Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Перенос энергии электронного возбуждения. Влияние жидких и твердых наносистем на флуоресцентные свойства молекул и эффективность переноса энергии возбуждения 14
1.1 Влияние поверхностного плазмонного резонанса наночастиц золота и серебра на флуориметрические свойства флуорофоров 17
1.2 Применение наночастиц золота и серебра во флуориметрическом анализе 21
1.3 Влияние жидких нанообъектов, - мицелл ПАВ, на эффективность переноса энергии возбуждения и флуориметрические свойства молекул антибактериальных препаратов 26
1.4 Применение организованных сред во флуориметрическом анализе антибиотиков тетрациклинового ряда 29
1.5 Формулирование задач исследования 38
Глава 2. Экспериментальная часть 40
2.1. Реактивы 40
2.2. Аппаратура и техника измерений 46
Глава 3. Получение, свойства и влияние наночастиц серебра на флуоресцентные свойства доксициклина и его производных 53
3.1 Влияние НЧ серебра на флуоресцентные свойства доксициклина 58
3.2 Модификация поверхности наночастиц серебра ионами Eu3+ 63
3.3 Выявление оптимальных условий флуоресценции доксициклина 66
3.4 Влияние модифицированных наночастиц серебра на флуориметрические свойства производных тетрациклинового ряда 68
3.5 Перенос энергии в системе ДЦ - НЧ серебра, модифицированные ионами Eu3+ 72
Глава 4. Влияние мицелл ПАВ на флуориметрические свойства флуниксина 79
4.1 Спектры поглощения и флуоресценции флуниксина и его комплексов с РЗЭ 79
4.2 Влияние природы поверхностно-активных веществ 83
4.3 Влияние второго лиганда 85
4.4 Оптимальные условия сенсибилизированной флуоресценции 86
4.5 Линейная зависимость интенсивности флуоресценции комплекса тербия с флуниксином от его концентрации 90
4.6 Флуоресцентные свойства комплекса флуниксина с Tb3+ на твердой матрице 91
Глава 5. Флуориметрические свойства пефлоксацина и его комплекса с тербием в водных и мицеллярных растворах ПАВ 96
5.1 Собственная и сенсибилизированная флуоресценция пефлоксацина и его комплексов с РЗЭ 96
5.2 Влияние природы мицелл ПАВ на интенсивность 3+ сенсибилизированной флуоресценции комплекса Tb - ПФ 100
5.3. Влияние второго лиганда на флуоресценцию комплекса Tb3+– ПФ 101
5.4 Влияние кислотности среды на интенсивность флуоресценции Tb3+– ПФ 102
5.5 Выбор порядка сливания реагентов 103
5.6 Влияние временной задержки регистрации на интенсивность сигнала флуоресценции 104
5.7 Линейная зависимость интенсивности флуоресценции комплекса Tb3+ с пефлоксацином от концентрации антибиотика 105
5.8 Сорбционно – флуориметрические свойства пефлоксацина 106
Глава 6 Флуориметрическое определение доксициклина, флуниксина, пефлоксацина в объектах различного происхождения 111
6.1 Определение доксициклина с помощью модифицированных ионами Eu3+ наночастиц серебра 111
6.1.1 Определение ДЦ в препарате «Доксициклин» 112
6.1.2 Определение доксициклина в природной воде 113
6.2 Определение флуниксина в препарате "Флунекс" 114
6.3 Флуориметрическое определение пефлоксацина 115
6.3.1 Методика определения пефлоксацина в смешанной жидкости ротовой полости 115
6.3.2 Определение пефлоксацина в препарате «Абактал» 118
Заключение 120
Благодарности 122
Список литературы 123
- Применение наночастиц золота и серебра во флуориметрическом анализе
- Влияние НЧ серебра на флуоресцентные свойства доксициклина
- Флуоресцентные свойства комплекса флуниксина с Tb3+ на твердой матрице
- Методика определения пефлоксацина в смешанной жидкости ротовой полости
Введение к работе
Актуальность работы. Определение содержания антибиотиков и других
лекарственных средств в фармацевтических препаратах, биологических
жидкостях, пищевых продуктах, объектах окружающей среды на сегодняшний
день является актуальной задачей аналитической химии. Наиболее часто для
таких целей используют микробиологические методы, основанные на
способности определяемого вещества задерживать рост тест-микроба. Методы
высокоэффективной жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии
отличаются более высокой чувствительностью и точностью, но требуют
привлечения дорогостоящего специального оборудования и
высококвалифицированного персонала. В последнее время в биологических и
аналитических исследованиях, клеточной и молекулярной визуализации,
медицинской диагностике, судебно-медицинской экспертизе, генетическом
анализе благодаря высокой чувствительности, доступности аппаратурного
оформления и простоте использования наблюдается рост удельного веса
флуориметрического метода анализа. Появляются новые подходы, позволяющие
дополнительно улучшить метрологические характеристики флуориметрического
исследования, повысить интенсивность аналитического сигнала и его
избирательность. Одним из них является измерение сенсибилизированной
флуоресценции в результате обменно-резонансного или индуктивно-
резонансного переносов энергии в аналитических системах.
