрегации [28].
В литературе часто ВГО называют графеновыми нанослоями (из них получаются ОУНТ) или нанопластинами (из них получаются МУНТ). Возможны одно- и многослойная (более 10 слоев) аллотропные модификации ВГО, что объясняется наличием – взаимодействия между его слоями [23].
Восстановление ГО может происходить следующими способами [31]: 1. Термическим, включающим термический отжиг, микроволновое облучение и фотовосстановление. 2. Химическим. 3. Многоступенчатым. 2. А). В качестве восстанавливающих химических реагентов используют: гидразин, NaH, NaBH4, LiAlH4, аскорбиновую кислоту, HI, гидрогуанин, пирогаллол, KOH, NaOH, NH2OH. При использовании гидридов необходимо учитывать их повышенную реакционную способность по отношению к воде. Можно отметить, что по мнению авторов работы [32], процесс восстановления ГО с помощью NaBH4 происходит более эффективно, чем при использовании гидразина. Литературные данные показывают [33], что использование NaBH4 является наиболее эффективным средством восстановления связей C = O в ГО, но не так хорошо восстанавливает эпоксидные и карбоксильные группы.
Авторы работы [34] предлагают после восстановления с помощью NaBH4 для более полного восстановления использовать дополнительный процесс дегидратации, применяя концентрированную серную кислоту (98% H2SO4) при 180 С. Одним из лучших восстановителей ГО является HI [35]. При этом данным способом можно восстанавливать ГО как в виде порошка, так и в виде дисперсии [36]. Также можно отметить, что при восстановлении HI пленка ВГО является более гибкой и прочной, чем при использовании гидразина, а также менее толстой (примерно в 10 раз). Восстановление ГО можно проводить и с помощью KOH, NaOH [37], а также с помощью NH2OH [38].
Б). Фотокаталитическое восстановление связано с протеканием фотохимических реакций с помощью фотокатализаторов. Первыми фотокатализаторами можно считать TiO2 [39]. В процессе реакции при УФ - облучении происходит разделение зарядов на поверхности частиц фотокатализатора. В присутствии этанола образуются этокси -радикалы, в результате чего электроны накапливаются внутри частиц фотокатализатора. Накопленные электроны будут взаимодействовать с листами ГО для восстановления кислородсодержащих функциональных групп. Перед восстановлением карбоксильные группы в ГО могут взаимодействовать с гидроксильными группами на поверхности TiO2 с переносом заряда, при этом может образовываться гибридная структура между НЧTiO2 и листами ГО. Полученный при этом ВГО, может быть использован в фотоэлектрических устройствах [40]. Фотокатализаторами могут выступать НЧZnO [41] и BiVO4 [42].
В). Электрохимическое восстановление ГО до пленок ВГО обычно протекает в буферном растворе при комнатной температуре. В качестве подложек могут использоваться как СУ, так и другие инертные электроды, а также электроды из оксидов In или Ti. В качестве примера можно привести получение ВГО методом ЦВА в диапазоне потенциалов от 0 до – 1 В (отн. насыщенного каломельного электрода) в 0.1 моль/л растворе KNO3. При этом авторы работы установили [43], что в процессе восстановления наблюдаются пики от электрохимически необратимого процесса при потенциале - 0.6 или - 0.87 В.
Г). Восстановление с помощью растворителей под действием температуры происходит в закрытом контейнере, так, чтобы с увеличением давления температура растворителя была выше точки его кипения [44]. В гидротермальном процессе перегретая сверхкритическая вода может играть роль восстанавливающего агента и использоваться в зеленой химии.
Хроматографические методы определения антидепрессантов
Определение трициклических АД (кломипрамина, дизипрамина, амитриптилина, имипрамина, тримипрамина) в пробах воды возможно, используя ВЭЖХ. В данном варианте использовали микроэкстракцию с помощью ионной жидкости в сочетании с микроэкстракцией на твердой фазе. При оптимальных условиях линейный диапазон определяемых концентраций 1 - 1000 мкг/л [177].
