Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы .11
1.1 Общая характеристика баклофена, физико-химические свойства 11
1.2 Фармакодинамика и фармакокинетика баклофена 14
1.3 Побочное действие и немедицинское применение баклофена 16
1.4 Методы обнаружения и количественного определения баклофена в биологических объектах 1.4.1 Спектроскопические методы определения баклофена 19
1.4.2 Хроматографические методы определения баклофена 20
1.5 Скрининг на наркотические и лекарственные вещества в судебно медицинской экспертизе и химико-токсикологическом анализе 24
Глава 2. Объекты, методы исследования и аппаратура 28
2.1 Объекты исследования 28
2.2 Методы исследования, аппаратура и условия 29
Глава 3. Исследование баклофена спектроскопическими, хроматографическими и тандемными методами 36
3.1 Изучение спектральных характеристик субстанции баклофена 36
3.2 Изучение хроматографических характеристик баклофена различными методами
3.2.1 Исследование баклофена методом ТСХ 38
3.2.2 Исследование баклофена методом ГХ/МС 40
3.2.3 Исследование баклофена методом ВЭЖХ-УФ 45
3.2.4 Исследование баклофена методом ВЭЖХ-МС/МС .50
Глава 4. Разработка методик идентификации и количественного определения баклофена в биологических объектах 55
4.1 Обнаружение баклофена при использовании методик скрининга методом ГХ/МС 55
4.1.1 Обнаружение баклофена при использовании методики скрининга мочи методом ГХ/МС после ацетилирования .55
4.1.2 Обнаружение баклофена во внутренних органах методом ГХ/МС с применением методики пробоподготовки QuEChERS
4.2 Разработка методики количественного определения баклофена в моче методом ВЭЖХ-УФ .60
4.3 Разработка методики количественного определения баклофена в крови методом ВЭЖХ-МС/МС .67
4.4 Разработка схем судебно-химического и химико-токсикологического исследования при отравлении баклофеном 74
4.5 Применение разработанных методик для определения баклофена в реальных образцах биологических объектов 76
Выводы .80
Благодарности .82
Список литературы
- Фармакодинамика и фармакокинетика баклофена
- Методы исследования, аппаратура и условия
- Исследование баклофена методом ГХ/МС
- Обнаружение баклофена во внутренних органах методом ГХ/МС с применением методики пробоподготовки QuEChERS
Введение к работе
Актуальность темы. Проблема немедицинского употребления лекарств последнее десятилетие стала одной из самых острых. Особую озабоченность вызывает злоупотребление лекарственными препаратами, оказывающими обезболивающее, а также снотворное и седативное действие. К их числу следует отнести буторфанол, донормил, кетанал, имован, феназепам, амитриптилин, декстрометорфан и др. В круг этих препаратов входит такое лекарственное средство как баклофен, в отношении которого стали чаще появляться сообщения об отравлениях. По своей химической структуре баклофен сходен с производными -аминомасляной кислоты (ГАМК). Основное проявление его фармакологической активности – антиспастическое действие, уменьшение мышечного напряжения; кроме того, баклофен оказывает также анальгезирующее действие.
Наличие случаев отравления баклофеном обусловливает необходимость изучения данного соединения в химико-токсикологическом и судебно-химическом аспекте. Для подтверждения диагноза отравления баклофеном и последующего правильного лечения необходимо иметь надежные, достоверные и чувствительные методики его качественного и количественного определения в биологических жидкостях. Существующие методики анализа баклофена в биологических объектах не универсальны, предусматривают использование дорогостоящих и труднодоступных реагентов и детекторов и не предназначены для рутинного анализа. Таким образом, актуальным является систематическое исследование по разработке и оптимизации методик судебно-химического и химико-токсикологического анализа баклофена в биообъектах.
Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы являлась разработка новых и усовершенствование существующих хроматографических методик идентификации и количественного определения баклофена в биологических объектах при судебно-химическом и химико-токсикологическом исследовании. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Изучить хроматографические условия определения баклофена методами ТСХ, ГХ/МС, ВЭЖХ-УФ и ВЭЖХ-МС/МС.
-
Оценить возможности применения существующих методик скрининга, используемых в химико-токсикологическом анализе и судебно-химических исследованиях, для идентификации баклофена в биологических объектах.
-
Разработать алгоритмы пробоподготовки для хроматографического определения баклофена в биологических объектах.
