Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Общая характеристика строения ДНК и специфических взаимодействий ДНК 12
1.2. Повреждение ДНК 15
1.3. Электрохимические исследования ДНК 17
1.4. Основные способы иммобилизации ДНК на поверхности электрода 19
1.5. Определение лекарственных препаратов, взаимодействующих с ДНК 27
1.6. ДНК-сенсоры для регистрации окислительного повреждения ДНК 29
1.7. Электрополимеризованные материалы в составе биосенсоров 33
1.8. ДНК-сенсоры на основе электропроводящих полимеров 38
1.9. ДНК-сенсоры на основе полифеназинов и полифенотиазинов 46
2. Экспериментальная часть 52
2.1. Материалы и реагенты 52
2.2. Приборы и оборудование 53
2.3. Приготовление рабочих растворов 55
2.4. Методики экспериментов 57
3. Результаты и их обсуждение 64
3.1. Пьезометрический ДНК-сенсор на основе полианилина 64
3.1.1. Электрополимеризация анилина. Иммобилизация ДНК 64
3.1.2. Отклик ДНК-сенсора на основе полианилина на доксорубицин и АФК 67
3.2. Вольтамперометрический ДНК-сенсор на основе полимеризованных материалов 73
3.2.1. Модификация электродов электрохимически активными полимерными материалами 73
3.2.2. Выбор способа иммобилизации биокомпонента в слое электрохимически активного полимера 81
3.2.3. Установление природы влияния нативной ДНК на сигнал сенсора и оптимизация условий действия повреждающих агентов 84
3.2.4. Влияние окисленной ДНК на сигнал сенсоров 89
3.2.5. Влияние антиоксидантов на окислительное повреждение ДНК 98
3.3. Импедиметрический ДНК-сенсор 102
3.3.1. Выбор условий формирования чувствительного слоя ДНК-сенсора 102
3.3.2. Влияние окисления ДНК на характеристики биочувствительного слоя 108
3.3.3. Влияние состава поверхностного слоя на сигнал ДНК-сенсора 113
3.3.4. Изучение антиоксидантных свойств зеленого чая 114
Заключение 117
Список условных обозначений и сокращений 120
Список использованных библиографических источников 121
- Основные способы иммобилизации ДНК на поверхности электрода
- Приготовление рабочих растворов
- Вольтамперометрический ДНК-сенсор на основе полимеризованных материалов
- Выбор условий формирования чувствительного слоя ДНК-сенсора
Основные способы иммобилизации ДНК на поверхности электрода
Молекулы ДНК являются важнейшими компонентами живой клетки, определяющими сохранение и передачу генетической информации. Их повреждение может привести к непоправимым последствиям, вплоть до гибели клетки или приобретения ею неблагоприятных свойств. К примеру, раковые клетки не подвергаются апаптозу («запрограммированная» смерть клетки). Повреждение ДНК может быть обусловлено природными факторами – ионизирующим излучением или воздействием кислорода в клетке. Учеными было подсчитано, что в сутки происходит до миллиона таких «естественных» повреждений молекул ДНК. Несмотря на столь огромное число мутаций, живому организму удается сохранить свою работоспособность. Это связано с функционированием ферментативных систем, чья задача сводится к восстановлению поврежденных участков ДНК, а в случае разрыва обеих цепей ДНК - к рекомбинации молекулы. Однако механизм репарации ДНК может быть нарушен или повреждение может быть необратимым. Это приводит к накоплению повреждений и как следствие – к возникновению мутаций или перерождению клетки в раковую. Среди ДНК-повреждающих факторов химической природы чаще всего упоминают гидроксидные, супероксидные радикалы и другие активные формы кислорода (АФК), и ферменты нуклеазы. Однако мутагенным действием также обладают многие загрязнители окружающей среды – канцерогены и противоопухолевые препараты. Последние разработаны для повреждения ДНК раковых клеток с целью остановки их бесконтрольного деления. К числу физических повреждающих факторов относят ионизирующую радиацию, действие экстремальных температур, ультразвука, электрического тока и т.д.
Повреждение ДНК возникает при взаимодействии биомолекулы с химическими или физическими агентами, встречающимися в окружающей среде, и может включать в себя различные субъекты [9, 10]. На рисунке 3 приведены продукты наиболее частого повреждения ДНК.
