Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Состояние и тенденции развития химии ароматических аминов 16
1.1. Пространственное строение и свойства молекул ароматических аминов .17
1.1.1. Пространственное строение молекул ароматических аминов в основном состоянии 18
1.1.2. Строение молекул ароматических аминов в возбужденном состоянии 21
1.1.3. Теоретическая оценка энергетических характеристик некоторых фундаментальных процессов, характерных для ароматических аминов 22
1.2. Некоторые химические свойства ароматических аминов и их предсказание на основе количественных соотношений строение-свойство 26
1.2.1. Основные свойства 26
1.2.2. Нуклеофильные свойства 30
1.3. Окислительно-восстановительные свойства ароматических аминов 32
1.3.1. Механизмы реакций окисления ароматических аминов 33
1.3.2. Свойства окисленных форм ароматических аминов 44
1.3.3. Теоретическое изучение окислительно-восстановительных реакций ароматических аминов
1.4. Биотрансформация ароматических аминов 58
1.5. Ароматические амины в аналитической химии
1.5.1. Ароматические амины в кинетических методах анализа 65
1.5.2. Ароматические амины в ферментативных методах анализа .76
1.5.3. Сенсорные системы на основе ариламинов з
ГЛАВА 2. Сульфопроизводные ароматических аминов: пространственное и электронное строение, синтез, аналитические характеристики 84
2.1. Пространственное и электронное строение молекул ди- и трифениламинов в основном состоянии 85
2.1.1. Пространственое строение ароматических аминов 86
2.1.2. Конформационный анализ реакционного центра ароматических аминов 93
2.1.3. Электронное строение ароматических аминов 96
2.1.4. Теоретическое изучение колебательных спектров ароматических аминов 103
2.2. Пространственное и электронное строение молекул ди- и трифениламинов в протонированном состоянии 106
2.3. Пространственное и электронное строение катион-радикалов ди- и трифениламинов 110
2.4. Синтез сульфопроизводных трифениламина и N-этилдифениламина 114
2.4.1. Синтез сульфопроизводных трифениламина 114
2.4.2. ИК-спектроскопическое исследование ТФА и ТФАСК 121
2.4.3. Исследование ТФА и его сульфопроизводных методами
электронной спектроскопии 123
2.4.4. Синтез N-этилдифениламин-4-сульфокислоты 125
2.4.5. ИК-спектроскопическое исследование ЭДФАСК 129
2.4.6. Исследование ЭДФАСК методом электронной спектроскопии.131
2.5. Кислотно-основные равновесия в растворах ароматических аминов 132
2.6. Формальные окислительно-восстановительные потенциалы ароматических аминов 135
2.7. Реакции окисления ТФАСК и ЭДФАСК в кислых средах, спектральные характеристики продуктов их окисления 138
2.7.1. Спектральныее характеристики продуктов окисления ТФА и его сульфопроизводных 139 2.7.2. Спектральные характеристики продукта окисления ЭДФАСК 142
2.8. Корреляционно-регрессионный анализ свойств ароматических аминов 143
2.9. Сульфопроизводные нитродифениламинов: синтез, аналитические характеристики 145
ГЛАВА 3. Реакции окисления сульфопроизводных ди- и трифениламинов в каталиметрических методах анализа металлов редкой платиновой группы 151
3.1. Каталитическое окисление ароматических аминов 152
3.1.1. Выбор индикаторных реакций и условий их проведения 152
3.1.2. Реакции каталитического окисления трифениламин-4 сульфокислоты 154
3.1.3. Влияние строения молекул ароматических аминов на скорость реакций их каталитического окисления 158
3.2. Индивидуальное определение металлов редкой платиновой группы по реакции окисления трифениламин-4-сульфокислоты 160
3.2.1. Каталитический метод определения родия(III) 160
3.2.2. Каталитический метод определения иридия(IV) 166
3.2.3. Каталитический метод определения рутения(VI) 169
3.3. Кинетические закономерности протекания реакций окисления ароматических аминов в каталиметрии иридия(IV), родия(III) и их смесей.171
3.3.1. Кинетика реакций окисления ароматических аминов периодат ионами в слабокислой среде в присутствии иридия(IV) и родия(III).. 172
3.3.2. Изучение синергетического эффекта иридия(IV) и родия(III) в индикаторных реакциях окисления МДФАСК, ДФАСК и ТФАСК периодат-ионами 177
3.4. Каталитические методы одновременного определения иридия(IV) и родия(III) 182
3.4.1. Дифференциальное кинетическое определении иридия(IV) и родия(III) методом пропорциональных уравнений 185
3.4.2. Дифференциальное кинетическое определение иридия(IV) и родия(III) методом одной точки 189
3.4.3. Методы многомерной регрессии в кинетическом определении иридия(IV) и родия(III) 192
3.4.4. Дифференциальное кинетическое определение иридия(IV) и родия(III) в образцах сложного состава 196
3.5. Реакция окисления сульфофенилантраниловой кислоты сульфатом церия(IV) в определении палладия(II) 198
ГЛАВА 4. Реакции окисления ароматических аминов в ферментативных методах анализа 207
4.1. Реакции окисления сульфопроизводных ди- и трифениламинов пероксидом водорода в присутствии пероксидазы хрена 208
4.1.1. Окисление сульфопроизводных ди- и трифениламинов пероксидом водорода в присутствии пероксидазы хрена и переходных металлов 214
4.2 Мембранные иммунофильтрационные тесты на основе реакции окисления 3,3,5,5-тетраметилбензидина пероксидом водорода в присутствии пероксидазы хрена 216
4.2.1. Иммунофильтрационное определение НТ-2 и ДОН в модельных растворах 221
4.2.2 Иммунофильтрационное определение НТ-2 и ДОН в пшенице и кукурузе 227
4.2.3 Определение ДОН и суммы Т-2 и НТ-2 токсинов в кормовом силосе 243
ГЛАВА 5. Ароматические амины в конструировании флуоресцентных проб на основе фотоиндуцированного переноса электронов 250
5.1. Квантовохимическое изучение внутримолекулярного
фотоиндуцированного переноса электронов во флуоресцентных зондах на основе 4 амино-1,8-нафтилимида и ароматических аминов 251
5.1.1. Квантовохимическое изучение внутримолекулярного фотоиндуцированного переноса электронов в молекуле HP Green 252
5.1.2. Квантовохимическое изучение внутримолекулярного фотоиндуцированного переноса электронов в молекулах на основе 4-амино-1,8-нафталимида и производных ароматических аминов 262