Однако использование явления переноса энергии возбуждения связано с
ограничениями, преодоление которых путем совершенствования уже известных
флуорофоров не всегда эффективно. В последние десятилетия актуально
применение наноматериалов, используемых в качестве нанореакторов или
участников пары донор-акцептор энергии электронного возбуждения и
способствующих повышению интенсивности сенсибилизированной
флуоресценции. Жидкие нанообъекты, мицеллы поверхностно-активных веществ выступают в качестве нанореакторов аналитических систем. Солюбилизация и концентрирование компонентов аналитических реакций в объеме нанофазы сближает молекулы и ионы, изменяя их реакционную способность, гидрофобные свойства, гидратацию, «жесткость», и, как следствие, изменяет эффективность внутри- и межмолекулярного переноса энергии возбуждения. Особенности использования твердых нанообъектов в разработке новых подходов флуориметрического определения биологически активных веществ связаны с их непосредственным участием в процессе переноса энергии, высокими значениями коэффициентов экстинкции, легко варьируемыми
оптическими характеристиками, определяемыми морфологией и окружением поверхностного слоя наночастиц.
Цель работы состояла в оценке влияния жидких (мицеллы поверхностно-активных веществ) и твердых (наночастицы серебра) нанообъектов на эффективность переноса энергии в лантанидных комплексах некоторых тетрациклинов, фторхинолонов, флуниксина и применении таких систем в люминесцентном анализе.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Выявить системы лантанид - лиганд (тетрациклины, фторхинолоны и флуниксин), для которых реализуются эффекты увеличения интенсивности флуоресценции в присутствии различного типа нанообъектов (наночастиц серебра и мицелл ПАВ) и выбрать подход, обеспечивающий максимальный аналитический эффект;
Разработать методику модификации поверхности наночастиц серебра ионами европия, оценить стабильность и размер модифицированных наночастиц;
Изучить влияние мицелл поверхностно-активных веществ на собственную и сенсибилизированную флуоресценцию пефлоксацина и флуниксина и их комплексов с ионами РЗЭ;
Разработать методики флуориметрического определения некоторых антибиотиков фторхинолонового и тетрациклинового рядов, нестероидного противовоспалительного флуниксина с использованием наночастиц серебра или мицелл поверхностно-активных веществ в различных объектах и лекарственных препаратах.
Методы исследования. Для решения поставленных в работе задач применяли комплекс физических методов исследования: абсорбционная молекулярная спектроскопия в видимой и УФ-области спектра, флуориметрия, метод динамического рассеяния света, просвечивающая электронная микроскопия.