Одновременное определение амитриптилина и силденафила в крови крыс предложено проводить ВЭЖХ. Экстракцию осуществляли н-гексаном с 0.5 моль/л NaOH. Разделение проводили на колонке «XDB C-18» (размер 150 мм 4.6 мм, толщина 5 мм,) с подвижной фазой: ацетонитрил и 20 ммоль/л KH2PO4 буфер с рН 3, при скорости потока 1.5 мл/мин. Линейный диапазон концентраций 0.25 - 50 мг/мл и 0.1 - 50 мг/мл для амитриптилина и силденафила соответственно [178].
Был разработан новый, селективный и чувствительный метод ВЭЖХ с флуориметрическим окончанием для определения тианептина в плазме человека с использованием твердофазной экстракции. Метод основан на флуоресцентном определении производных тианептина с 4-хлор-7-нитробензофуразаном в боратном буферном растворе с рН 8.5. ВЭЖХ проводилась на колонке «Phenomenex C18» (размер 250 мм 4.6 мм) с использованием в качестве подвижной фазы ацетонитрила (110-2 моль/л) и ортофосфорной кислоты (рН 2.5) (соотношение 77:23). Флуориметрическое определение проводилось при 458 нм (возбуждение) и 520 нм (излучение). Линейный диапазон концентраций 5-300 нг / мл, ПрО 2 нг / мл [179].
Для определения трициклических АД (имипрамин, кломипрамин) в плазме крови человека и образцах мочи, авторами работы [180] предложен метод газовой хроматографии в сочетании с электромембранной экстракцией. Разделение осуществляли на колонке «CP-SIL 8CB» (размер 25 мм 0.32 мм, толщина 0.25 мкм). В качестве датчика использовался пламенно-ионизационный детектор. Использовали мембрану, пропитанную 2-нитрофенил октиловым эфиром. В качестве газа - носителя использовали азот при постоянном давлении 20 бар. ПрО в урине для имипрамина и кломипрамина составил 0.4 и 0.75 нг / мл соответственно.
Авторами работы [181] для определения трициклических АД (имипрамин, амитриптилин, кломипрамин, дезипрамин и нортриптилин) в человеческой моче предложен метод газовой хроматографии с масс-спектрометрическим окончанием. Разделение осуществляли на колонке «DB-5MS» (размер 30 мм 0.25 мм, толщина 0.5 мкм). В качестве газа - носителя использовали гелий. Анализы проводили при скорости потока 1.0 мл/мин. Диапазон линейных концентраций для имипрамина изменялся от 2 до 100 нг/мл. Метод характеризуется специфичностью и чувствительностью с ПрО для имипрамина 0.5 нг/мл и сн 2.0 нг/мл при соотношении сигнал / шум 3:1.
Авторами предложен метод газовой хроматографии [182] для определения АД (норфлуоксетин, флуоксетин, сертралин, пароксетин, фенлафаксин, миртразапин, оланзапин) в плазме крови человека с помощью хромато-масс-спектрометрии. В качестве подвижной фазы используется трис-буферный раствор с рН 10 и метанол. Линейный диапазон концентраций в общем плане 0.005 - 2 мг/мл. Для газовой хроматографии используется капиллярная колонка (размер 30 мкм 250 мкм, толщина 0.5 мкм). ПрО для рассматриваемых соединений в общем плане изменяется от 0.0025 до 0.05 мг/мл.
Авторами работы [183] предложено определение гвайфенезина в сыворотке крови человека проводить методом капиллярной газовой хроматографии с детектором электронного захвата. Для определения использовали колонку «Restek Rt-x5» (размер 30 мм 0.53 мм). Линейный диапазон определяемых концентраций гвайфенезина составлял 2510-9 - 10010-9 нг/мл.
Газовая хроматография с масс - спектрометрическим детектором в сочетании с экстракцией была использована для определения трициклических АД в образцах воды. Линейный диапазон определяемых концентраций от 0.5 до 500 мкг/л для амитриптилина и кломипрамина и между 1 и 500 мкг/л для тримипрамина [184].