5.2. Флуоресцентные зонды в определении пероксида водорода 271
5.2.1. Пероксид водорода, как объект исследования 271
5.2.2. Флуоресцентный зонд HP Green в сенсорном определении пероксида водорода 274
Заключение 285
Список сокращений и условных обозначений 290
Список литературы
- Некоторые химические свойства ароматических аминов и их предсказание на основе количественных соотношений строение-свойство
- Конформационный анализ реакционного центра ароматических аминов
- Кинетика реакций окисления ароматических аминов периодат ионами в слабокислой среде в присутствии иридия(IV) и родия(III)..
- Мембранные иммунофильтрационные тесты на основе реакции окисления 3,3,5,5-тетраметилбензидина пероксидом водорода в присутствии пероксидазы хрена
Введение к работе
Актуальность проблемы. Химия ароматических аминов является одним из интересных и изученных разделов химии. Интерес к этой группе соединений обусловлен, в первую очередь, их большим практическим значением не только для аналитических целей, но и в различных областях химии и химической технологии, биологических и экологических системах. Важную роль ароматические амины играют и в развитии представлений о количественных соотношениях строение-свойство, которые являются неотъемлемой частью современных химических исследований.
В области аналитической химии моделирование поведения объектов и аналитических процессов проводится с использованием различных подходов, основанных как на эмпирических моделях, так и на основе строгих расчетных методов квантовой химии. В последнем случае существенные успехи достигнуты при изучении механизмов реакций, расчете электронно-колебательных состояний и спектров многоатомных молекул, моделировании кислотно-основных свойств, реакций комплексообразования и др. Моделирование поведения органических реагентов занимает существенное место в аналитической химии, что связано не только с их широким распространением и традиционным использованием в оптических методах анализа, но и возможностями в применении в формате тест-систем, сенсорных устройств и др. Известны примеры направленного выбора органических реагентов, их модификации и целенаправленного синтеза на основе взаимосвязи строение-свойство. В тоже время, большая часть новых методик в области спектрометрии, разрабатывается на основе первоначального назначения органических реагентов. Поиск новых систем проводится эмпирически, а методы моделирования применяются в основном для объяснения полученных данных.
В сфере моделирования поведения систем на основе ароматических аминов определённые успехи достигнуты при изучении реакционной способности, механизмов реакций, сформированы теоретические подходы к объяснению и предсказанию свойств этой группы соединений и реакций с их участием. Систематическое изучение свойств реагентов дифениламинового ряда, проведённое Л.А. Грибовым, С.П. Муштаковой, А.Н. Панкратовым и др., позволило предложить общий подход к прогнозированию молекулярных, термодинамических свойств и спектро-аналитических характеристик редокс-реагентов ряда дифениламина, а также разработать высокоэффективные методики спектрометрического определения ряда элементов на основе рационального применения соединений этой группы.
В тоже время возможности окислительно-восстановительных реакций N-замещенных ди- и трифениламинов для аналитических целей используется далеко не полностью.
Цель работы: разработка новых каталитических и ферментативных методов анализа на основе взаимосвязи строение-свойство и окислительно-востановительных реакций N-замещенных ароматических аминов.
Для достижения поставленной цели в работе необходимо было решить следующие задачи:
установить факторы влияющие на свойства и реакционную способность N-замещенных дифениламина и трифениламина в каталитических процессах окисления на основе изучения особенностей геометрического и электронного строения молекул соединений изучаемого ряда, их сульфопроизводных, прото-нированных и окисленных форм с применением методов квантовой химии;
разработать методики синтеза сульфопроизводных N-замещенных дифениламина и трифениламина (изучить влияние различных факторов и выбрать оптимальные условия синтеза), установить состав полученных продуктов, изучить основные физико-химические характеристики реагентов (кислотно-основные и окислительно-восстановительные свойства, спектральные характеристики);
провести сравнительное изучение кинетических закономерностей реакций каталитического окисления сульфопроизводных N-замещенных дифениламина и трифениламина периодат-ионами в слабокислой среде; разработать методики индивидуального и одновременного определения металлов редкой платиновой группы (иридия(IV), родия(III) и рутения(VI));
изучить реакции ферментативного окисления сульфопроизводных N-замещенных дифениламина и трифениламина пероксидом водорода в присутствии пероксидазы хрена; установить схемы протекания реакций и состава продуктов их окисления, рассмотреть возможность применения реакций для аналитических целей;
оценить возможность расширения области применения иммунофильтра-ционных мембранных тест-систем в плане снижения матричного эффекта образца с использованием для визуализации реакции окисления 3,3,5,5-тетраметилбензидина; оценить эффективность предложенных подходов при разработке методик индивидуального и одновременного иммунофильтрацион-ного тест-определения микотоксинов с визуальным наблюдением окраски продуктов реакции;
предложить новые возможности применения ароматических аминов в качестве доноров при конструировании молекул флуоресцентных проб на основе фотоиндуцированного переноса электронов с применением квантовохимиче-ского изучения их геометрического и электронного строения и установления взаимосвязи строение-свойства; разработать методику сенсорного определения пероксида водорода в объектах биологической природы.