Научная новизна состоит в следующем:
- экспериментально доказано участие индуктивно-резонансного переноса
энергии возбуждения в формировании аналитического сигнала в паре донор -
акцептор между наночастицами серебра и доксициклином;
- систематически исследован и обоснован эффект максимального увеличения
чувствительности определения и понижения предела обнаружения
антибиотиков флуориметрическим методом в результате последовательной реализации индуктивно-резонансного переноса энергии возбуждения между наночастицами серебра и антибиотиком и обменно-резонансного, – в хелатах ионов европия с антибиотиком;
- показано непосредственное участие наночастиц в процессе переноса энергии,
обусловливающее увеличение сигнала эмиссии более чем на два порядка,
выявлена связь интенсивности флуоресценции со средними размерами
наночастиц серебра и оптическими характеристиками, зависящими от природы
агента стабилизатора;
- разработана методика модификации наночастиц серебра ионами европия,
определены значения дзета-потенциала диффузного слоя модифицированных
наночастиц в зависимости от концентрации европия, изучены оптические
свойства такой системы, позволяющие максимально эффективно увеличить
интенсивность сенсибилизированной флуоресценции в аналитической системе и
чувствительность определения;
- показано влияние мицелл ПАВ на протолитические свойства флуниксина и
пефлоксацина, возможности расширения интервала кислотности
комплексообразования ионов металлов РЗЭ с биологически активными
веществами, выявлены условия увеличения чувствительности и понижения
предела обнаружения (для флуниксина в водных средах определение
невозможно, пефлоксацина – в 5 раз);
- показано практическое использование в анализе эффекта увеличения
сенсибилизированной флуоресценции ионов лантанидов в присутствии
наночастиц серебра в 125 раз для люминесцентного определения доксициклина,
а также флуниксина в 100 и пефлоксацина в 10 раз в среде мицелл ПАВ.
Практическая значимость работы. Выявленные в работе факторы и подходы,
способствующие увеличению интенсивности сенсибилизированной
флуоресценции в растворе, могут быть применены для понижения пределов обнаружения других представителей тетрациклинов, фторхинолонов и флуниксина, образующих в растворе комплексы с ионами европия и тербия. Практическая значимость реализуется в следующих направлениях:
увеличении чувствительности определения и понижении предела обнаружения доксициклина, основанные на участии поверхностного плазмонного резонанса наночастиц серебра в индуктивно-резонансном переносе энергии возбуждения к антибиотику и повышении эффективности внутримолекулярного переноса в его хелатах с европием;
возможности управления аналитической системой и повышения селективности определения биологически активных веществ в результате использования в
качестве доноров энергии возбуждения наночастиц металлов с легко варьируемыми оптическими характеристиками, размером и окружением поверхностного слоя наночастиц;
- влиянии мицелл ПАВ на протолитические свойства флуниксина и
пефлоксацина, расширении интервала кислотности комплексообразования
ионов металлов РЗЭ с биологически активными лигандами, увеличении
чувствительности флуориметрического определения пефлоксацина и
флуниксина;
- разработке методики получения стабильных в водных растворах
модифицированных ионами европия золей наночастиц серебра.
На защиту автор выносит:
влияние оптических свойств наночастиц серебра на флуоресценцию некоторых тетрациклинов, фторхинолонов и флуниксина;
методику модификации наночастиц серебра ионами европия;
- интерпретацию влияния мицелл поверхностно-активных веществ на
флуоресценцию пефлоксацина, флуниксина и их комплексов с ионами РЗЭ;
- методики флуориметрического определения антибиотиков и флуниксина в
различных объектах и лекарственных препаратах, основанные на использовании
нанообъектов – серебряных наночастиц или мицелл ПАВ.