Предложен способ одновременного определения 11 АД и 4 их метаболитов (амитриптилина, циталопрама, кломипрамина, флуоксетина, флувоксамина, мапротилина, десметил - мапротилина, миртазапина, десметил - миртазапина, нортриптилина, пароксетина, сертралина, десметил-сертралина, венлафаксина и десметил-венлафаксина) методом газовой хроматографии в образцах крови. Сочетание твердофазной экстракции с помощью производных гептафтормасляного ангидрида эффективно снижает матричный эффект и улучшает чувствительность метода. В качестве внутреннего стандарта использовали протриптилин. ПрО в общем случае оказался в интервале между 0.30 - 1.50 мкг/л. Линейный диапазон определяемых концентраций - в пределах 5.00 - 1000 мкг/л для всех аналитов [185].
Определение лекарственных препаратов проводят, используя не только хроматографические, но и другие методы. Среди них достойное место занимают спектрофотометрия [186] и хемилюминесценция [187].
Авторами работы предложен [186] спектрофотометрический метод определения тианептина с использованием различных красителей. Диапазон линейных концентраций тианептина 3.0 — 12.0 мг/мл с ПрО 1.8 мг/мл (при использовании бромофенолового голубого), 4.0 — 16.0 мг/мл с ПрО 2.0 мг/мл (при использовании бромкрезолового зеленого - БКЗ), 4.0 — 14.0 мг/мл с ПрО 2.0 мг/мл (при использовании бромтимолового синего - БТС) и 2.0 — 10.0 мг/мл с ПрО 1.0 мг/мл (при использовании метилового оранжевого).
По мнению авторов работы [188], определение имипрамина возможно спектрофотометрическим методом также с использованием красителей трифенилметанового ряда. В качестве экстрагента используется хлороформ. Применение красителей и имипрамина приводит к образованию комплексов состава 1:1, максимум поглощения наблюдался при 415 нм в зависимости от красителя. Линейный диапазон определяемых концентраций имипрамина 2.5 - 25 мг/мл (для спектрофотометрического определения с БТС) с ПрО 1.08 мг/мл, при использовании бромфенолового синего диапазон рабочих концентраций 3.0 - 25 мг/мл с ПрО 1.05 мг/мл, применение БКЗ позволяет определять имипрамин в линейном диапазоне 2.5 - 25 мг/мл с ПрО 0.72 мг/мл, использование бромкрезолового фиолетового обеспечивает диапазон линейности 2.5 – 25 мг/мл с ПрО 0.90 мг/мл.
Обнаружение имипрамина спектрофотометрическим методом возможно с использованием метода Джобса при 366 нм, который основан на взаимодействии препарата с йодом, при этом генерируются иодид-ионы. В этом случае наблюдается линейный диапазон концентраций имипрамина 2.0 - 25 мг/мл с ПрО 6.90 мг/мл. Еще один способ основан на окислении имипрамина KMnO4 в щелочной среде и последующем определении при 610 нм. В этом варианте метода линейный диапазон для имипрамина составляет 3.0 - 25 мг/мл с ПрО 3.39 мг/мл. Во всех методах используется кварцевая кювета с длиной оптического пути 10 мм.
Получение гомогената из проростков пшеницы (L -цистеиндесульфгидраза)
Наночастицы серебра, стабилизированные ГРПО Boltorn. Согласно литературным данным, НЧ получают в растворе, а затем уже используют для модификации, что и было сделано в рамках данной работы.
В ходе проведенных исследований установлено, что НЧAg, стабилизированные ГРПО Boltorn Н20 и Н30, и нанесенные на поверхность электрода, обладают электрохимической активностью, проявляющейся в виде необратимого анодного пика в области потенциалов E = 0.35 – 0.55 В (рисунок 28) [209]. Положение пика на оси потенциалов зависит от поколения ГРПО Boltorn, что, по-видимому, связано, с одной стороны, с доступностью НЧAg, стабилизированных разными поколениями ГРПО Boltorn, а с другой стороны - с различными способами их получения. Необходимо отметить, что изучение НЧAg, стабилизированных ГРПО Boltorn Н20 и Н30 в составе модификаторов поверхности электродов, для разработки МАО - биосенсоров проведено нами впервые. В ходе варьирования ГРПО Boltorn разного поколения как стабилизаторов НЧAg было установлено, что НЧAg в ГРПО Boltorn Н30 pH 10 удерживаются намного прочнее на поверхности электрода, чем НЧAg в ГРПО Boltorn Н20 pH 10. При этом наблюдается небольшое смещение потенциала пика в менее положительную область потенциалов и изменение высоты тока пика (в случае использования в качестве стабилизатора ГРПО Boltorn Н30 pH 10), что указывает на различия в размере получаемых НЧAg (подтверждено методом АСМ). При переходе от ГРПО Boltorn Н20 к Н30, согласно гистограммам распределения (рисунок 26), происходит уменьшение размера получаемых НЧAg от 25 до 18 нм соответственно, что указывает на их более высокий стабилизирующий эффект.