Некоторые генотоксичные агенты атакуют остатки азотистых оснований. Ал-килирующие агенты (а) вызывают целый ряд поражений азотистых оснований, например, образование O-6 - и 7-алкилпроизводных гуанина (1 и 2, соответственно) или 3-алкиладенина (3). Рисунок 3. Продукты наиболее частого повреждения ДНК [9, 10]
Окислительное повреждение ДНК (b) предполагает формирование 8-оксогуанина (4), 1-N6-этеноаденина (5) (продукт реакции аденина с акролеином, образующимся путем окисления полиненасыщенных жирных кислот) или тимин-гликоля (6). Некоторые мутагены вызывают дезаминирование оснований (с), например, преобразование цитозина в урацил (7). УФ-облучение дает несколько продуктов (d), среди которых наиболее распространены циклобутановые димеры пиримидина (8). Метаболически активированные канцерогены (е), включая полициклические ароматические углеводороды, образуют громоздкие ДНК-аддукты обычно с остатками гуанина (9). Многие противораковые препараты действуют, индуцируя специфические повреждения ДНК (f), например, образование ковалентной связи между двумя смежными гуаниновыми остатками (10). Это типичные поражения, вызываемые цисплатином. Справа на рисунке 3 показаны повреждения, связанные с обрывом фосфодиэфирных связей в сахарно-фосфатном остове (одно- или двухцепочечные обрывы) или с гидролизом N-гликозидных связей, связывающих азотистые основания с дезоксирибозными остатками (образование так называемых абазических центров ДНК).
Электрохимические технологии обладают рядом преимуществ, делающих их удобным инструментом изучения ДНК. Среди них малое время отклика (экспресс-ность метода), получение количественной информации об исследуемом объекте или явлении, высокая чувствительность, возможность автоматизации анализа, относительно низкая стоимость, возможность образования in situ интермедиатов и обнаружения повреждения ДНК. Электрохимическое изучение молекулы ДНК позволяет находить объяснение многих биологических механизмов. На сегодняшний день электрохимические ДНК-сенсоры являются системой, пригодной для моделирования процессов взаимодействия ДНК с клеточной мембраной, потенциальными канцерогенами и лекарственными препаратами. ДНК-сенсоры используют для быстрого анализа загрязнителей окружающей среды, обнаружения повреждений азотистых оснований в клинической диагностике, выявления специфических последовательностей ДНК человека, вирусов или бактерий.
Электрохимические исследования молекулы ДНК берут свое начало с конца 50-х годов XX века, когда чешский биофизик Э. Палечек начал исследование полярографического поведения смесей нуклеотидов, нуклеозидов и азотистых оснований различного состава [11]. Ему удалось зарегистрировать катодные сигналы аде-нозинмонофосфата и цитидина, а также анодный и катодный сигналы гуанозинмо-нофосфата. Далее им были получены осциллограммы в растворе апуриновой кислоты, полученной путем удаления аденина и гуанина из структуры ДНК. Исследования позволили обсуждать доступность того или иного азотистого основания в составе ДНК для электродной реакции. Так, гуанин оказался стерически более доступным для переноса электронов по сравнению с цитозином, поэтому сигнал первого был различим в растворе ДНК, а сигнал второго появлялся лишь при нарушении структуры двойной спирали ДНК. Позднее аналогичные выводы были сделаны на основе анализа циклических вольтамперограмм, полученных на ртутно-капельном электроде [12]. Электрохимические сигналы дцДНК на поверхности ртутного электрода оказались зависимы от изменения структуры биомолекулы. Такие повреждения, как одноцепочечные обрывы, химические изменения азотистых оснований и образование тяжелых аддуктов легко диагностировались с использованием дифференциально-импульсной полярографии [13-15]. Использование накопления ДНК на поверхности ртутных и стационарных твердых электродов сделало возможным анализ продуктов повреждения ДНК химическими агентами. Выбор рабочего электрода и электрохимического метода регистрации для анализа продуктов взаимодействия ДНК с генотоксичными соединениями зависит от природы повреждения ДНК. К примеру, адсорбционная вольтамперометрия на ртутном капельном электроде, ртутной пленке или на некоторых видах амальгам обеспечивает наилучшее детектирование одноцепочечных обрывов ДНК [16-18], что связано с существенными различиями между электрохимическими сигналами одно- и двухцепо-чечных молекул ДНК и раскручиванием двойной спирали ДНК. Подобным образом были изучены конфигурационные изменения молекул ДНК при интеркаляции различных веществ [19]. Сигналы ДНК на углеродных электродах оказались гораздо менее чувствительны к разрывам цепей, но в сочетании с адсорбционными методами позволяют диагностировать повреждения ДНК по сигналу окисления гуанино-вых остатков (рисунок 4А) [20-23].