Методы исследования. Для решения поставленных задач использовались методы квантовой химии (ab initio, DFT), электронная и ИК- спектроскопия, элементный анализ, термогравиметрия, метод потенциометрического титрования, иммунофильтрационный метод, математические методы обработки данных (методы дифференциального кинетического определения и хемометрики, корреляционно-регрессионный анализ).
Научная новизна полученных в диссертации результатов заключается в том, что:
методами квантовой химии проведено сравнительное изучение пространственного и электронного строения молекул N-замещенных дифениламина и трифениламина, их сульфопроизводных, протонированных и окисленных форм;
синтезированы новые сульфопроизводные ароматических аминов, изучены их кислотно-основные равновесия в водных растворах, оценены окислительно-восстановительные и спектральные характеристики; установлена взаимосвязь между природой заместителя в N-положении и их окислительно-восстановительными, кислотно-основными свойствами и скоростью реакций каталитического окисления;
изучена кинетика и химизм протекания каталитических окислительно-восстановительных реакций сульфопроизводных ароматических аминов в слабокислых средах в присутствии металлов редкой платиновой группы; показана взаимосвязь между природой заместителя в N-положении и аналитическими характеристиками индикаторных реакций;
на основе кинетических данных предложена схема протекания реакции окисления трифениламин-4-сульфокислоты периодатом натрия в присутствии иридия(IV), родия(III) и рутения(VI) в слабокислых средах;
показана возможность использования индикаторных реакций ароматических аминов для индивидуального и одновременного определения ионов металлов редкой платиновой группы (иридия(IV), родия(III), рутения(VI); на примере одновременного определения иридия(IV) и родия(III) изучен синергетиче-ский эффект катионов металлов и оценены возможности применения различных математических алгоритмов для разделения сигналов;
показана возможность пероксидазного окисления сульфопроизводных дифениламина, N-метилдифениламина и трифениламина пероксидом водорода, что позволяет расширить возможности их применения в аналитической химии; на основе кинетических данных предложена схема протекания реакции пероксидазного окисления трифениламин-4-сульфокислоты пероксидом водорода; обнаружена возможность стабилизации сигнала в присутствии ионов металлов редкой платиновой группы;
предложены подходы к уменьшению влияния матричного эффекта образца, расширяющие возможности иммунофильтрационных мембранных тест-систем с использованием для визуализации реакции окисления 3,3,5,5-тетраметилбензидина, реализованные на примере одновременного определения микотоксинов на одном и нескольких контрольных уровнях в сложных матрицах (пшеница, кукуруза, силос);
проведено теоретическое изучение возможности применения ароматических аминов различного строения в качестве доноров при конструировании флуоресцентных проб на основе фотоиндуцированного переноса электронов при взаимодействии с остатком 4-амино-1,8-нафталимида в качестве акцептора.
Практическая значимость работы состоит в том, что:
на примере сульфопроизводных N-замещенных дифениламина и трифениламина показана возможность управления свойствами и аналитическими характеристиками реакций варьированием природы заместителя в N-положении;
предложен подход к рациональному выбору индикаторных реакций при индивидуальном и одновременном определении аналитов близкой природы, позволяющий расширить области применения ароматических аминов в кинетических методах анализа;
на основе индикаторных реакций окисления трифениламин-4-сульфокислоты периодатом натрия в слабокислой среде разработаны высокоэффективные методики определения иридия(IV), родия(III) и рутения(VI) на уровне n10-4-п10-3 мг/л;
индикаторные реакции окисления Nметилдифениламин-4-
сульфокислоты и трифениламин-4-сульфокислоты периодатом натрия в слабокислой среде использованы для разработки методик одновременного определения иридия(IV) и родия(III) с применением методов дифференциального определения и хемометрических алгоритмов;
разработаны тест-методики с использованием иммунофильтрационного мембранного анализа для индивидуального и одновременного определения нескольких микотоксинов (дезоксиниваленола, суммы Т-2- и НТ-2-токсинов) в пшенице, кукурузе, кормовом силосе; разработаны подходы к обнаружению аналитов на нескольких контрольных уровнях с использованием иммунофиль-трационных мембранных тест-систем и к количественной оценке результатов тестов с использованием офисной техники;
обратимая реакция пероксидазного окисления флуоресцентной пробы с фотоиндуцированным переносом электронов (HP Green) использована для разработки сенсорного микропланшета для высокопроизводительного скрининга пероксида водорода на уровне 8-300 мкМ при физиологических значениях рН, апробированного при анализе питательной клеточной среды.
