Анализ молока на содержание жира и общего белка методами оптической спектроскопии рассеяния Мелентьева Анастасия Алексеевна

Содержание к диссертации

Введение

1. Обзор литературы 11

1.1. Молоко как объект анализа 11

1.1.1. Состав молока 11

1.1.2. Молоко как полидисперсная система 13

1.1.3. Влияние различных факторов на химический состав молока 15

1.1.4. Методы определения массовой доли жира и общего белка в молоке. 17

1.2. Спектральные методы исследования молока 22

1.2.1. Основы оптической спектроскопии 22

1.2.2. Особенности анализа молока в видимой и ИК-областях спектра 25

1.2.3. Анализ молока методом спектроскопии комбинационного рассеяния 28

1.2.4. Турбидиметрия и нефелометрия 30

1.3. Математические методы обработки данных 32

1.3.1. Методы и приближения теории рассеяния 32

1.3.2. Теория представительных слоев 33

1.3.3. Хемометрика 35

1.3.3.1. Основные методы хемометрики: метод главных компонент и метод проекции на латентные структуры 36

1.3.3.2. Планирование эксперимента 40

2. Объекты исследования, методы проведения эксперимента и анализа полученных данных 46

2.1. Сбор и подготовка образцов з

2.1.1. Приготовление градуировочной серии лабораторной модели 46

2.1.2. Применение глубокой поэтапной гомогенизации образцов для исследования влияния размеров жировых глобул на спектры 50

2.1.3. Приготовление образцов для анализа молока при помощи гиперспектральных КР-изображений 51

2.1.4. Сбор образцов молока для построения глобальной модели 52

2.1.5. Сбор образцов гомогенизированного молока 55

2.2. Приборы и методы измерений 56

2.2.1. Оптическая спектроскопия в видимой и прилегающей коротковолновой области 56

2.2.2. Анализ молока при помощи цифровых изображений 58

2.2.3. Метод конфокальной микроскопии комбинационного рассеяния 60

2.3. Методы анализа данных 60

2.3.1. Изучение структуры данных 60

2.3.2. Построение градуировочных моделей 61

2.3.3. Интервальные методы отбора переменных 63

2.3.4. Обработка цифровых и КР-изображений 63

3. Качественный анализ молока методами оптическойспектроскопии 66

3.1. Использование КР-спектроскопии для изучения химического состава и коллоидной структуры молока 66

3.2. Объяснение спектральных изменений в процессе поэтапной гомогенизации молока с применением теории представительных слоев 70

Заключение к 3 главе 78

4. Количественный анализ молока на содержание жира и общего белка 79

4.1. Построение многомерных градуировочных моделей для определения жира и белка в молоке в присутствии вариабельности размеров жировых глобул 79

4.2. Построение градуировочных моделей на большом объеме исторических данных (глобальное моделирование) 90

4.3. Перенос градуировочной модели 95

4.4. Анализ гомогенизированного молока 97

Заключение к 4 главе 101

5. Разработка подходов к созданию оптической сенсорной системы для анализа молока 103

5.1. Использование сенсора на основе светодиодов в качестве альтернативы спектроскопии 103

5.2. Использование метода отбора интервалов для определения оптимальных длин волн светодиодов оптического сенсора 113

Заключение к 5 главе 118

Заключение 120

Выводы 122

Принятые сокращения и термины 123

Библиографический список

• Влияние различных факторов на химический состав молока
• Применение глубокой поэтапной гомогенизации образцов для исследования влияния размеров жировых глобул на спектры
• Объяснение спектральных изменений в процессе поэтапной гомогенизации молока с применением теории представительных слоев
• Использование метода отбора интервалов для определения оптимальных длин волн светодиодов оптического сенсора

Введение к работе

Актуальность. Молоко – продукт массового потребления с мировым
производством более 700 миллионов тонн в год, и проблема контроля его
качества является одной из наиболее актуальных для молочной

промышленности. В связи с этим определению состава молока и ежедневному
контролю его качества уделяется повышенное внимание. Содержание
питательных веществ определяет пищевую ценность продукта и,

следовательно, его стоимость. Жир и белок – основные питательные компоненты молока, содержание которых служит индикатором его качества, а также отражает состояние здоровья животных и сбалансированность их кормления. Поэтому контроль массовой доли жира и общего белка должен регулярно проводиться каждым молочным предприятием на всех стадиях производства.