Модификация поверхности электродов наночастицами металлов, полученными электрохимически. Еще один способ модификации поверхности электродов, рассмотренный в рамках работы, это электрохимическое их генерирование из соответствующих растворов HAuCl4, NiSO4, CuSO4 (см. главу 3, раздел 3.3). При этом варьировали как исходную концентрацию этих солей, так и способ получения НЧ (для НЧNi).
Наночастицы золота. Установлено, что после нанесения НЧAu на поверхность печатного графитового электрода, предварительно модифицированного МУНТ, на циклической вольтамперограмме появляется пара анодно – катодных пиков при потенциалах Eа = 580 мВ и Eк = 400 мВ (рисунок 29). Модификация МУНТ позволила увеличить удельную площадь поверхности печатных графитовых электродов и тем самым увеличить количество НЧ, а также повысить электропроводность поверхности, что в дальнейшем позволило разработать более чувствительные МАО - биосенсоры, по сравнению с биосенсорами на основе электродов, модифицированных только НЧ металлов (Ni и Cu). Максимумы тока, наблюдающиеся на циклической вольтамперограмме, указывают на наличие НЧAu на поверхности электрода [193].
Наночастицы никеля. С целью уменьшения стоимости разрабатываемых биосенсоров была предпринята попытка использовать в качестве модификаторов поверхности электродов не НЧAu и Ag, а других более доступных, в частности, Ni и Cu.
При получении НЧNi в режиме ЦВА, было установлено, что при увеличении количества циклов от 1 до 10 (слоев НЧ) практически не происходит смещение потенциалов, что свидетельствует о равномерном нанесении НЧ на поверхность печатного графитового электрода (рисунок 30). Это подтверждается данными АСМ, которые указывают на то, что поверхность становится намного более шероховатой (рисунок 31) и размер НЧ, согласно гистограмме распределения, составляет преимущественно 64 нм (рисунок 32), а СЭМ изображение (рисунок 33) указывает на то, что НЧ распределены достаточно равномерно на поверхности электрода.
На рисунке 31 приведены АСМ-изображения поверхности электродов, модифицированных НЧNi в режиме топографии в 3D проекциях. Согласно АСМ-изображениям наиболее однородными по размеру получаются НЧNi, полученные в режиме ХА.
Изучение зависимости токов в пике от скорости наложения потенциала, соотношение катодных и анодных токов в пиках и положения потенциалов пиков в присутствии НЧNi, полученных методом ЦВА, показывает, что наилучшее модифицирующее покрытие электрода наблюдается при значениях скорости наложения потенциала 100 мВ/с, что следует из табличных данных (таблица 18), так как при этом не происходит значительного изменения токов в пиках и, следовательно, в дальнейшем предположительно не приведет к увеличению чувствительности МАО - биосенсора. При этом величина потенциала смещается незначительно и практически не влияет на вид вольтамперной кривой. Изменение скорости наложения потенциала от 25 до 150 мВ/с приводит к смещению потенциала анодного пика на величину Eа = 730±20 мВ и катодного пика на величину Eк = 616±3 мВ (рисунок 34) [209].
Вольтамперограммы боратного буферного раствора с pH 11 в зависимости от скорости сканирования (25 – 150 мВ/с). Печатный графитовый электрод, модифицированный ВГО/ НЧNi На процесс получения НЧNi, помимо числа циклов сканирования и скорости наложения потенциала, в первую очередь, влияет исходная концентрация прекурсора (NiSO4). При этом величина потенциала анодного пика смещается на 40 мВ, а катодного - на 10 мВ (таблица 19), что отражается на положении вольтамперной кривой на оси потенциалов. Это, в свою очередь, может отразиться на размере получаемых НЧ и в дальнейшем влиять на величину аналитического сигнала МАО – биосенсора.