На защиту выносятся:
результаты теоретического изучения пространственного и электронного строения N-замещенных дифениламина и трифениламина; подходы к разработке индикаторных и ферментативных систем на основе изучения геометрических и электронных характеристик реагентов;
результаты по синтезу и определению основных физико-химических характеристик сульфопроизводных N-замещенных дифениламина и трифениламина (кислотно-основные, окислительно-восстановительные и спектральные характеристик); кинетические закономерности и схема протекания реакций окисления трифениламин-4-сульфокислоты периодатом натрия в слабокислых средах в присутствии металлов редкой платиновой группы;
методики индивидуального и одновременного кинетического определения металлов редкой платиновой группы (иридия(IV), родия(III) и рутения(VI)) в модельных растворах и платиновых концентратах;
закономерности протекания ферментативного окисления N-замещенных сульфопроизводных дифениламинов пероксидом водорода в присутствии пе-роксидазы хрена;
подходы к расширению возможностей применения иммунофильтрацион-ных мембранных тест-систем с использованием для визуализации реакции
окисления тетраметилбензидина; методики индивидуального и одновременного тест-определения ряда микотоксинов методом мембранного иммунофермент-ного анализа на одном и двух контрольных уровнях в матрицах сложного состава (пшенице, кукурузе, силосе);
результаты теоретического изучения возможности применения ароматических аминов в качестве доноров при конструировании флуоресцентных зондов на основе фотоиндуцированного переноса электронов; методика определения пероксида водорода при физиологических значениях рН в формате сенсорного микропланшета на основе обратимой реакции пероксидазного окисления флуоресцентной пробы HP Green.
Апробация работы: результаты исследований доложены на международных и российских конференциях и изложены в материалах: Международных конгрессов по аналитической химии (Москва, 1997, 2006), Международной конференции "Analytical Chemistry and Chemical Analysis" (Киев, 2005), Международном форуме "Аналитика и аналитики" (Воронеж, 2003), Международном симпозиуме «Физика и биофотоника -II» (Саратов, 2014), Менделеевских съездов по общей и прикладной химии (Москва, 1998, 2007), VII Всероссийской конференции «Органические реагенты в аналитической химии» (Саратов, 1999), Всероссийской конференции «Актуальные проблемы аналитической химии» (Москва, 2002), II Съезде аналитиков России (Москва, 2013), Всероссийских конференций "Аналитика России" (Москва, 2004, Краснодар, 2007), Всероссийской конференции "Химический анализ" (Москва, 2008), VII конференции "Аналитика Сибири и Дальнего Востока" (Новосибирск, 2004), Всероссийской конференции “Проблемы аналитической химии” (III Черкесовские чтения, Саратов, 2002); школе-конференции “Молекулярное моделирование в химии, биологии и медицине” (Саратов, 2004), Всероссийской школе-конференции «Химия биологически активных веществ» молодых учёных, аспирантов и студентов с международным участием «ХимБиоАктив-2012» (Саратов, 2012).
Публикации. По результатам диссертации опубликовано 34 научных статьи в журналах и сборниках, в том числе 21 статья в журналах, входящих в перечень ВАК, более 40 тезисов докладов на Международных и Всероссийских конференциях.
Личный вклад автора состоит в постановке основных целей и задач, анализе данных литературы, непосредственном участии в выполнении экспериментальных исследований, обработке, обобщении и систематизации полученных результатов и формулировке выводов. Результаты экспериментальных исследований и теоретических обобщений изложены в публикациях и научных докладах, выполненных в соавторстве.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, списка литературы и приложений. Работа изложена на 322 страницах, содержит 81 таблицу, 84 рисунка, список литературы из 404 наименований.
Некоторые химические свойства ароматических аминов и их предсказание на основе количественных соотношений строение-свойство
Изучение пространственного строения молекул ариламинов широко обсуждается в литературе и проводится как на основе экспериментальных данных, так и с привлечением компьютерных методов различного уровня сложности. Следует отметить, что современные методы исследования и квантовохимические расчеты позволили уточнить, а в ряде случаев изменить представления о геометрических и электронных характеристиках молекул ароматических аминов, их производных, реакционных интермедиатов и продуктов. Первостепенное внимание при анализе строения ароматических аминов уделяется внутримолекулярному переносу заряда, степени пирамидальности аминогруппы и роли внутримолекулярных взаимодействий в упаковке молекул [8-10].
Данные экспериментальных исследований строения моноариламинов в кристаллическом состоянии и в газовой фазе суммированы в монографии [7]. Родоначальник ряда (анилин) в основном состоянии имеет непланарное строение (точечная группа симметрии Сs) и пирамидальную форму аминогруппы. Заместители нарушают пирамидальность аминогруппы и искажают геометрические характеристики бензольного кольца. Статистическая обработка геометрических характеристик 300 тыс. молекулярных структур моноариламинов позволила установить закономерности в значениях длин связей и валентных углов кольца и аминогруппы, связанные с природой и положением заместителей [7]. Исследование кристаллической структуры незамещенного дифениламина (ДФА) [11] показывает, что элементарная ячейка содержит 8 независимых асимметричных молекул, у которых валентные углы CNC изменяются в области 127.3-130.20, сумма углов у атома азота 3590, торсионные углы вокруг связей N-C составляют -43.50 и 1770, длины связей Сunco-С в фенильных фрагментах увеличены (1.395 ), а угол ССuncoС 118.60. В газовой фазе молекула ДФА согласно данным электронографии [12] характеризуется торсионными углами вокруг связей N-C -45.60 и 173.40, валентными углами CNC 123.90, длина связи N-C составляет 1.417 . Сумма валентных углов у атома азота равна 3530, что соответствует уплощенной пирамидальной координации атома азота. Эффективная конформация ДФА в кристаллической и газовой фазах описывается моделью С2.