Оптическая спектроскопия широко используется для контроля качества молока и молочных продуктов. Благодаря быстроте и высокой точности анализа, спектроскопия в средней инфракрасной (ИК) области (4000–400 см^-1 или 2,5–25 мкм) принимается в качестве лабораторного стандарта определения жира и общего белка в молоке для крупных молочных заводов и специализированных аналитических центров. Однако высокотехнологичная автоматизация, применяемая для проведения анализов в средней ИК-области, приводит к повышению стоимости оборудования и делает данный метод недоступным для малых предприятий. Разработка новых методов анализа молока, позволяющих производить измерения со сравнимо высокой точностью и доступных для небольших предприятий и ферм, является одной из главных целей современной молочной промышленности. Анализ в области ближнего ИК (БИК) излучения от примерно 780 до 2500 нм (0,78–2,5 мкм) может служить экономически эффективной альтернативой средней ИК-области. Однако характерные для компонентов молока полосы поглощения здесь проявляются на фоне сильно доминирующего поглощения воды и эффектов рассеяния света, что осложняет анализ и снижает его точность.

Анализ молока в диапазоне видимого света и прилегающей
коротковолновой БИК-области (Вид/КВ-БИК, 400–1100 нм) весьма

привлекателен, благодаря широкой доступности недорогих источников света, детекторов и оптики, что существенно снижает стоимость спектральных анализаторов. В то же время, анализ молока в этой области осложняется сильным эффектом рассеяния света коллоидными частицами жира и белка, более чем на два порядка преобладающим над интенсивностью их полос поглощения. Исследователи обычно пытаются устранить наблюдаемые в спектрах эффекты рассеяния с помощью математической корректировки данных, но из-за чрезвычайной слабости полос поглощения молока в Вид/КВ-

БИК этот подход не приносит желаемой точности анализа. В связи с этим, спектроскопия Вид/КВ-БИК в настоящее время практически не применяется для анализа молока и молочных продуктов, а научные публикации на эту тему очень редки. В то же время, спектрально наблюдаемое рассеяние света в области от 400 до 1100 нм несет в себе информацию как о количестве, так и о размере коллоидных частиц, которая может быть использована для количественного анализа жира и белка.

Данная диссертационная работа посвящена разработке нового подхода к
определению массовой доли жира и общего белка в натуральном или
гомогенизированном молоке. В основу метода положено извлечение

количественной информации из низкоселективных паттернов рассеяния света (зависимостей интенсивности рассеяния от длины волны) различными коллоидными частицами молока при помощи многомерного анализа наблюдаемых спектров диффузного пропускания образцов в области Вид/КВ-БИК излучения.

Цель работы: Разработка нового подхода к определению содержания жира и общего белка в молоке при помощи оптической спектроскопии в области 400–1100 нм.

В связи с поставленной целью было необходимо решить следующие задачи:

1. Изучить состав и структуру молока как коллоидной системы.

2. Изучить влияние концентраций и распределения по размерам глобул жира и мицелл белка в натуральном сыром молоке на Вид/КВ-БИК спектры и выявить возможность использования этих эффектов для количественного анализа жира и белка.

3. Разработать методику количественного анализа молока в области 400– 1100 нм. На серии лабораторных образцов проверить выполнимость анализа выбранным методом в присутствии значительной вариабельности размеров жировых глобул.

4. Построить градуировочные модели на основе большого массива исторических данных (глобальные модели) для определения содержания жира и общего белка в сыром молоке.

5. Изучить возможность реализации предложенного подхода в виде сенсорной системы на базе светодиодов; рассчитать оптимальные длины волн светодиодов в сенсоре.

6. Предложить области практического применения анализа содержания жира и белка, основанного на рассеянии света в Вид/КВ-БИК области.

Научная новизна. Доказана возможность определения массовой доли жира и общего белка в молоке методом оптической спектроскопии в области 400–1100 нм в присутствии значительной вариабельности размеров жировых глобул. Количественный анализ в этой области становится возможным

благодаря наблюдаемой по всему исследуемому диапазону разнице спектров
рассеяния коллоидными частицами жира и белка, которые различаются по
размерам и концентрации. Математической основой построения

градуировочных моделей для жира и белка является анализ многомерных данных (хемометрика), позволяющий эффективно использовать весь объем спектральной информации.