Получение НЧNi в режиме хроноамперометрии. В этом случае на вольтамперограмме в диапазоне потенциалов E = 0.2 – 1.0 В при V = 50 мВ/с наблюдается анодно – катодный пик при Ea = 723±15 мВ и Eк = 616±12 мВ (рисунок 35), что может указывать на процесс получения НЧNi подобный условиям ЦВА. В то же время, согласно данным АСМ, НЧNi, полученные разными электрохимическими методами, отличаются по размеру. Согласно гистограммам распределения размер НЧNi (рисунок 32), полученных в режиме ХА меньше, чем для НЧNi, полученных в режиме ЦВА, и составляет 47 и 64 нм соответственно.
Аналитические характеристики биосенсоров на основе электродов, модифицированных оксидом графена, для определения антидепрессантов
В настоящее время в качестве лекарственных веществ с антидепрессивным действием выступают как классические трициклические АД (амитриптилин, имитриптилин, коаксил), так и соединения, относящиеся к дициклическим соединениям (флуоксетин). К современным АД, которые наиболее часто используют в настоящее время, относятся аурорикс, афобазол, ново-пассит, а также лекарственные препараты, у которых антидепрессивный эффект является сопутствующим с их основным действием (феназепам, налтрексон, сонапакс).
Амитриптилин (лекарственное вещество амитриптилин) – один из основных представителей трициклических АД. По строению отличается от имипрамина тем, что атом азота в центральной части трициклической системы заменен атомом углерода. Несовместим с другими ингибиторами МАО. Антидепрессивное действие сочетается у него с выраженным седативным, снотворным и анксиолитическим (противотревожным) эффектом, по причине сильной холинолитической и антигистаминной активности [201]. Амитриптилин представляет собой белый кристаллический порошок, хорошо растворимый в воде.
Мелипрамин (лекарственное вещество имипрамин) - один из основных представителей трициклических АД, антидепрессивное действие которого сопровождается стимулирующим эффектом. По механизму действия имипрамин представляет собой ингибитор обратного захвата моноаминов - нейромедиаторов. Это действие не является избирательным, он одновременно блокирует захват норадреналина, дофамина, серотонина и других нейромедиаторов, что приводит к их накоплению в синаптической щели и, в результате, к усилению их физиологического эффекта. Обладает также холинолитической активностью [201].
Коаксил (лекарственное вещество тианептин) - АД из группы трициклических производных, относится к ингибиторам обратного захвата нейромедиаторных моноаминов. Механизм действия «Коаксила» связывают с повышением обратного нейронального захвата серотонина нейронами коры головного мозга и гиппокампа. Повышает спонтанную активность пирамидальных клеток и увеличивает скорость их восстановления после функционального подавления. По характеру действия занимает промежуточное положение в биполярной классификации между седативными и стимулирующими АД. Улучшает настроение, купирует двигательную заторможенность, повышает общий тонус организма [201].
Афобазол (лекарственное вещество фабомотизол) - неклассический (нетрициклический) селективный анксиолитик, обратимый ингибитор МАО типа А. Он обладает нейропротективными свойствами, что делает его перспективным для применения при широком спектре психических неврологических заболеваний [201, 227]. Аурорикс (лекарственное вещество моклобемид) – неклассический (нетрициклический) АД, обратимый ингибитор МАО типа А. Тормозит метаболизм норадреналина и серотонина, что приводит к повышению их концентрации в центральной нервной системе. Он улучшает настроение и психомоторную активность, способствует ослаблению таких симптомов, как дисфория, нервное истощение, заторможенность и пониженная способность к концентрации внимания [228].
Феназепам (лекарственное вещество феназепам) - бензодиазепиновый транквилизатор (средство, оказывающее успокаивающее влияние на центральную нервную систему). По силе транквилизирующего и анксиолитического (противотревожного) действия превосходит другие транквилизаторы. При применении вместе со снотворными и наркотическими средствами происходит взаимное усиление влияния на ЦНС[229].