Строение трифениламина (ТФА) изучено Наумовым В.А. и сотр. [13] методом газовой электронографии. Установлено, что молекула ТФА имеет С3 симметрию. Основные геометрические параметры: торсионные углы вокруг связей N-C -38.90 и -45.60, валентные углы CNC 119.90, длина связи N-C 1.42 , фенильные группы повернуты на 480 от положения, в котором ось симметрии С3 лежит в плоскости фенильного кольца. В кристалле остов ТФА имеет практически плоское строение [14]. Большинство геометрических параметров в кристаллической и газовой фазе близки, а отличие в длине связи N-C (1.38 в кристалле) может объясняться особенностями кристаллического состояния и различием типов структуры, находимых с помощью методов газовой электронографии и рентгеноструктурного анализа.
Сравнение экспериментальных геометрических параметров анилина, ДФА и ТФА [13] показывает, что длина связи C-N близки в молекулах ди- и трифениламинов, но заметно больше чем в анилине (1.40 ), что объясняется более высокой степенью nтг-сопряжения неподелённой электронной пары (НЭП) атома азота с тг-системой фенильного кольца молекулы анилина.
На примере анилина показано [7], что геометрические параметры бензольного кольца хорошо описываются ab-initio расчетами на различных уровнях теории. В тоже время описание неплоского строения фениламина (торсионного угла между плоскостями аминогруппы и бензольного кольца) существенно зависит от метода расчета (Приложение А, таблица А1). Наибольшее согласие с экспериментальными данными дает использование метода теории функционала плотности (DFT) в варианте B3LYP. Энергетические барьеры внутреннего вращения атома азота ( 6-7 кДж/моль) и аминогруппы ( 20-25 кДж/моль) относительно связи C-N хорошо описываются методами молекулярных орбиталей с использованием теорий возмущения Мёллера - Плесс второго порядка МР-2 и связанных кластеров (CCSD(T)) с базисным набором 6311++G(d,p) [7].
Расчет геометрических параметров ДФА проведен рядом полуэмпирических [15-19] и неэмпирических методов [12, 18, 20]. Возможность свободного вращения фенильных колец и низкий барьер вращения относительно атома азота в молекуле ДФА являются причиной различий в результатах, приводимых разными авторами. В работе [18] показана зависимость полученных геометрических характеристик ДФА от уровня теории и базисного набора; методом B3LYP с базисами 6-31++ Эd p) и сс-рVDZ проведён расчёт геометрии и частот колебаний для различных конформаций ДФА, продемонстрировавший хорошее совпадение с экспериментальными данными. Конформационный анализ ДФА на уровнях МР2/6-ЗКЗd ) и HF/6-ЗКЗd ) показал, что низкий барьер вращения (7.76 ккал/моль) и высокая константа скорости ( 1014 М с"1) свидетельствуют о свободном вращении фенильных колец относительно связи С-N [20].
Квантовохимический расчет геометрических характеристик (HF/6-ЗКЗd [21], B3LYP/6-31G(d p) и B3LYP/aug-cc-pVDZ [22]) показывает пропеллерообразное строение молекулы ТФА, что хорошо согласуется с экспериментальными данными [14]. Эквивалентность фенильных колец и планарность атома азота в молекуле ТФА приводит к максимальному орбитальному перекрыванию с тг-системой. Хорошее совпадение между теоретическими и экспериментальными ИК-спектрами ТФА также свидетельствует о правильности расчета [22].
Авторами [13] отмечается, что метод HF/6-31G(d) хуже предсказывает длины связей и торсионные углы ССNC по сравнению с методом DFT в приближении B3LYP с базисами 631++G(d,p) и aug-сс-рVDZ [22], в тоже время валентные углы, полученные разными методами, совпадают. Подробное обсуждение влияния нитро- и метокси-групп, способных к резонансному взаимодействию с тг-системой, на геометрию ТФА остова представлено в работе [21]; в ней же показана возможность предсказания окислительно-восстановительных потенциалов замещенных ТФА на основе рассчитанных потенциалов ионизации.
Конформационная подвижность ТФА изучена в работе [22]. Показано, что глобальному минимуму на поверхности потенциальной энергии отвечает D3 группа симметрии. Детальное исследование перехода между локальными минимумами энергии позволило выявить несколько переходных состояний с разными точечными группами симметрии и показало, что переходы должны преимущественно осуществляться через канал, где два фенильных кольца вращаются в одном, а третье - в противоположном направлениях.