Приготовление рабочих растворов
Электрохимические полимеры в составе ДНК-сенсоров могут быть синтезированы химически [140, 141] или электрохимически [142, 143]. Электронная конфигурация таких материалов и их способность к переносу электрона чувствительны к окружению полимерной цепи. ДНК как анионный полиэлектролит влияет на область проявления электрохимической активности. Изменения электронной локализации, например, при гибридизации ДНК или ее взаимодействии с заряженными низкомолекулярными соединениями, приводят к изменению оптических и электрических свойств полимера, что может использоваться как аналитический сигнал на соответствующий аналит [144].
Амперометрическое детектирование с ДНК-сенсорами на основе электропо-лимеризованных материалов получило большое распространение благодаря универсальности механизма, простоте получения поверхностных биочувствительных слоев и экспрессности методик измерения сигнала. Характеристики разработанных сенсоров определяются эффективностью электронного переноса между биокомпонентом или маркером и слоем электропроводящего полимера.
Wang и др. создали ДНК-сенсор на основе полипиррола, используя олигонук-леотиды в качестве допирующего агента. Показано появление анодного пика при добавлении комплементарной мишени и, напротив, катодного пика при добавлении некомплементарной последовательности [145]. Изменение сигналов зависело от природы используемых олигонуклеотидов. Авторы предположили, что отклик отражает изменения в проводимости полипиррола при увеличении плотности заряда в случае комплементарной последовательности и при электростатическом отталкивании в случае некомплементарной.
Ботулотоксин детектировали с помощью аптасенсора на основе слоев полипиррола и стрептавидина, включенного в состав дендримера [146]. Аптамер был модифицирован двумя концевыми группами – биотином и флуоресцеином. После связывания аналита биосенсор обрабатывали коньюгатом вторичных антител на флуоресцеин и пероксидазы хрена. После связывания концентрацию пероксидазы регистрировали амперометрически в присутствии субстрата фермента - тетраме-тилбензидина. Циклическая вольтамперометрия также позволяет проводить мониторинг процессов допирования и дедопирования электрохимически активного полимера в ходе сканирования потенциала. Garnier и др. показали это на примере ДНК-сенсора на основе полипиррола [147, 148]. Вольтамперограммы показали значительное уменьшение тока пика окисления и положительный сдвиг потенциала после гибридизации с комплементарным олигонуклеотидом. Такие изменения связаны с образованием жесткой структуры двойной спирали после гибридизации с участием комплементарного ДНК-зонда, что увеличивает энергетические затраты на образование планарной структуры полимера. Чувствительность определения увеличивалась с количеством нуклеотидов в составе зонда, а пик окисления полимерной пленки сдвигался в более положительную область потенциалов.
Одним из способов регулирования электрохимических свойств полимера является функционализация мономера азотистыми основаниями [149, 150]. Авторы ввели в структуру бис-тиофена пиримидиновые и триазиновые основания. Добавление комплементарных оснований после полимеризации функционализированных фрагментов сильно влияло на электрохимические свойства политиофена, снижая ток пика окисления и сдвигая его в положительную область потенциалов как в случае, описанном выше. Alocilja и др. разработали ДНК-сенсор с включением олигонуклеотида в растущую пленку полимера для определения Escherichia coli [151]. Распознающим элементом выступал 25-мерный олигонуклеотид. При использовании вольтамперо-метрического детектирования сигнала был достигнут clim в 1 мкг/мкл целевой последовательности ДНК, продолжительность анализа составила 15 мин.
Детектирование целевой последовательности ДНК с помощью дифференциально-импульсной вольтамперометрии на платиновом электроде, модифицированном 20-мерным ДНК-зондом, встроенным в структуру полипиррола, показало различие сигналов на комплементарную и некомплементарную последовательности в 6-8 раз [152].