Личный вклад соискателя заключается в участии в постановке задач исследования, выборе методов синтеза и модификации наночастиц серебра, разработке методики модификации НЧ, апробации полученных наночастиц для определения антибиотиков различного класса, непосредственном проведении экспериментов, обобщении и анализе полученных результатов, формулировании выводов, написании научных статей.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей в журналах, рекомендуемых ВАК, 10 статей в сборниках, 8 тезисов докладов международных и Всероссийских конференций, получен 1 патент РФ. Степень достоверности результатов исследований подтверждается анализом литературных источников по теме диссертации, применением современных инструментальных методов исследования и анализа и соответствием между результатами, полученными разными методами, статистической обработкой полученных данных, их апробацией на конференциях и публикацией основных положений диссертации в профильных журналах.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на II Съезде аналитиков России (Москва, 2013); на Всероссийской конференции по аналитической спектроскопии с международным участием, (Краснодар, 2012); на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2015» (Москва, 2015); Saratov Fall Meeting 2015 Optical
Technologies in Biophysics and Medicine. (Саратов, 2015); «Presenting Academic
Achievements to the World» (Саратов, 2015); на II Всероссийской конференции по
аналитической cпектроскопии с международным участием. (Краснодар, 2015);
на XX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии,
(Екатеринбург,2016); на X, XI и XII Всероссийских конференциях молодых ученых с международным участием. Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии. (Саратов, 2015, 2016, 2017); Saratov Fall Meeting 2017, International Symposium Optics and Biophotonics. (Саратов, 2017), на III Съезде аналитиков России, (Москва, 2017).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (6 глав), заключения и списка цитируемой литературы, содержащей 186 ссылок. Работа изложена на 144 страницах, содержит 53 рисунка и 15 таблиц.
Финансовая поддержка работы осуществлялась проектами РФФИ (№ 15-03-99704, № 18-03-01029).
Применение наночастиц золота и серебра во флуориметрическом анализе
Наиболее часто внимание исследователей привлекает эффект усиления флуоресценции флуорофора в присутствии наночастиц металлов (металл усиленная флуоресценция, MEF) [56]. На основании увеличения сигнала сенсибилизированной флуоресценции комплексов РЗЭ с флуоресцирующими аналитами в присутствии НЧ серебра предложены методики определения тетрациклинов в молоке [57], некоторых хинолонов в фармацевтических препаратах [58]. Увеличение флуоресценции комплекса Eu3+ с тетрациклином в 4 раза в присутствии наночастиц позволяет осуществить флуориметрическое определение антибиотика в диапазоне концентраций 10 нМ - 10 мкМ с пределом обнаружения 4 нМ [57].
Для определения допамина используют эффект возрастания сенсибилизированной флуоресценции Tb3+ в присутствии НЧ серебра. Известна методика флуориметрического определения допамина на основании измерения сенсибилизированной флуоресценции Tb3+ [59], а также ко-люминесценции этого же иона в присутствии Y3+ [60]. Диапазоны определяемых концентраций 0.6-100 нМ и 2.0 - 100 нМ, предел обнаружения 0.22 нМ и 0.57 нМ соответственно.
Эффективный перенос энергии возбуждения и значительное возрастание интенсивности флуоресценции становится возможным после модификации НЧ серебра -циклодекстрином и их последующем использовании для флуориметрического определения тетрациклина (ТС) и хлортетрациклина (СТС) в анализе лекарственных препаратов [61]. Авторы утверждают, что -циклодекстрин способствует сближению НЧ и определяемых антибиотиков, а также эффективному переносу энергии. Флуориметрическое определение ТС и СТС возможно в диапазоне концентраций от 0.10 до 6.0 мг/л, 0.05 до 3.0 мг/л с пределами обнаружения 0.63 мкг/л и 0.19 мкг/л, соответственно.
В качестве модификатора поверхности НЧ в биосенсорах для обнаружения ионов металлов, органических молекул используется оксид кремния. Модификация НЧ серебра оксидом кремния и органофосфатной гидролазой в качестве рецептора позволяет осуществить флуориметрическое определение органофосфатов [62]. Десятикратное увеличение сигнала флуоресценции снижает предел обнаружения от 20 до 2 ppb для параоксона и от 50 ppb до 10 ppb для метилпаратиона.
Интенсивность флуоресценции аналитических систем зависит от природы модификатора НЧ [63], увеличение сигнала собственной флуоресценции родамина B в значительной степени зависит от среднего диаметра НЧ серебра и толщины оболочки [64].