Для изучения основных закономерностей рассеяния света в молоке в присутствии частиц разных размеров были сняты Вид/КВ-БИК спектры диффузного пропускания в процессе пошаговой гомогенизации образцов. Было обнаружено, что зависимости оптической плотности от времени гомогенизации образца проходят через максимум, за которым следует резкий спад. Наблюдаемые экстремальные зависимости были объяснены с точки зрения теории представительных слоев (ТПС).

Коллоидная структура молока была впервые изучена методом
конфокальной микроскопии комбинационного рассеяния (КР) со

сканированием. Полученные гиперспектральные изображения молока были проанализированы методами многомерного анализа.

Разработаны глобальные модели для определения жира и общего белка,
охватывающие широкий диапазон изменений состава молока и учитывающие
сезонность, региональные различия между образцами различных

производителей, а также другие факторы.

Показана возможность замены спектроскопии полной Вид/КВ-БИК
области упрощенными оптическими сенсорными системами, основанными на
использовании нескольких оптимальных длин волн. Лабораторная модель
такой системы была создана с использованием 3-х светодиодов в качестве
источника света и цифрового фотоаппарата в качестве детектора. С
использованием нового интервального метода отбора переменных,

разрабатываемого в СамГТУ, рассчитана оптимальная конфигурация (число и длины волн) светодиодов, необходимых для сенсорного анализатора жира и белка в натуральном молоке.

Практическая значимость работы:

7. Предложен новый подход к определению массовой доли жира и общего белка в натуральном и гомогенизированном молоке. Анализ производится посредством оптической спектроскопии в экономически эффективной Вид/КВ-БИК области.

8. Созданы глобальные (основанные на большом наборе представительных образцов) модели для определения массовой доли жира и общего белка в сыром молоке со среднеквадратичным отклонением предсказания 0,09 % и 0,10 %, соответственно. Модели предназначены для практического использования в анализе молока.

3. Показана возможность замены полноспектрального анализатора

содержания жира и общего белка в молоке сенсорной системой, основанной на светодиодах. Использование светодиодов на оптимальных длинах волн, рассчитанных методом интервального отбора переменных, позволяет получить точность сенсора сравнимую с точностью спектрального анализатора или превышающую ее.

Результаты работы могут быть использованы как для лабораторного анализа молока, так и для обеспечения непрерывного контроля качества на производственной линии. На основе данного подхода могут быть разработаны недорогие портативные, в том числе полевые, анализаторы молока.

Положения, выносимые на защиту:

9. Новый подход к анализу жира и белка в сыром и гомогенизированном молоке, основанный на спектроскопии рассеяния в Вид/КВ-БИК области с применением методов многомерного анализа данных.

10. Регрессионные модели для количественного определения содержания жира и общего белка в сыром молоке, построенные на большом объеме представительных исторических данных.

11. Интерпретация экспериментальных зависимостей спектральных интенсивностей от размеров частиц, наблюдаемых при глубокой пошаговой гомогенизации, которые были объяснены с использованием теории представительных слоев (ТПС).

12. Оптимальная конфигурация оптического сенсора, основанного на светодиодах (число светодиодов и длины волн максимумов их спектров испускания), рассчитанная с использованием метода интервального отбора переменных, как альтернатива полноспектральному анализу жира и общего белка в сыром молоке.

Публикации и апробации работы. Материалы диссертации

опубликованы в 4-х статьях в журналах, входящих в утвержденный ВАК РФ перечень научных изданий, и 4-х тезисах докладов на международных конференциях. Результаты исследований были доложены на «VIII Winter Symposium on Chemometrics» (д. Дракино, 2012), «XIII Conference on Chemometrics in Analytical Chemistry» (г. Будапешт, Венгрия, 2012), «NIR2013 – 16^th International Conference on Near Infrared Spectroscopy» (г. Ла Гранд Мотт, Франция, 2013), «IX Winter Symposium on Chemometrics» (г. Томск, 2014), «17^th International Diffuse Reflectance Conference» (г. Чамберсбург, США, 2014).

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов исследования, методов проведения эксперимента и анализа полученных данных, трех глав с обсуждением полученных результатов, заключения, выводов, списка принятых сокращений и терминов и списка использованных источников. Работа изложена

на 134-х страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц и 45 рисунков. Библиография включает 106 источников.