Komarova и др. разработали ДНК-сенсор на основе полипиррола для хроно-амперометрического определения патогена Variola major [153]. Было установлено, что более тонкие пленки с подвижными допирующими ионами генерируют более высокий амперометрический сигнал. Блокирование поверхности пленки фрагмен 40 тированной ДНК приводило к полному исчезновению неспецифического сигнала при использовании технологии Лэнгмюра-Блоджетт, в то время как специфический сигнал оставался неизменным. В дополнение, снижение потенциала в ходе процесса гибридизации приводило к уменьшению неспецифического сигнала. При оптимальных условиях был достигнут clim 1.610-15 моль мишени ДНК в 0.1 мл анализируемого раствора.
Lonescu и др. использовали пиррол, модифицированный N-гидрокси-сукцинимидом для дальнейшей ковалентной пришивки аминированного олигонук-леотида на вирус Западного Нила [154]. Электрод погружали в раствор комплементарной последовательности с концевым биотиновым фрагментом, после гибридизации к нему присоединяли авидин и далее биотинированную глюкозоксидазу. О протекании процесса гибридизации судили по току окисления пероксида водорода, генерируемого ферментом в присутствии глюкозы. Чувствительность разработанного сенсора зависела от проницаемости полимерной пленки для пероксида водорода, поэтому для улучшения аналитических характеристик ДНК-сенсора полимерную пленку предварительно окисляли до минимального уровня ее собственной электропроводности. Биосенсор характеризуется коротким временем гибридизации (2 часа) и возможностью определения ДНК вируса Западного Нила в диапазоне концентраций от 10-10 до 10-15 г/мл.
Показано влияние длины ненасыщенного заместителя в ядре пиррола на характеристики соответствующего ДНК-сенсора [155, 156]. Удлинение сопряженной цепи в сторону разветвлений улучшает сигнал биосенсора за счет повышения регулярности строения и снижения стерических затруднений при доступе аналита.
Для определения афлатоксина М1 разработан аптасенсор на основе золотого электрода с полианилиновой пленкой и наночастицами Fe3O4 [157]. Олигонуклеоти-ды были иммобилизованы с применением глутарового альдегида по свободным аминогруппам. Сигнал аптасенсора определяли с помощью квадратно-волновой вольтамперометрии. Диапазон определяемых концентраций составил от 6 до 60 нг/мл, clim 1.98 нг/мл.
Вольтамперометрический ДНК-сенсор на основе полимеризованных материалов
Для нанесения нативной ДНК 2 мкл раствора ДНК (2 мг/мл) в 25 мМ KCl наносили на поверхность электрода и высушивали при 50С. В экспериментах с окисленной ДНК сначала биополимер растворяли в 25 мМ KCl, затем добавляли повреждающий агент. После 60 минут протекания реакции 2 мкл полученного раствора наносили на электрод, модифицированный полимерной пленкой, и высушивали при 50С в течение 10 мин. В качестве повреждающих агентов использовали 1.1310-2 М H2O2 + 3.9410-4 М FeSO4; 1.1310-2 М H2O2 + 3.9410-4 М CuSO4; 1.1310-2 М H2O2. Регистрацию вольтамперограмм проводили в буферных растворах, применявшихся для электрополимеризации соответствующего мономера. В некоторых экспериментах с поли(НК) вместо ДНК в качестве полианиона использовали полистиролсульфонат натрия. Для этого на подготовленный по методике, описанной выше, электрод капали 1.4 мкл раствора полистиролсульфоната натрия (2 мг/мл) в 25 мМ KCl и высушивали аналогично экспериментам с ДНК, при 50 С.
Эксперименты с антиоксидантами проводили с использованием ДНК-сенсора на основе поли(МС). В качестве модельных образцов использовали пакетированный зеленый чай («Flying Dragon», Greenfield), красное столовое вино («Каберне», винный дом Фотисаль) и аскорбиновую кислоту. Аликвоты исследуемых образцов добавляли непосредственно к окисляющему агенту (H2O2 + CuSO4). В холостом опыте к растворенной в 25 мМ KCl ДНК из молок лосося последовательно добавляли 100 мкл раствора соли меди(II), 50 мкл деионизированной воды и 28 мкл раствора пе-роксида водорода. Полученную смесь перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 60 мин. В экспериментах по оценке защитного действия антиокси-данта растворы готовили аналогично, но вместо деионизированной воды добавляли раствор исследуемого антиоксиданта. Чай готовили, заваривая по рекомендации производителя и остужая до комнатной температуры перед аликвотным разбавлением. В экспериментах с предварительным смешением реагентов к растворенной в 25 мМ KCl ДНК добавляли заранее (за 5 мин.) приготовленную смесь из 100 мкл раствора соли меди(II), 50 мкл исследуемого образца (антиоксиданта) и 28 мкл раствора пероксида водорода. Полученную смесь перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 60 мин.