Датчики на основе MEF отличаются высокой чувствительностью и селективностью определения Hg2+, Ag+ и кораллина. Предел обнаружения для Hg2+ составляет 1.4 нM [65].
Использование нуклеиновых кислот в качестве модификатора поверхности НЧ золота способствуют росту интенсивности сигнала флуоресценции комплекса Eu3+ – TC. Определение тетрациклина в молоке и моче возможно в диапазоне концентраций 0.01-5 мкМ с пределом обнаружения 4 нМ [66].
Чувствительные способы определения нуклеиновых кислот в молоках рыб [67, 68] основаны на измерении интенсивности флуоресценции кверцетина [67], комплекса кемпферола с Al3+ [68] в присутствии НЧ серебра.
Определение ДНК характеризуется пределом обнаружения 1 нг/мл [67]. Гидрофобные и электростатические взаимодействия в аналитических системах с участием фрагментов молекул ДНК способствуют сближению компонентов и повышению эффективности переноса энергии возбуждения. Определение сертралина в фармацевтических препаратах, моче и плазме крови с помощью комплекса тербия с 1, 10-фенантролином и серебряных НЧ представлено в работе [69]. Под влиянием ППР НЧ серебра наблюдается эффект усиления сенсибилизированной флуоресценции разнолигандного комплекса Tb3+ - Фен- сертралин.
НЧ серебра усиливают сенсибилизированную флуоресценцию комплекса Tb3+ с катехоламинами, что используется при определении гормонов в фармацевтических препаратах, моче и сыворотке крови. Градуировочный график линеен в диапазонах концентраций 2.5-110 нМ эпинефрина, 2.8-240 нМ норэпинефрина и 2.4-140 нМ допамина, с пределами обнаружения 0.25 нМ, 0.64 нМ и 0.42 нМ, соответственно [70].
Дана оценка влияния НЧ золота и серебра разных размеров на флуоресценцию комплекса Tb3+ с деферазироксом. Показано, что НЧ серебра со средним диаметром 18 нм, усиливают интенсивность сенсибилизированной флуоресценции в большей степени, чем НЧ золота. Предложен высокочувствительный и селективный метод определения деферасирокса в моче и фармацевтических препаратах. Установлено, что эффективность переноса энергии зависит от концентрации НЧ серебра, Tb3+ и pH среды. Диапазон определяемых содержаний деферазирокса составляет 0.1 - 200 нМ, предел обнаружения 0.03 нМ [71].
Усиление сигнала сенсибилизированной флуоресценции комплекса Tb3+ с циталопрамом в присутствии НЧ серебра используется для флуориметрического определения антидепрессанта [72].
Стабилизация НЧ серебра -циклодекстрином используется во флуориметрическом определении ципрофлоксацина, энрофлоксацина и ломефлоксацина во фармацевтических препаратах [73]. Эффект увеличения или тушения собственной флуоресценции антибиотиков зависит от соотношения концентраций фторхинолонов и НЧ серебра.
Интенсивность сенсибилизированной флуоресценции в результате переноса энергии с участием НЧ серебра зависит от расстояния между донором и акцептором. Модификация олигонуклеотидами флуоресцентных красителей вблизи поверхности НЧ серебра позволяет регулировать расстояние между ними и выявить оптимальные условия получения максимальной флуоресценции аналитической системы для обнаружения аденозина [74]. Интенсивность флуоресценции уменьшается, если расстояние превышает 8 нм или ниже этого значения. Флуориметрическое определение аденозина возможно от 200 нМ до 200 мкМ, предел обнаружения 48 нМ.
Углеродные НЧ, выступая в качестве стабилизатора, позволяют регулировать размер серебряных НЧ для флуориметрического определения меламина в молоке. Возможно флуориметрическое и УФ- детектирование с пределом обнаружения 30 нМ [75].
Использование неионогенных ПАВ ОП-10 в сочетании с НЧ серебра способствует возрастанию сигнала сенсибилизированной флуоресценции комплекса Eu3+ с доксициклином. Флуориметрическое определение содержания доксициклина в утином мясе позволяет определять 0.05-12 мг/л антибиотика [76].