Конформационный анализ реакционного центра ароматических аминов
Пространственное строение ароматических аминов Первым этапом исследования явилось изучение геометрических характеристик молекул в основном состоянии. Исходная геометрия задавалась с учетом данных газовой электронографии для ДФА (угол С-N-С 123-125, двугранными углами вокруг связей N-C -45 и 173 [12]) и ТФА (угол С-N-С -120, двугранный угол между кольцами (-39)-(-45)) [13]. В литературе не найдены данные рентгеноструктурного анализа (РСА) для МДФА и ЭДФА, в связи с этим исходная геометрия задавалась согласно данным квантовохимического расчета [30]. Поиск равновесной геометрии молекул проводился методом последовательных приближений (МПП) МР2/6-31G(d,p)//RHF/6-31G(d) [276], который заключается в замене одного сложного приближения, на ряд последовательно усложняющихся связанных расчетов. Метод RHF/6-31G(d) позволяет достаточно быстро локализовать экстремум близкий к результатам прямого расчета. Последующий расчет в приближении MP2/6-31G( ), в котором при нахождении электронной корреляции учитываются только валентные электроны, хорошо воспроизводит равновесную геометрию на уровне данных рентгеноструктурного анализа, что подтверждается значительным количеством работ. Таким образом МПП позволил локализовать те же экстремумы на поверхности потенциальной энергии, что и прямой расчет, но со значительно меньшими затратами времени на вычисления.
Исходную геометрию сульфопроизводных ароматических аминов задавали с учетом полученной геометрии конформеров аминов и сульфогруппы на основе расчета молекулы анилин-4-сульфоновой кислоты методом МР2/6-31G( )//RHF/6-31G( ). Первоначальную оптимизацию сульфопроизводных ароматических аминов проводили полуэмпирическим методом RM1, которую уточняли методом МР2/6-31G( )//RHF/6-31G( ). Отсутствие отрицательных значений в Гессиане использовали для подтверждения отнесения полученных структур к равновесным конформерам.
Расчет геометрии молекул изучаемого ряда ароматических аминов с использованием одного метода дает основание для корректного сравнения полученных результатов. Неэмпирические расчеты проводились в программном пакете Firefly 8.0 [277] на вычислительном кластере СГУ. Для визуализации результатов использовали программы ChemCraft (1.8) [278] и Hyperchem (1.7).
Пространственное строение и нумерация атомов в молекулах исследованных ароматических аминов приведены на рисунке 5. Нумерация атомов в молекулах сульфопроизводных ароматических аминов совпадает с исходными соединениями, сульфогруппа связана с атомом С4.
Строение аминогруппы в молекулах ди- и трифениламинов отражает компромисс между планарной конфигурацией более выгодной для максимального взаимодействия тг-электронов фенильных колец с НЭП атома азота и пирамидальной конфигурацией позволяющей уменьшить пространственное отталкивание между заместителями у атома азота и его НЭП. В таблице 12 приведены геометрические параметры, позволяющие сравнить степень непланарности аминогрупп в исследуемых соединениях.
Длины связей Сдг-N в молекуле ДФА близки к связям в анилине (1.39-1.40 ), и несколько больше в молекулах третичных ароматических аминов. Эти значения занимают промежуточное положение между соответствующими характеристиками в триметиламине (1.47 ) и азотсодержащих гетероциклах (1.34-1.35 ). Таким образом, уменьшение длины СAr-N в ряду МДФА ЭДФА ТФА ДФА отражает увеличение вклада л-сопряжения между НЭП атома азота и фенильными кольцами в этом ряду. Введение сульфогруппы приводит к незначительному уменьшению длины связи СAr-N со стороны фенильного кольца с сульфогруппой. Таблица 12 - Геометрические параметры молекул ароматических аминов, характеризующие пирамидальность аминогруппы
Уменьшение валентного угла СдЖдг в ряду ДФА ТФА ЭДФА МДФА, в целом, свидетельствует об увеличении вклада пространственного отталкивания между заместителями у атома азота и его НЭП в молекулах третичных аминов. Исключение составляет высокосимметричная (С3) плоская молекула ТФА, для которой пространственное отталкивание трех объемных фенильных заместителей отражается в большей длине связей Сдг-N и пропеллеобразном расположении фенильных колец. Для сульфозамещенных ароматических аминов наблюдается незначительное увеличение угла CAINCAT у всех изучаемых ариламинов.
Кинетика реакций окисления ароматических аминов периодат ионами в слабокислой среде в присутствии иридия(IV) и родия(III)..
Синтез и очистка натриевой соли N-этилдифениламин-4-сульфокислоты. В круглодонную трехгорлую колбу (500 мл), последовательно вносили диэтилсульфат (49 г) и ДФА (50 г). Реакционную массу перемешивали и нагревали на воздушной бане до достижения заданной температуры и выдерживали в течение одного-двух часов. Для выделения ЭДФАСК использовали свежеприготовленный этилат натрия, приготовленный растворением металлического натрия в этиловом спирте (2.5 масс. %), который добавляли небольшими порциями в горячую реакционную среду и наблюдали выпадение белого объемного осадка натриевой соли ЭДФАСК. Охлажденная реакционная масса выдерживалась при 780С в течение одного часа. Осадок выделяли из горячей реакционной смеси фильтрованием на фильтре Шотта (пор40), осадок многократно промывали небольшими порциями диэтилового эфира для удаления ЭДФА. Полученный сырой продукт растворяли при нагревании в воде (200 мл), раствор охлаждали.