Личный вклад автора. Основные экспериментальные результаты,
приведенные в диссертации, получены самим автором или при его
непосредственном участии. Автор проводил обработку, обобщение

полученных результатов и формулировал основные научные положения и выводы. Наряду с научным руководителем и соавторами, автор участвовал в написании всех имеющихся публикаций, обсуждении результатов и формулировке выводов.¹

Влияние различных факторов на химический состав молока

На качественный и количественный состав молока, а также распределение глобул жира по размерам, влияют следующие факторы: физиологические (период лактации, возраст животных), генетические (порода и индивидуальность коров), состояние здоровья животных и факторы окружающей среды (климат, рацион кормления, техники доения). Поэтому при анализе молока и построении количественных моделей для определения содержания жира и белка в молоке необходимо учитывать влияние всех вышеперечисленных факторов [1].

Период лактации является наиболее значимым фактором физиологических изменений. Различают три периода лактации: молозивный (продолжительностью 7... 10 дней после отела), период выделения нормального или зрелого молока (285...277 дней) и период отделения стародойного молока (7...15 дней перед окончанием лактации). Химический состав и свойства молока на стадии лактации при полноценных рационах кормления и нормальных условиях содержания животных изменяются незначительно. Минимальное содержание жира и белка в молоке, как правило, наблюдается в первом и втором месяцах лактации, которые характеризуются максимальным удоем. Затем по ходу лактации с понижением удоев содержание этих компонентов в молоке постепенно возрастает.

С возрастом коров изменяются как их удой, так и содержание жира в молоке. Удой коров обычно повышается до шестого отела, а затем медленно снижается. После 6-7 лактации среднее содержание жира снижается приблизительно на 0,015 % с каждым новым отелом.

Влияние породы на продуктивность животных, состав и технологические свойства молока весьма велико. Определенные различия в питательных, физико-химических и технологических свойствах молока коров разных пород объясняются тем, что для каждой породы свойственен характерный обмен веществ. Состав молока у коров разных пород значительно колеблется по содержанию отдельных компонентов, а также по отношению жира и белка.

Состояние здоровья животных значительно влияет на продуктивность и качество молока. При заболевании животных (туберкулезом, бруцеллезом, лейкозом, маститом и др.) могут резко изменяться состав, физико-химические, органолептические и технологические свойства молока. Молоко от больных коров необходимо перерабатывать отдельно. Режим и условия кормления влияют на синтез молока и, следовательно, на продуктивность животных и состав молока. Неполноценное, одностороннее кормление при недостатке (реже избытке) протеина, углеводов, минеральных веществ и витаминов приводит к резкому снижению продуктивности, изменению состава и физико-химических свойств молока. Оптимальное количество Сахаров, скармливаемых коровам в виде сочных кормов, способствует повышению удоев и увеличивает содержание жира в молоке при условии, что рацион сбалансирован по протеину и минеральным веществам [2].

Свойство вещества, зависящее от его природы и содержания в пробе, называется аналитическим сигналом. То есть аналитический сигнал характеризует исследуемое вещество качественно или количественно. В зависимости от способа регистрации аналитического сигнала все методы анализа можно разделить на химические, физико-химические и физические. В классических методах химического анализа используется прямое измерение, т.е. в качестве аналитического сигнала выступает масса или объем определяемого вещества, предварительно выделенного из смеси. Такие методы являются наиболее точными, но весьма трудоемкими и требующими высококвалифицированного персонала, и как следствие - дорогостоящими. Также химические методы не в силах справиться с объемом анализа, необходимого для практического применения на крупных предприятиях. На смену химическим все чаще приходят физические и физико-химические (инструментальные) методы анализа, основанные на зависимости физических свойств вещества от его природы, причем аналитический сигнал представляет собой величину физического свойства, функционально связанную с концентрацией или массой искомого вещества. Инструментальные методы характеризуются большими диапазонами обнаружения, селективностью и экспрессностью. Они часто используются для контроля технологических процессов в реальном времени и для полевых измерений.

В молочной промышленности используют различные инструментальные методы анализа: спектральные, электрохимические, хроматографические, реологические и др. Однако химические методы остаются актуальными и используются в качестве арбитражного (референтного) анализа для точного определения исследуемого вещества при градуировке оборудования, построении количественных моделей, а также при возникновении разногласий в оценке качества продукта.

