Введение к работе
Актуальность темы. Одной из важнейших задач аналитической химии является создание чувствительных и селективных методов анализа биологически активных веществ. В связи с проблемами экологии эта задача становится еще более актуальной. Для ее решения перспективно использование аналитических реагентов нового поколения - ферментов или содержащих их биоматериалов.. Важный этап в создании аналитических систем контроля - разработка различных ферментных датчиков (биохимических сенсоров) на основе иммобилизованных ферментов, сочетающих в себе как преимущества способа детекции аналитического сигнала, t'-v: и высокую стабильность и активность работы ферментной системы. Датчики на основе иммобилизованной холиностеразы (Ж)) могут найти достойное место среди средств контроля состояния: воздуха, воды, почвы, других природных объектов, а также могут с успехом быть использованы для анализа биологических объектов и пищевых продуктов.
В последнее время ферменты все чаще используются л качестве метки антигена (АГ) или антител (AT) для контроля протекания иммунологических реакций. В данном случае они поступает прекрасной альтернативой радиоиммунным и люминесцентным меткам, являясь более безопасными и высоко чувствительными -маркерам. Применение датчиков на основе иммобилизованной холгагесгеразн (MS) в иммуноферментном-анализе (.Шк) позволило бы разработать принципиально иной вариант экспрессной имыуподиагксстккг.
Такта образом разработка способов иммобилизации ХЭ и создание на зе основе амперомэтрического ферментного электрода являегся актуальным как в теоретическом аспекте - изучение оптимальных условий работы фермента и ее количественная оценка, так и для практического использования, поскольку это исследование служит основой создания нового биохимического сенсора с практически неограниченными возможностями применения.
Цель исследования заключалась в разработке и создании биохимичест-^го сог'сора на основе ИХЭ и применение его для аналитического ::;нтрэля различных объектов, а таклз в иммуноло-гии и ветеринарии для диагностики некоторых забо-тзггший. Дчя достижения поставленной цели необходимо получить гоглазщ Т<С<Г
на основе нитрата целлюлозы (НЦ), оценить влияние рЯ, температуры, диффузии субстрата, воздействие ряда металлов, фосфор-органических соединений (ФСС) и других эффекторов на активность ИХЭ; оценить кинетические параметры ферментативной реакции, а также возможность работы ферментного электрода (S3) в проточной системе; модифицировать биосенсорную часть ФЭ с Целью использования его в ША.
Работа выполнялась в соответствии с координационным планом АН СССР по направлению 2.20.1 (разделы 2.20.2.1 и 2.20.4. 7) по теме К0- 01.86.0I06I58 и согласно приказу Государственного комитета СССР по народному образованию IP 59 от 31.01.89 г.
Научная новизна. Разработан способ иммобилизации ХЭ путем комбинированного действия глутарового альдегида и включения в пленку из НЦ. ИХЭ использована для создания амперомет-рического ШЭ. Выяснено влияние рН, температуры, диффузии субстрата к ИХЭ на каталитическую активность фермента. Обнаружено активирующее действие ионов Са(П) и других щелочных и щелочноземельных металлов,- а также активирующее действие ионов тяжелых металлов в малых концентрациях. Ингибирующее действие ряда азот-^ фосфор- и хлорсодержащих соединений на биосенсорную часть электрода использовано для определения их микроколичеств. Оценены значения кинетических параметров ферментативной реакции и их изменение в присутствии ингибиторов ХЭ. Найдены'-значения констант ингибирования и plgg для изученных ингибиторов, с помощью которых проведено сравнение ингибирую-щей способности соединений. Разработаны условия реактивации сенсорной части датчика. Описана возможность использования биосенсора в проточной системе. Разработаны новые варианты ША с использованием иммуноферментного электрода и ингибиторов ХЭ в качестве метки иммуноглобулинов. Предложены тест-системы для диагностики алеутской болезни норок.