Для удаления из раствора остатков ДФА и ЭДФА, последние экстрагировали диэтиловым эфиром (50 мл). Водную фазу собирали и упаривали до 80 мл. Натриевую соль ЭДФАСК осаждали из водного раствора добавлением раствора NaOH (20 масс. %, 20 мл). Белые перламутровые кристаллы соли осаждались из щелочного раствора в течение 12-15 час. Осадок отфильтровывали, сушили и перекристаллизовывали из спирта. С этой целью осадок растворяли в избытке воды (1:4) при нагревании, добавляли избыток этилового спирта и полученный раствор нагревали до кипения при интенсивном перемешивании. При этих условиях загрязнители (сопутствующие соли сульфокислот) выпадают в осадок, а натриевая соль ЭДФАСК остается в растворе. Раствор фильтровали и упаривали в фарфоровой чашке до начала образования кристаллов. При охлаждении из раствора кристаллизуется продукт с высоким содержанием натриевой соли ЭДФАСК. Вещество сушили при 800С до постоянной массы.
Условия проведения синтеза и соответствующие выходы целевого продукта ЭДФАСК представлены в таблице 24. Согласно полученным данным оптимальными условиями является температура 140оС; время реакции 2 часа.
Использование натриевой соли ЭДФАСК в исследовательских целях подразумевает наличие продукта с содержанием данного вещества не ниже 90%. Однако, продукты, получаемые в процессе синтеза по указанной методике, не отвечают этому условию (содержание ЭДФАСК не превышает 50%). Предполагается, что основным загрязнителем является натриевая соль этилсерной кислоты, которая может образоваться при взаимодействии раствора этилата натрия с остатками непрореагировавшего диэтилсульфата. Образование этилсульфоната натрия в подобных условиях описано в [284]. В связи с этим нами разработана методика очистки натриевой соли ЭДФАСК от загрязнителей, которыми потенциально являются сульфат натрия, этилсульфонат натрия и натриевая соль ДФАСК. Метод основан на значительной растворимости натриевой соли ЭДФАСК в этиловом (или изопропиловом) спирте и аномально высокой растворимости бариевой соли ЭДФАСК в воде.
Очистка натриевой соли ЭДФАСК. Натриевую соль ЭДФАСК ( 20 г) растворяли в воде (80 мл) при постепенном нагревании до 800С. Затем при интенсивном перемешивании порциями добавляли раствор BaCl2 (30 масс. %) до полного осаждения с дальнейшей кристаллизацией в течение 24 час. Кристаллы отделяли методом фильтрования, промывали водой (50 мл), фильтрат нагревали до 600С и добавляли при интенсивном перемешивании раствор Na2CO3 (10%). Образование осадка происходило в течение нескольких часов. Полученный раствор упаривали до влажных солей, сушили до постоянной массы. Полученный продукт содержал натриевую соль ЭДФАСК, NaCl, Na2CO3. Натриевую соль ЭДФАСК выделяли перекристаллизацией из спирта: продукт растворяли при нагревании в воде (20 мл), добавляли этанол (100 мл), доводили до кипения, затем добавляли следующую порцию этанола (100 мл). После охлаждения раствор отфильтровывали от NaCl и Na2CO3, а фильтрат упаривали до начала кристаллизации. Кристаллы сушили при 800С до постоянной массы. Выход ЭДФАСК на стадии очистки составляет 93 %. Полученный продукт исследован методами термогравиметрии, элементного анализа, электронной и ИК-спектроскопии. Термогравиметрический анализ ЭДФАСК. Согласно данным термогравиметрического анализа натриевой соли ЭДФАСК, ее термолиз является сложным процессом, включающим стадии дегидратации и разложения, сопровождающиеся горением (таблица 25, рисунок 23). В области температур 90-2100С протекает дегидратация продукта, отмеченная эндотермическим эффектом на кривой ДТА и убылью массы 2 % по кривой ТГ, что не согласуется с расчетом для одноводного кристаллогидрата, соответствующей 5.7%. Следовательно эффект соответствует испарению адсорбционной воды. Разложение вещества наблюдается с 2100С до 6500С и сопровождается эндо- и экзотермическими эффектами на кривой ДТА и 73%-ной убылью массы по кривой ТГ. При дальнейшем нагревании до 9000С тепловых эффектов и значительного изменения массы не наблюдается. Конечным продуктом термолиза натриевой соли ЭДФАСК является Na2SO4, что подтверждено качественной реакцией на ионы SO42-.
Мембранные иммунофильтрационные тесты на основе реакции окисления 3,3,5,5-тетраметилбензидина пероксидом водорода в присутствии пероксидазы хрена
В настоящее время одной из важнейших задач аналитической химии является разработка простых и доступных широкому кругу потребителей методик, позволяющих осуществлять контроль качества окружающей среды, продуктов питания и кормов. В этом направлении большое внимание уделяется проблеме микотоксинов, что обусловлено чрезвычайно широким распространением их продуцентов в природе и возможностью контаминирования продукты растительного и животного происхождения на различных этапах выращивания, переработки, транспортирования и хранения в производственных и домашних условиях. Размножаясь на пищевых продуктах, многие плесневые грибы не только загрязняют их микотоксинами, но и ухудшают органолептические свойства, снижают пищевую ценность, приводят к порче и непригодности для технологической переработки, а использование в животноводстве кормов, пораженных плесневыми грибами, является причиной заболеваний и гибели животных и птицы, а также опасно для человека при попадании через систему пищевых цепей [333, 334]. В настоящее время в России [335, 336] и в странах Евросоюза [337, 338] введены законодательно установленные уровни предельно допустимого содержания микотоксинов в продуктах питания и кормах для животных. Классификация, основные свойства отдельных групп микотоксинов и возможности иммунохимических методов, применяемые для их анализа, рассмотрены в обзорах [339-341]. Показано, что высокой чувствительностью, селективностью и возможностью реализации вне лаборатории характеризуются иммунохимические методы, реализуемые в форматах твердофазного иммуноферментного анализа, иммунохроматогра фических тестов и иммунофильтрационных тестов, которые успешно применяются для индивидуального тест-определения целого ряда микотоксинов. Возможности тест-определения в форматах мембранного и колоночного иммунофильтрационного иммуноанализа по сравнению с традиционным твердофазным иммуноанализом рассмотрены нами на примере определения зеараленона в экстракте пшеницы [342].