Применение глубокой поэтапной гомогенизации образцов для исследования влияния размеров жировых глобул на спектры

Для того, чтобы сделать модель устойчивой к натуральной вариации размеров жировых глобул в молоке (см. раздел 1.1.2), к градуировочной серии была применена легкая гомогенизация с помощью ультразвукового гомогенизатора UP50H фирмы «Hielscher Ultrasonics GmbH» (г. Тельтов, Германия). Каждый образец анализировался три раза: в исходном виде и после двух последовательных 10-ти секундных гомогенизаций. Эффективность гомогенизации была оценена под микроскопом при 40-кратном увеличении (примеры изображений приведены на рис. 8). В тексте работы образцы с различными степенями гомогенизации будут называться «h0» (негомогенизированные образцы), «hi» (гомогенизация 10 с) и «h2» (гомогенизация 20 с).

Изображения, полученные под микроскопом (40-кратный объектив, масштаб обозначен прямоугольником 5x50 мкм) для образца f44 в различных степенях гомогенизации; f44h0: образец сырого молока (слева); f44hl: образец, гомогенизированный 10 с (в центре); f44h2: образец, гомогенизированный 20 с (справа). Таким образом, полный набор данных для построения лабораторных моделей состоял из 96 измерений: 32 образца в F- и Р-наборах в трех степенях гомогенизации каждый (исходный образец, и он же после гомогенизации с суммарным временем 10 и 20 с). 2.1.2. Применение глубокой поэтапной гомогенизации образцов для исследования влияния размеров жировых глобул на спектры

Для исследования влияния размеров жировых глобул на Вид/КВ-БИК спектры к четырем стандартам QSE с различным содержанием жира и белка (табл. 4), объем каждого из которых был по 20 мл, была применена глубокая пошаговая гомогенизация.

Гомогенизация образцов начиналась с 3 с; далее временные интервалы регулировались по ходу эксперимента в зависимости от наблюдаемых спектральных изменений. Эффективность гомогенизации контролировалась под оптическим микроскопом при 40-кратном увеличении. Приготовление образцов для анализа молока при помощи гиперспектральных КР-изображений

Для получения КР-спектров компонентов молока (жира, лактозы и белка) были взяты образцы с их преобладающим содержанием: образец F8 (сливки), образец МОЇ (сыворотка), и образец Е4 с высоким содержанием белка (табл. 5). В образце Е4 помимо высокой массовой доли белка наблюдались также относительно высокая массовая доля жира и лактозы.

Как известно, жир в молоке представлен в виде глобул размером от 1 до 10 мкм, белок в виде мицелл казеина (50-300 нм) и растворенных белков. Лактоза присутствует только в растворенном состоянии. Поэтому в предварительном микроскопическом исследовании образца F8 для получения единичного спектра жира лазер был сфокусирован на четко различимой большой глобуле. Аналогично точечные КР-спектры лактозы были получены для образца МОЇ с фокусировкой лазера на дисперсионной среде. Для получения точечного КР-спектра белка для образца Е4 фокус устанавливали на границу глобулы жира, где предполагается наличие белковой мембраны.

Предполагается, что точечный спектр образца F8 соответствует жиру, спектр сыворотки МОЇ преимущественно представляет лактозу. Спектр образца Е1 является спектром смеси всех компонентов, содержание белка в которой, по сравнению с другими точечными измерениями, повышено. Эти спектры будут использованы для интерпретации и анализа гиперспектральных данных, полученных сканированием образца F1.

Образцы сырого молока для построения глобальных моделей были собраны в течение одного года (с октября 2013 г. по сентябрь 2014 г.) на крупнейшем молочном заводе Самарской области «Самаралакто» ОАО «Данон-Юнимилк», г. Самара [89]. Они доставлялись на завод из 72-х молочных хозяйств Приволжского федерального округа. Преобладающие породы коров в этом регионе - черно-пестрые и симментальские; также встречаются голштинские и айрширские.

Количество представленных в модели образцов от каждого производителя варьировалось от одного до 90. Как видно из рис. 9, в анализе преобладают хозяйства, представленные малой выборкой.

Молоко доставлялось на завод в специализированных танкерах при температуре 5±1 С от 2 до 48 ч (в зависимости от месторасположения хозяйств). В основном в каждом танкере перевозилось молоко от отдельного хозяйства, однако в некоторых случаях в одном танкере находилось смешанное молоко из нескольких молочных хозяйств. После прибытия танкеров на молочный завод, образцы брались из каждого танкера (либо из различных секций одного танкера, если они отличались по составу). Молоко каждого вида при моделировании было представлено одним образцом. Кроме того, некоторые образцы были собраны из танков на производственной линии, где было смешано сырое молоко со всех хозяйств. Смешанные образцы (из молочных танкеров и танков) не были включены в гистограмму на рис. 9. Большая часть образцов была проанализирована сразу после пробоотбора (свежее молоко). Чтобы изучить влияние хранения образцов на моделирование, 208 образцов после пробоотбора были сохранены в холодильнике при температуре 5±1 С и проанализированы на следующий день через 15-24 ч (хранившееся молоко).