Ново-пассит – неклассический (нетрициклический) обратимый ингибитор МАО-А, фармакологически активными компонентами препарата «Ново-пассит» являются гвайфенезин и экстракт из лекарственных растений, оказывающий преимущественно седативное действие. Механизм действия заключается в угнетении обратного захвата серотонина и подавлении активности МАО. Успокаивающее действие экстракта сочетается с анксиолитическим и миорелаксирующим действием гвайфенезина (расслабляет гладкие мышцы) [201].
Налтрексон (лекарственное вещество налтрексон) — лекарственное средство, антагонист опиоидных рецепторов. Химически отличается от налоксона наличием в молекуле вместо аллильной группы циклического (метилциклопропильного) радикала. Фармакологически является «чистым» антагонистом опиатных рецепторов [201].
Сонапакс (лекарственное вещество тиоридазин) – антипсихотический препарат, принадлежащий к фармакологической группе нейролептиков. Представляет собой белый или желтоватый кристаллический порошок. Легко растворим в метаноле, растворим в спирте 96%, [230]. При небольших дозах сильнее проявляется стимулирующее и антидепрессивное действие, с их увеличением нарастает седативный эффект. Усиливает эффекты снотворных препаратов, анальгетиков и алкоголя, ослабляет — леводопу и фенамин; амитриптилин и противогистаминные препараты усиливают холинолитические побочные эффекты тиоридазина.
Флуоксетин (лекарственное вещество флуоксетин) - АД, избирательно (и обратимо) тормозящий обратный нейрональный захват серотонина, способствует повышению концентрации этого нейромедиатора в синаптической щели, усилению и пролонгированию его действия на постсинаптические рецепторные участки. Вместе с усилением серотонинергической передачи по механизму обратной отрицательной связи ингибирует кругооборот нейромедиатора. Мало влияет на захват норадреналина и дофамина. Применяют при разных видах депрессий (особенно сопровождающихся страхом), в том числе в случаях устойчивости к действию других АД. В присутствии других ингибиторов нейронального захвата серотонина (сертралин и иные «серотонинергические» средства), и одновременно с ингибиторами МАО (фуразолидоном, прокарбазином, селегилином) проявляется «серотонинергический» синдром [201].
В работе использовали следующие лекарственные препараты: «Амитриптилин» (производитель: «Зентива а.с.», Словацкая Республика), «Мелипрамин» (производитель: ОАО фарм. завод «Эгис», г. Будапешт, Венгрия), «Коаксил» (производитель: «Сервье Индастри», Франция), «Афобазол» (производитель: ОАО «Фармстандарт-Лексредства», г. Курск, Россия), «Аурорикс» (производитель: ООО «Ф.Хоффман-Ля Рош», Швейцария), «Феназепам» (производитель: ОАО «Валента Фармацевтика», г. Щелково, Россия), «Ново-Пассит» (производитель: «АЙВЭКС Фармасьютикалс с.р.о.», Чешская республика), «Налтрексон» (производитель: ФГУП «Московский эндокринный завод», г. Москва, Россия).
Определение лекарственных веществ в лекарственных препаратах Методика определения. Таблетку препарата, например, «Амитриптилина» растирали в ступке до однородного мелкодисперсного состояния. Добавляли небольшое количество этилового спирта (5 мл), т.к. действующее активное вещество препарата хорошо растворяется в воде и этаноле [231], и примерно 10 мл дистиллированной воды, перемешивали полученный раствор и центрифугировали 15 мин. при скорости 7000 об/мин. Получившийся прозрачный раствор переносили в мерную колбу на 25 мл. Оставшийся осадок обрабатывали 10 мл дистиллированной воды и еще раз центрифугировали при тех же условиях. Прозрачный раствор добавляли в ту же мерную колбу на 25 мл и доводили водой до метки. Пробоподготовка велась так, чтобы было возможно проводить последующие измерения биосенсорами в режиме вольтамперометрии [215]. Нужную концентрацию аналита получали путем последовательного разбавления, используя минимальное их количество.