Полученные описанным выше способом смеси наносили на поверхность СУЭ, модифицированного поли(МС), капельным методом (2 мкл на электрод) и регистрировали циклическую вольтамперограмму.
Импедиметрический ДНК-сенсор. Поверхность СУЭ очищали механически и электрохимически как описано выше для вольтамперометрического сенсора. Далее электрод поляризовали при 1.5 В в 0.2 М серной кислоте в течение 30 с и ополаскивали деионизированной водой. Для нанесения наночастиц серебра 2 мкл приготовленной суспензии наночастиц капали на поверхность электрода и высушивали при комнатной температуре. После этого на поверхность наносили 5 мкл 15 мМ EDC и 5 мкл 8.7 мМ NHS и накрывали пробиркой Эппендорфа на 18 ч для предот 61 вращения высыхания. Затем электрод промывали деионизированной водой. 10 мкл 0.4 мМ НК наносили на поверхность электрода на 15 мин. и затем смывали деиони-зированной водой. После этого электрод инкубировали в 1 мг/мл растворе ДНК в 0.05 М ГЕПЕС в течение 20 мин, ополаскивали деионизированной водой и инкубировали в течение 20 мин. в 20 мМ ТРИС, содержащем 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ CaCl2 и 1 мМ MgCl2. При регистрации окислительного повреждения ДНК полученный описанным способом ДНК-сенсор инкубировали в реактиве Фентона в течение 20 мин. и затем промывали деионизированной водой и 0.1 мМ раствором ЭДТА для удаления следов железа (III).
Регистрация электрохимического импеданса. ДНК-сенсор погружали в 0.05 М ГЕПЕС (pH = 7.5), содержащий 0.1 М KCl и 0.01 М смесь феррицианидов калия. Для регистрации импеданса использовали следующие параметры: интервал частот от 100 кГц до 0.04 Гц, формальный потенциал -0.068 мВ с амплитудой изменения 5 мВ.
Исследования защитных свойств антиоксидантов проводили на примере пакетированного зеленого чая. Зеленый чай заваривали согласно рекомендациям производителя, затем аликвоту полученного образца разбавляли двукратно реактивом Фентона или деионизированной водой в случае холостого опыта и регистрировали изменение характеристик электрохимического импеданса после контакта ДНК-сенсора с полученной смесью. Используемые в работе марки зеленого чая приведены в табл. 4.
Результаты (изменение сопротивления переноса заряда) сравнивали с результатами кулонометрического титрования того же чая электрогенерированным бромом2.
Регистрация сигнала ППР. Конструкция ячейки ППР анализатора AUTOLAB ESPRIT («Metrohm Autolab b.v.», Нидерланды) позволяет проводить исследования одновременно на двух разделенных участках рабочей поверхности золотого пленочного электрода по 5 мм2. Перемешивание рабочего раствора в ячейке объемом 120 мкл осуществляли в процессе работы перистальтического насоса и автосэмплера при замене инжектируемого объема (40 мкл.).
Выбор условий формирования чувствительного слоя ДНК-сенсора
Для создания нового подхода к регистрации окислительного повреждения ДНК необходимо было решить задачу иммобилизации ДНК на поверхности транс-дьюсера. Возможность использования для этого захвата биополимера в растущую пленку покрытия была оценена на примере НК. С помощью пьезокварцевого микровзвешивания была изучена электрополимеризация красителя из раствора, содержащего дцДНК. Действительно, в процессе циклирования потенциала электрода происходил захват молекул ДНК в структуру растущей пленки полимера. Полученные вольтамперограммы и гравиграммы приведены на рисунке 31. В случае, когда ДНК присутствует в рабочем растворе (рисунок 31А), гравиграмма для каждого цикла имеет клиновидный профиль, отличающийся от изменения массы поверхностного слоя в аналогичных экспериментах, проведенных в отсутствие ДНК в растворе (ср. рисунок 28). Это связано, по-видимому, с тем, что роль противоиона окисленной формы мономера и полимера НК играет отрицательно заряженная молекула ДНК, выход которой в раствор на стадии восстановления полимерной пленки невозможен в связи с большой массой биомолекулы. Нельзя также исключить влияния прямой адсорбции ДНК на непокрытом электроде, нивелирующей процессы изменения состава пленки полимера.