Таким образом, данные, собранные в модели, охватывают значительную изменчивость сезонных, генетических, географических и климатических факторов. Ожидается также, что модели учитывают специфические особенности отдельных хозяйств, такие как условия кормления, доения и содержания животных, которые могут влиять на состав молока. Широкая вариабельность состава молока подтверждена референтным анализом. Содержание жира в сыром молоке варьируется в широких пределах (см. раздел 1.1.1). В процессе доения концентрационный диапазон увеличивается и составляет от 0,3 до 10,4 % [35]. В анализируемых данных диапазон варьирования содержания жира может сужаться из-за смешения молока от нескольких коров. Чтобы расширить концентрационный диапазон по жиру, 139 образцов молока были смешаны со свежим обратом, взятым на производственной линии Самаралакто. Содержание обрата в смешанных образцах составляло от 10 до 50 %. Таким образом, диапазон концентраций по жиру составил 1,55-4,97 %, а по белку 2,27-4,25 %, что отражает вариабельность состава натурального молока.

Всего было проанализировано 1014 образцов молока. После удаления некоторых явных выбросов, вероятно связанных с ошибкой измерения, полный набор данных для моделирования по жиру состоял из 1006 образцов, а по белку из 1000 образцов молока.

Арбитражный анализ массовой доли жира и белка в исследуемых образцах проводился на ИК-спектрофотометре MilkoScan FT 120. Прибор ежедневно подвергался калибровке на заводе с помощью стандартных образцов с точно известного состава, определенного прямыми аналитическими методами: методом Гербера для жира и методом Кьельдаля для белка. Для проверки точности определения жира часть образцов параллельно с анализом на приборе MilkoScan была проанализирована методом Гербера (табл. 6).

Объяснение спектральных изменений в процессе поэтапной гомогенизации молока с применением теории представительных слоев

Для гиперспектрального микроскопического исследования был выбран образец молока F1 (табл. 5). На рис. 16 показаны спектры, полученные для данного образца до (рис. 16а) и после предварительной обработки (рис. 166). На спектрах ожидаемо присутствуют все характеристические полосы, полученные для отдельных компонентов. Кроме того, на необработанных спектрах хорошо заметна широкая полоса поглощения воды (3100-3500 см"1). На первом этапе исследования были построены псевдоцветные изображения для каждой из выбранных характеристических полос, в которых интенсивность пикселей описывалась интегральной интенсивностью спектрального пика на выбранной длине волны ± две соседние точки. Таким образом, эти изображения представляют собой карту распределения концентраций, описанных выше компонент, где интенсивность полос поглощения закодирована цветовым градиентом (от холодных оттенков к теплым). Полученные изображения (рис. 17) образца F1 на разных длинах волн были соотнесены со спектрами на рис. 15.

Наиболее сильное различие было в итоге получено для жира и лактозы. Как и предполагалось, выявить белок было затруднительно, т.к. его спектральные полосы слабые и накладываются на полосы жира и лактозы. 2000

На рис. 176 показано изображение общего распределения интенсивностей при длине волны 1309 см"1. Эта полоса наблюдается для всех спектров на рис. 15, однако наибольшая интенсивность в образце F1, где содержится больше жира. Вертикальные линии на рис. 17 отражают эффект «оптического пинцета», т.е. способность лазерного луча захватывать и перемещать микроскопические частицы (глобулы жира и мицеллы белка). В данном методе этот эффект является паразитическим.

На рис. 17а максимальная интенсивность находится в межглобульном пространстве, т.е. в дисперсионной фазе, что соответствует сделанной интерпретации полосы 1144 см"1 на спектре образца МОЇ как принадлежащей лактозе.

Полоса 2865 см"1 характерна для жира, что подтверждено литературными данными [51]. Так, на рис. 17в максимальная интенсивность приходится на глобулы жира. Сходное псевдоизображение на рис. 176 соответствует суммарному распределению питательных веществ

Для дальнейшего изучения гиперспектральной информации был применен метод кластеризации спектров с помощью алгоритма -средних [96]. Кластеризация позволяет объединить похожие спектры в группы или кластеры, а в случае гипекрспектральных изображений, также построить пространственные карты результатов кластеризации, а также средние спектры для каждого кластера. Результаты кластеризации с двумя и тремя кластерами показаны на рис. 18.