Флуориметрический способ определения мононуклеотида флавина в присутствии НЧ серебра на золотой подложке представлен в работе [77].
В аналитической практике находит применение эффект тушения флуоресценции флуорофоров в присутствии металлических наночастиц. Эффективность тушения эмиссии зависит от размера, геометрии используемых НЧ благородных металлов и проявляется, когда спектр излучения флуорофора перекрывается с полосой поглощения плазмонного поверхностного резонанса наночастиц. Необходимо отметить, что тушение флуоресценции реже используется в разработке способов определения биологически активных веществ.
Определение метимазола основано на резонансном переносе энергии возбуждения от акридинового оранжевого к НЧ серебра. Флуоресценция красителя значительно уменьшается на поверхности наночастиц, однако в присутствии метимазола с более высокой сорбционной способностью интенсивность флуоресценции красителя возрастает и пропорциональна концентрации метимазола [78].
Эффект тушения флуоресценции модифицированных полиэтиленимином НЧ серебра ( возб = 375 нм) в результате резонансного переноса энергии в присутствии судановых красителей используется для определения содержания Судана I-IV [60].
Флуориметрическое определение РНК вируса гепатита С с помощью НЧ золота представлено в [80]. Эффективность переноса энергии зависит от размера НЧ и увеличивается на три порядка при возрастании среднего диаметра от 5 до 70 нм [61]. Тушение флуоресценции акридинового эфира в присутствии НЧ золота используют для обнаружения ДНК [81].
Влияние НЧ серебра на флуоресцентные свойства доксициклина
Спектр поглощения ДЦ характеризуется двумя полосами поглощения при =280 нм и =350 нм (рисунок 5).
Это согласуется с литературным данным и объясняется присутствием в молекуле антибиотика двух хромофорных групп [171].
Спектр возбуждения ДЦ представлен на рисунке 7 (1). Из него видно, что максимум батохромно смещен, поскольку оптимальная длина волны возбуждения антибиотика возб=390 нм.
Спектр флуоресценции ДЦ характеризуется невысокой интенсивностью (возб = 390 нм, фл = 525 нм, рисунок 6). Вблизи поверхности НЧ возможно усиление сигнала собственной флуоресценции ДЦ ввиду значительного перекрывания спектра ППР НЧ серебра и возбуждения ДЦ (рисунок 7). Однако, как показал эксперимент, увеличения интенсивности флуоресценции ДЦ в присутствии НЧ серебра не наблюдалось, что связано с возможным экранированием поверхности НЧ цитрат - ионом и значительным расстоянием между донором и акцептором, препятствующим эффективному резонансному переносу энергии. В таких условиях интенсивность флуоресценции ДЦ практически не возрастает.
С целью сокращения расстояния в паре донор – акцептор, поверхность НЧ серебра модифицировали ионами Tb3+ путем введения добавок соли соответствующего РЗЭ в систему ДЦ - НЧ серебра. При этом на поверхности НЧ образуются разнолигандные комплексы ионов Tb3+ с ДЦ и цитрат – ионом, сокращается расстояние между ДЦ и НЧ. В условиях образования разнолигандного комплекса на поверхности НЧ реализуется резонансный перенос энергии возбуждения от нанообъекта к ДЦ, характеризующийся возрастающей интенсивностью флуоресценции тетрациклина (фл = 525 нм) при увеличении концентрации последнего (рисунок 8) практически в 2 раза. Важно, что образование комплекса Tb3+ с ДЦ не сопровождается внутримолекулярным переносом энергии ввиду того, что резонансный уровень иона РЗЭ значительно превышает энергию триплета ДЦ.
С помощью описанной выше модельной системы и модификации поверхности НЧ показана возможность реализации эффективного резонансного переноса энергии от НЧ к флуорофору (ДЦ) при сокращении расстояния между ними. В результате одновременного воздействия внешнего источника излучения и поверхностного плазмонного резонанса НЧ наблюдается увеличение собственной флуоресценции антибиотика в 2 раза (рисунок 8).