В то же время интерес представляет разработка методик их одновременного определения, что связано с вероятным присутствием нескольких микотоксинов в природных матрицах. Примером успешного применения колоночного теста к одновременному определению двух аналитов является предложенная нами методика иммунохимического определения зеараленона и Т-2 токсина в кормах [343].
Широкие возможности в плане одновременного определения нескольких аналитов представляют мембранные иммунофильтрационные тесты, позволяющие иммобилизовать специфические антитела на отдельных зонах мембраны. Однако их применение для сложных объектов анализа ограничено высоким матричным фоном. Причинами матричного эффекта являются адсорбция экстрагируемых из образца веществ белковой природы на поверхности мембраны, что приводит к неспецифическому окислению компонента субстрата и возникновению окраски по всей площади рабочей зоны, и неспецифическая сорбция конъюгатов ПХ на поверхности мембраны [344].
Актуальным является поиск подходов к снижению фонового сигнала и одновременному определению нескольких аналитов с использованием иммунофильтрационных тестов. Одним из подходов к решению этой задачи является применение щелочной фосфатазы в качестве ферментной метки, что позволило увеличить чувствительность и стабильность тест-систем [344]. Этот подход использован нами при разработке иммунофильтрационного мембранного тест-метода для одновременного определения двух (зеараленон и охратоксин А) и трех (зеараленон, охратоксин А и фумонизин В1) микотоксинов в пшенице, кукурузе и силосе [345-347]. Метод позволяет сделать вывод о наличии (отсутствии) микотоксинов на уровне 50 % от законодательно установленного в ЕС предельно допустимого содержания, "правильность" тест-определения микотоксинов составляет не менее 95%. Впервые разработан подход для определения микотоксинов в зерновых продуктах питания на двух контрольных уровнях, который позволяет делать вывод о содержании аналита не только в режиме «да/нет», но и в определенном диапазоне концентраций (0 – 0.5 ПДК – 2 ПДК).
Другим направлением расширения области применения иммунофильтрационного метода для одновременного определения микотоксинов в сложных матрицах является модификация реакции окисления ТМБ пероксидом водорода в присутствии ПХ, которая широко применяется в иммунохимических методах анализа, в том числе и в иммунофильтрационных тестах [348, 349]. Интерес к применению данной системы обусловлен наличием ряда коммерчески доступных субстратов ПХ и конъюгатов аналит-ПХ, что позволяет снизить стоимость анализа и повысить его воспроизводимость. Однако значительный матричный эффект препятствует применению данной реакции в формате мембранного иммунофильтрационного тест-метода при анализе сложных матриц (кукуруза, корма, сыр, перец, какао, пиво и т.д.). В работе проведен поиск путей снижения матричного эффекта при использовании реакции окисления ТМБ пероксидом водорода в присутствии ПХ в иммунофильтрационных тестах. Исследования проводили на примере тест-определения микотоксинов трихотеценовой группы - дезоксиниваленола (ДОН) и НТ-2/Т-2 токсинов (НТ-2/Т-2), являющихся широко распространенными природными загрязнителями продуктов питания и кормов для животных.
Материалы и реагенты. Растворы ДОН и НТ2 (1 мг/мл) готовили растворением стандартных образцов (Sigma-Aldrich) в метаноле и хранили при -180С; рабочие растворы готовили непосредственно перед применением разбавлением в фосфатно-солевом буферном растворе (ФБ). Кроличьи антимышиные антитела (IgG, 2.5 г/л, Dako, Belgium); моноклональные антитела, специфичные к НТ2 (анти-НТ2, 1.4 г/л) и ДОН (анти-ДОН, 1.5 г/л) любезно предоставлены проф. К. Эллиоттом, Великобритания [350, 351]. В работе использованы конъюгаты ДОН и НТ2 с ПХ (ДОН-ПХ и НТ2-ПХ) (Euro-Diagnostica, Нидерланды) и коммерческий субстрат Colorburst TM Blue TMB/Peroxide, USA для ПХ. В качестве носителей иммунореагентов применяли полимерные нейлоновые мембраны Immunodyne ABC (0.45 мкм, Франция).
Растворы полимеров: полиэтиленгликоля 6000 (ПЭГ, “Federa”, Бельгия), карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ, 50 кДа, Sigma-Aldrich), полиэтиленполиаминов (ПЭПА, ООО "Окахим"), хитозана ( 90 кДа и 200 кДа, Sigma-Aldrich), декстран сульфата (ДС, 5 кДа, Sigma-Aldrich) – готовили растворением их навесок в бидистиллированной воде (ПЭГ, ДС), в ацетатных буферных растворах с рН 4.0 (ПЭПА и хитозан), в горячей бидистиллированной воде (КМЦ).