Изучение пространственного распределения группировки пикселей и средних спектров позволяет выявить области преимущественного распределения компонентов молока. Для двух кластеров происходит четкое выделение жировых глобул, что подтверждается соответствующими средними спектрами выделенных областей. Решение для трех кластеров сходно, но на границе жировых глобул наблюдается оболочка. Анализ спектров на рис. 16 и 18 позволяет интерпретировать ее как область повышенной концентрации белка (красный цвет нарис. 186).

Результаты кластеризации образца F1 (а) для к = 2 с соответствующими средними спектрами для кластеров; (б) для к = 3 с соответствующими средними спектрами для кластеров. Объяснение спектральных изменений в процессе поэтапной гомогенизации молока с применением теории представительных слоев

Мультимодальное распределение размеров коллоидных частиц (жира и белка) в молоке усложняет его количественный анализ методом спектроскопии в Вид/КВ-БИК области. Для изучения влияния размеров глобул жира на спектры диффузного пропускания был проведен следующий эксперимент. Образцы молока различного состава (табл.4, см. раздел 2.1.2) подвергались пошаговой гомогенизации с одновременной регистрацией спектров в области 400-1100 нм. Вид/КВ-БИК спектры очень чувствительны к ультразвуковой обработке. Первые шаги гомогенизации приводили к значительному росту оптической плотности. Характер спектральных изменений описывался двумя последовательно сменяющими друг друга фазами: 1) начальный рост спектральной интенсивности во всей исследуемой области при относительно слабых степенях гомогенизации (этот эффект наблюдался для всех исследуемых образцов, рис. 19) и 2) резкое падение интенсивности (рис. 19) в длинноволновой области спектра (выше 600-750 нм) при высоких степенях гомогенизации. Таким образом, оптическая плотность в длинноволновой области спектра проходила через максимум и затем падала более чем на порядок. Следует отметить, что наблюдаемое необычное поведение спектров является следствием только физических изменений в образце, при том как его химический состав остается неизменным.

Объяснение наблюдаемых эффектов было дано на основе теории представительных слоев (ТПС, см. раздел 1.3.2). На первом этапе ультразвуковая обработка разбивает большие жировые глобулы до размеров менее 1 мкм, что подтверждено наблюдениями под микроскопом (рис. 8). Предполагается, что в процессе гомогенизации размер мицелл белка (менее 200 нм) и их эффект на спектры постоянен. Первичная гомогенизация ведет к быстрому росту числа глобул жира в образцах молока. Например, одна глобула диаметром 10 мкм может быть разбита на 8 равных частиц по 5 мкм каждая, и на месте одного слоя частиц появляются два. Таким образом, увеличение спектральной интенсивности по всей области соответствует растущей плотности (штук на единицу объема) все еще относительно больших глобул жира, что описывается законами геометрического рассеяния, по которому интенсивность рассеяния не зависит от длины волны. Основная масса жира находится при этом в крупных жировых глобулах, размер которых превышает 5 мкм в диаметре. Следовательно, начальная гомогенизация, ведущая к быстрому росту частиц в образце, не вносит сильных изменений в общее распределение частиц по размерам в области малых частиц, где можно ожидать зависимость спектральных интенсивностей от длины волны. Согласно ТПС, рост числа этих, по-прежнему относительно больших, частиц увеличивает количество представительных слоев в образце, и таким образом увеличивается общее рассеяние от образца [97].

Использование метода отбора интервалов для определения оптимальных длин волн светодиодов оптического сенсора

На рис. 24 показаны спектры образцов молока, использованных для построения лабораторных моделей жира и белка (табл. 3). Выделенные спектры иллюстрируют спектральные особенности образцов различного состава. Так, образцы с высоким содержанием жира характеризуются более высоким поглощением во всей исследуемой области. В то же время, различное содержание белка преимущественно проявляется в «наклоне» спектров, т.е. в наличии зависимости интенсивности от длины волны. Влияние размеров частиц на спектры сходно с эффектом изменения концентрации жира, поскольку также ассоциируется с плотностью рассеивающих частиц в образце, однако имеет свои спектральные особенности. Методы регрессионного анализа, такие как ПЛС, позволяют, основываясь на относительно небольших спектральных отличиях в области 400-1100 нм, строить количественные модели для определения содержания жира и белка при значительной вариабельности размеров частиц.