Практическая значимость. Предложены высокочувствительные и селективные способы определения тиохолиновых эфиров, тяжелых металлов, прозерина, хлорофоса, армина и других азот-, хлор- и фосфорсодержащих ингибиторов ХЭ с помощью разработанного 3>Э. Разработан проточный ферментный реактор периодически-
го действия для анализа токсикантов в потоке. Конструкция ферментного электрода, устройство ферментного реактора, способ определения хлорофоса и прозерина, а также состав биосенсорной части иммуноферментного электрода и его использование в иммунодиагностике защищены авторскими свидетельствами. Предложена тест-система для диагностики алеутской болезни норок с помощью иммуноферментного электрода. Методика определения ингибиторов ХЭ внедрена в Казанском химическом научко-исследоват тельском институте. Методика определения 2,4-дихлорфеноксиук-сусной кислоты применяется на Республиканской санитарно-эпидемиологической станции. На защиту выносятся:
устройство ФЭ на основе разработанного способа иммобилизации ХЭ в пленку из НЦ и условия его функционирования;
возможность определения кинетических констант ферментативной реакции, константы ингибирования и РІ50 п0 вольтамперометри-
ческим данным (изменению величины тока), полученным с использованием <БЭ на основе ИХЭ;
активирующее действие ионов СаШ) и его использование для определения микроколичеств азот-, фосфор-, и хлорсодержащих ингибиторов ХЭ. Способ определения микроколичеств ионов тяжелых металлов по их активирующему действию на ИХЭ;
устройство ферментного реактора периодического действия на основе полярографической ячейки и Ш;
состав биосенсорной части иммуноферментного .электрода и экспрессный способ проведения иммунодиагностики с его помощью;
новый вариант вдгибиторного иммуноанализа с использованием конъюгата I денатурированная дезоксирибонуклеиновая кислота -фосфорорганический ингибитор X3J и состав конъюгата.
Апробация работы. Основные, результаты диссертации представлены и отражены в материалах Всесоюзной конференции "Химические сенсоры-89" (Ленинград, 1989 г.), Ш Всесоюзной конференции по электрохимическим методам анализа (Томск, 1989 г.), ffl Всесоюзной научно-технической конференции "Проблемы разработки и эксплуатации систем контроля загрязнения окружающей среды" (Казань, 1989 г.), Всесоюзной конференции "Современные
методы анализа металлов, сплавов, объектов окружающей среда" (Ижевск, 1990 г.), Всесоюзной научно-практической конференции "Химические и биологические методы в охране окружающей среды от загрязнения тяжелыми металлами" (Усть-Каменогорск, 1990 г.), Международного симпозиума по электроанализу объектов окружающей среды, биохимии и промышленности (Лохборо, Англия,1939 г.)» 32-го конгресса ИШАК (Стокгольм, Швеция, 1989 г.), конгресса по полярографии к 100-летию со дня рождения Гейровского (Прага, 435Р, 1990 г.)» открытого скандинавского симпозиума по новым достижениям в теоретической и прикладной электрохимии (Копенгаген, Дания, 1990 г.)і а также доложены на итоговой научной конференции Казанского государственного университета (Казань, 1990 г.). и секции "Методы контроля химического состава материалов" Московского Дома научно-технической пропаганды (Москва, 1990 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 работ. Кз них 4 авторских свидетельства на изобретения, 5 статей и 10 тезисов докладов на всесоюзных и международных конференциях.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста и содержит 22 рисунка (из них 3 в приложениях), 23 таблицы и список литературы из 188 найменований. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, списка литературы и 3 приложений. Первая глава посвящена обзору литературного материала, относящегося к характеристике ХЭ как биокатализатора, ее эффекторов, реактиваторов, а также характеристике ашерометрических датчиков на основе различных ферментных систем, работающих как в стационарном, так и в проточном режимах, и их использованию в Шк. Во второй главе на ос-ноер анализа литературных данных подробно формулируется задача предстоящего исследования, охарактеризованы объекты и описана техника и условия эксперимента. В третьей главе рассматри-т вается электрохимическое поведение серосодержащих субстратов ХЭ, устройство и условия работы электрохимического сенсора на основе ИХЭ. Четвертая глава посвящена различным аспектам аналитического использования предложенного ШЭ, включая влияние ионов щелочных и щелочноземельных металлов, определение тяже-
Похожие диссертации на Аналитические возможности биохимического сенсора на основе иммобилизованной холинэстеразы