А. Вольтамперограммы и гравиграммы раствора НК в присутствии 0.5 мг/мл ДНК в процессе многократного циклирования потенциала; Б. Зависимость изменения частоты колебаний кварца от числа циклов сканирования потенциала. Приведены средние значения и погрешности для трех параллельных измерений Факт электростатического взаимодействия отрицательно заряженных молекул ДНК и положительно заряженной поверхности золота был установлен экспериментально в аналогичных экспериментах в отсутствие поли(НК), выявивших увеличение массы немодифицированного электрода при контакте его с раствором ДНК.
Конечное изменение частоты колебаний кварцевой пластины для экспериментов, проведенных в присутствии ДНК, оказалось минимум вдвое ниже по сравнению с экспериментами, проведенными в отсутствие ДНК (рисунок 31Б). Возможным объяснением этого является блокировка части поверхности золота молекулами ДНК, вследствие чего возникают диффузионные затруднения для доступа молекул мономера, осложняющие процесс инициирования полимеризации НК и последующий рост полимерной цепи.
Провести подобные эксперименты с МС и МЗ оказалось невозможным из-за расслоения растворов и образования эмульсий на стадии подготовки исходных компонентов для полимеризации. Вероятно, взаимодействие биомолекул с красителями приводило к выделению новой фазы. При попытках регистрации грави-грамм в указанных условиях наблюдались дополнительные плохо воспроизводимые искажения, влияющие на отклик сенсора и возможности оценки роста пленки полимера.
Таким образом, присутствие ДНК в растворе для электрополимеризации существенно сказывается на росте пленки полимера, однако, полученные зависимости позволяют предположить снижение неблагоприятного воздействия молекул ДНК при уменьшении их содержания минимум в 10 раз.
Полученные результаты исследования внедрения ДНК в пленку полимера позволили сделать вывод о непригодности описанного метода иммобилизации молекул биокомпонента при создании вольтамперометрического ДНК-сенсора. Снижение массы электрохимически активного полимера на поверхности электрода будет приводить к уменьшению аналитического сигнала, что затруднит выявление вклада окислительного повреждения ДНК.
Полученные в данной главе экспериментальные результаты и их обсуждение опубликованы в [199, 200]. 3.2.3. Установление природы влияния нативной ДНК на сигнал сенсора и оптимизация условий действия повреждающих агентов
В связи с вышесказанным в качестве метода иммобилизации биокомпонента было выбрано капельное нанесение. Суть его состоит в распределении определенного микрообъема раствора ДНК на поверхность СУЭ с дальнейшим высушиванием. Такой метод в отличие от включения молекул ДНК в состав растущей пленки полимера приводит к образованию равномерного покрытия из молекул биокомпонента и позволяет проводить предварительное повреждение молекул ДНК, избегая тем самым окислительной деградации электрохимически активной полимерной подложки.
Согласно методике эксперимента (см. Глава 2), аналитическим сигналом разработанных вольтамперометрических ДНК-сенсоров могут рассматриваться изменение токов или потенциалов пиков окисления/восстановления полимерных покрытий в результате воздействия ДНК, поврежденной АФК (рисунок 32).
Однако при обработке результатов предварительных экспериментов оказалось, что большая часть из этих величин не отражала изменения состава слоя либо была недостаточно воспроизводима в серии измерений. Наиболее целесообразным было признано использовать изменение положения пиков окисления АЕох Эта величина численно равна разности потенциалов пика окисления электрохимически активного полимера после и во время проведения полимеризации. Для установления природы влияния ДНК на сигнал биосенсора были проведены эксперименты с полистиролсульфонатом (ПСС), который, так же, как и ДНК, является полианионом (рисунок 33). Содержание ПСС и ДНК в проделанных экспериментах было подобрано таким образом, чтобы количества отрицательно заряженных участков полимерных цепей для них примерно совпадали. Гистограмма демонстрирует совпадение величины отклика, полученного после нанесения нативной ДНК и ПСС. Таким образом, можно сделать вывод о том, что влияние ДНК на сигнал сенсора определяется плотностью отрицательного заряда модификатора, нанесенного поверх пленки редокс-активного материала. При изменении этой плотности, в частности, после окислительного повреждения молекул ДНК, должно происходить изменение вольтамперных характеристик сенсора как отражение равновесия взаимного перехода редокс-форм под действием внешнего заряда биополимера.