В табл. 8 представлены результаты построения градуировочных ПЛС-моделей содержания жира и общего белка, включающие различные методы проверки. На границах исследуемой области (400-1100 нм) погрешность спектральных измерений, как известно, выше. Поэтому для анализа массовой доли жира и белка были найдены оптимальные спектральные области моделирования: 420-1035 нм и 420-1070 нм, соответственно. Такая оптимизация проводилась путем последовательного исключения отдельных переменных на каждой спектральной границе, пока СКОЇШ не достигло минимума.

Примечание: а Количество ЛП в модели; б полная и в сегментативная перекрестная проверка;г проверка с помощью тестового набора; д полный набор данных в моделях по определению содержания жира (F) или общего белка (Р); е спектры, предварительно обработанные методом МКР или ж первой производной (алгоритм Савицкого-Голая с полиномом второго порядка и шириной фильтра, равной 15); и модель F с семью выбросами; к модель Fout7 с выбранными оптимальными спектральными интервалами при помощи ИПЛС: 520-539 и 860-959 нм; л модель Р с одним выбросом;м модель Pouti с выбранными при помощи ИПЛС оптимальными спектральными интервалами: 440-459, 480-519, 560-579, 740-759, 800-819 и 900-959 нм.

В модели по жиру было обнаружено семь выбросов, три из которых наиболее критичны для эффективности модели, и только один образец может быть удален из модели для белка из-за своего необычного расположения на графике Q-остатков (аномального расстояния до модели). В табл. 8 для сравнения представлены модели, полученные на полном наборе (96 измерений) сырых или предварительно обработанных разными методами данных, а также с тремя (Fout3) и семью (F0ut7) исключенными образцами из модели по определению содержания жира или с одним исключенным из модели по определению содержания белка

Использование рассеянного света для определения массовой доли жира и белка относится к косвенному методу измерения. Поэтому особое внимание необходимо уделить проверке точности и надежности моделей. Для этой цели в исследовании применялись различные методы проверки моделей. Классическая полная перекрестная проверка (111111) описывала ситуацию, когда гипотетически новый образец был композиционно одинаков с одним или несколькими образцами из набора данных, однако отличался по распределению глобул жира по размерам, и, следовательно, по числу рассеивающих частиц. Сегментативная перекрестная проверка (СПИ), где сегментом является один образец в разных степенях гомогенизации, имитирует новый образец, который отличается от представленных в наборе содержанием питательных веществ (при этом размеры глобул жира неизвестны). Проверка с помощью тестового набора позволяет определить, зависит ли предсказание композиционно близких образцов молока от способа смешивания исходных стандартов QSE. Предполагается, что оценка моделей с помощью трех методов проверки является достаточным доказательством работоспособности метода и позволяет оценивать точность прогноза. Модели, основанные на необработанных спектральных данных, уже демонстрируют достаточно высокую точность анализа: СКО перекрестной проверки сегментами равно 0,14 % для жира и 0,04 % для белка. После удаления выбросов ошибка предсказания снижается до 0,10 % для жира, а для белка точность улучшается незначительно. Однако удаление единственного выброса в модели по определению содержания белка имеет негативный эффект при ИПЛС-моделировании (которое будет описано ниже) и искажает факторное пространство, поэтому он был тем не менее исключен.

Так как применяемый метод основан на рассеянии, использование методов предварительной обработки спектров для корректировки рассеяния, например, метода МКР или первой производной, только увеличивает ошибку прогнозирования (табл. 8). Оптимальное число ЛП одинаково для всех методов проверки и составляет в модели по жиру - 5, а по белку - 4, что следует из графика на рис. 25. Это оправданная сложность модели, учитывающая количество факторов изменчивости в данных: содержания питательных веществ (жира и белка), гомогенизации и других независимых факторов, связанных с различием исходных образцов молока. Обычно, ПЛС-модели для определения жира и белка в случае поглощения получаются сложнее: 8-10 ЛП для БИК-спектроскопии [23-25, 33-36] и 7-9 ЛП для средней ИК-области [101]. В этих случаях ЛП отвечают в основном за поглощение света компонентами молока. В отличие от ИК-анализа, Вид/КВ-БИК область менее чувствительна к компонентам, отличным от жира и белка, что дает несомненное преимущество при их определении.