Дополнительно увеличить сигнал сенсибилизированной флуоресценции в исследуемой системе возможно в результате последовательной реализации индуктивно - резонансного и обменно-резонансного переносов энергии возбуждения при модификации поверхности НЧ серебра ионами Eu3+.
Образующийся на поверхности НЧ разнолигандный хелат Eu3+ с ДЦ и цитрат ионом, характеризуется переносом энергии с триплетного уровня лиганда антибиотика на излучательные уровни иона Eu3+ с последующей его флуоресценцией ( фл = 615 нм, возб = 390 нм, 5D07F2 переход) [28, 172- 174].
При этом происходит синергетическое увеличение интенсивности сенсибилизированной флуоресценции в 125 раз (рисунок 9), что является результатом коллективного воздействия энергии внешнего возбуждения и поверхностного плазмонного резонанса НЧ металла на ДЦ. В таких условиях вероятность перехода тетрациклина в возбужденное состояние значительно возрастает, что способствует наиболее эффективной реализации переноса энергии возбуждения [33].
Флуоресцентные свойства комплекса флуниксина с Tb3+ на твердой матрице
Флуниксин в условиях возможных длин волн возбуждения видеоденситометра (возб= 254 нм, возб = 365 нм) не обладает собственной флуоресценцией, поэтому для получения сигнала флуоресценции использовали прием модификации сорбента. В качестве модификаторов были апробированы ПАВ различной природы, растворы солей РЗЭ, органические соединения, используемые ранее в качестве вторых лигандов.
Модификация сорбента нитратом ТЬ3+. Ионы редкоземельных металлов (Sm3+, Gd3+, Tb3+, Eu3+) при нанесении на сорбент (пластинка, покрытая силикагелем не флуоресцируют при облучении зон светом УФ области (i=254 нм, 2=365 нм). Флуниксин образует с ТЬ3+ комплекс с переносом энергии, который отличается значительно более высокой интенсивностью флуоресценции, в отличие от собственной флуоресценции флуниксина. Модификация силикагеля солью РЗЭ позволила увеличить интенсивность флуоресценции исследуемой системы благодаря образованию в тонком слое силикагеля комплекса с переносом энергии. В качестве аналитического сигнала выбран цвет зон, соответствующий сенсибилизированной флуоресценции хелата, который количественно определяли с помощью цветовых координат в системе RGB. Интенсивность цвета исследуемых зон флуниксина зависит от концентрации предварительно нанесенного иона Tb3+. С ростом концентрации Tb3+ интенсивность свечения зоны увеличивается. Наибольшая величина аналитического сигнала обнаруживается при использовании раствора ТЬ3+ 2.010-2 М (Рисунок 35).
Модификация сорбента мицеллами ПАВ различной природы. Изучено влияние природы организованных сред, в качестве которых были рассмотрены мицеллярные растворы ПАВ различной природы в тонком слое силикагеля, на интенсивность цвета зон комплекса флуниксина с Tb3+, обусловленного сенсибилизированной флуоресценцией.
Присутствие анионных (ДДС) и катионных (ЦПХ) ПАВ увеличивает сигнал, но незначительно. Наибольшее увеличение интенсивности сигнала наблюдается в организованных средах неионогенных ПАВ, таких как ТХ-100, бридж-35, твин-80. Но максимальный сигнал достигается при использовании ТХ-100 1.0-10"1 М, который и выбран нами для дальнейшего изучения.
Сть3+= 2-Ю"2 М, СФЛ = Ю-2 М, СПАВ = 1 ЮАМ
Модификация сорбента некоторыми органическими соединениями. В качестве органических соединений были апробированы следующие вещества: ТТА, ЭДТА, Фен, ТОФО. Модификация сорбента органическими соединениями не показала увеличения сигнала, поэтому мы отказались от их использования в дальнейших исследованиях. Рисунок 37 - Влияние органических соединений на интенсивность цвета зоны хелата ТЬ3+ -флуниксин. (Сть(Ш)= 210-2 М, С2.го лиг. = 110"4М, СФЛ= Ю"2М, СПАВ = МО М)
Линейная зависимость интенсивности свечения зон комплекса тербия с флуниксином от концентрации флуниксина.
На сорбент наносили 2 мкл ТХ-100 (Ю М), 2 мкл ТЬ3+ 2.0-10"2 М и 2 мкл флуниксина в диапазоне концентраций 1 10"2 М -1 10"4 М.
Показано, что Tb3+ образует с флуниксином комплекс с переносом энергии, эффективность которого возрастает в мицеллярных растворах твин - 80 в 30 раз.
Выявлены и интерпретированы особенности реакции комплексообразования флуниксина в мицеллярных средах ПАВ, связанные с изменением протолитических свойств флуниксина и увеличением устойчивости разнолигандного комплекса Tb3+ в мицеллярных средах ПАВ. Установлено, что солюбилизация хелата в мицеллах неионных ПАВ способствует комплексообразованию с переносом энергии возбуждения.
Показано, что в присутствии второго лиганда, интенсивность флуоресценции системы комплексов Tb3+ - флуниксин – твин-80 возрастает в 5 раз.
Установлена возможность иммобилизации бинарного комплекса на силикагель «Сорбфил АТСХ», модифицированный мицеллами Тритон Х 100. Разработана экспрессная сорбционно-флуориметрическая методика для определения флуниксина в лекарственных препаратах.
Методика определения пефлоксацина в смешанной жидкости ротовой полости
Отбор пробы смешанной жидкости ротовой полости проводили через 30, 60, 90 минут после принятия пациентами антибиотика. Перед сбором ротовую полость ополаскивали водой.
Для построения градуировочного графика на фоне матрицы, в полипропиленовые пробирки типа эппендорф объемом 1.5 мл помещали 0.3 мл смешанной жидкости ротовой полости, 0.15 мл конц. хлорной кислоты, аликвоту стандартного раствора ПФ в диапазоне концентраций 110"8 - 1-Ю"5 М. Содержимое пробирок перемешивали, центрифугировали (6000 об/мин.) 10 минут. В сухие пробирки вносили 1 мл ацетатно - аммиачного буферного раствора (рН 6 - 7), 0.4 мл ДДС 110_1М , 0.4 мл депротеинезированного раствора смешанной жидкости ротовой полости, 0.2 мл ТЬ3+ концентрации 1-Ю"2 М. Доводили до общего объема 4 мл. Измеряли интенсивность флуоресценции при возб= 279 нм, фл= 545 нм в режиме разрешенной во времени флуоресценции с задержкой при регистрации сигнала 0.3 мс. Некоторые метрологические характеристики определения ПФ представлены в таблице 12.
Методика опреденения ПФ. В полипропиленовые пробирки типа эппендорф объемом 1.5 мл помещали 0.3 мл смешанной жидкости ротовой полости, 0.15 мл конц. хлорной кислоты. Содержимое пробирок перемешивали, центрифугировали (6000 об/мин.) 10 минут. В чистые пробирки вносили 1 мл ацетатно - аммиачного буферного раствора (рН 6 - 7), 0.4 мл ДДС І-ІО М , 0.4 мл депротеинезированного раствора смешанной жидкости ротовой полости, 0.2 мл ТЬ3+ концентрации 110"2 М. Доводили до общего объема 4 мл. Измеряли интенсивность флуоресценции при возб= 279 нм, фл= 545 нм в режиме разрешенной во времени флуоресценции с задержкой при регистрации сигнала 0.3 мс. По градуировочному графику определяли содержание ПФ.
Результаты определения ПФ в жидкости ротовой полости представлены в таблице 12.
Найденные значения концентрации антибиотика в биологической жидкости согласуются с литературными данными фармакокинетики препарата в слюнных железах.
Правильность разработанной методики устанавливали методом «введено – найдено», что позволяет утверждать об отсутствии в методике систематических погрешностей.