-
Создать хроматографические методики анализа биологических объектов для идентификации и количественного определения баклофена и апробировать их на реальных образцах, установить метрологические характеристики разработанных методик.
-
На основании разработанных методик предложить схемы судебно-химического и химико-токсикологического исследования для идентификации и количественного определения баклофена в биологических объектах.
Научная новизна. Установлено, что при исследовании баклофена методом ГХ/МС необходимо проведение стадии дериватизации. Впервые доказано влияние различных модификаторов подвижной фазы на аналитический сигнал баклофена при определении его методом ВЭЖХ-УФ. Подобраны условия MRM-переходов баклофена при использовании метода ВЭЖХ-МС/МС. Показана необходимость использования метода ВЭЖХ с различными вариантами детектирования при определении баклофена в образцах крови и мочи.
Практическая значимость. Впервые предложен комплекс методик обнаружения, идентификации и количественного определения баклофена в биологических объектах хроматографическими и тандемными методами для целей химико-токсикологических и судебно-химических исследований. Полученные результаты используются на кафедрах биологической химии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава РФ и фармацевтической химии ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России в качестве лекционного материала и методических рекомендаций для практических занятий по темам «Хроматография» и «Спектрофотометрия».
Разработанные методики внедрены в практику судебно-химических отделений КГБУЗ «Красноярское краевое бюро судебно-медицинской экспертизы», ОГУЗ «Челябинское областное бюро судебно-медицинской экспертизы», отдела газожидкостной, жидкостной и времяпролетной масс-спектрометрии Центральной научно-исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет имени проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Минздрава РФ. Разработано информационное письмо «Об определении баклофена в биологических объектах», предназначенное для судебных экспертов-химиков бюро судебно-медицинской экспертизы, врачей-лаборантов химико-токсикологических лабораторий.
Связь задач исследования с планами научных работ. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры аналитической и органической химии Сибирского федерального университета и кафедры фармацевтической химии Сибирского государственного медицинского университета.
Основные положения, выносимые на защиту:
хроматографические условия определения баклофена методами ГХ/МС, ВЭЖХ-УФ, ВЭЖХ-МС/МС;
способы пробоподготовки биологических объектов для определения баклофена;
результаты разработки методик идентификации и количественного определения баклофена в биологических объектах, проверки правильности и повторяемости разработанных методик;
результаты апробации разработанных методик для идентификации и количественного определения баклофена в реальных биологических объектах. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы
доложены и обсуждены на VI Всероссийской научно-технической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Молодежь и наука в третьем тысячелетии» (Красноярск, 2010); на VI Всероссийской конференции молодых учёных, аспирантов и студентов с международным участием «Менделеев-2012» (Санкт-Петербург, 2012); на I Международной научно-практической конференции
«Современная химико-токсикологическая экспертиза» I International scientific conference ACTE’2013 (Москва, 2013); на Всероссийской конференции «Теория и практика хроматографии» с международным участием, посвященной памяти проф. М.С. Вигдергауза (Самара, 2015); на научных семинарах кафедры аналитической и органической химии ИЦМиМ СФУ и кафедры фармацевтической химии СибГМУ (Красноярск, 2008-2015).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 5 – в изданиях, рекомендованные ВАК РФ.
Экспериментальные исследования по теме диссертации выполнялись на базе Центра коллективного пользования Сибирского федерального университета (г. Красноярск) и в судебно-химическом отделении КГБУЗ «Красноярское краевое бюро судебно-медицинской экспертизы» (г. Красноярск), а также в сотрудничестве с коллективами других научных организаций: Центральная научно-исследовательская лаборатория Красноярского государственного медицинского университета имени проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава РФ (г. Красноярск), отделение острых отравлений КГБУЗ «Красноярская межрайонная клиническая больница скорой медицинской помощи им. Н.С. Карповича» (г. Красноярск).
Личный вклад автора. Основные экспериментальные результаты, приведенные в диссертации, получены самим автором или при его непосредственном участии. Автором выполнены исследования по изучению спектроскопических и хроматографических характеристик баклофена, по разработке методик качественного и количественного определения баклофена в биологических жидкостях (крови, мочи), по оценке пригодности методик химико-токсикологического и судебно-химического скрининга для обнаружения баклофена, по применению разработанных методик для анализа реальных образцов биологических объектов. Обсуждение полученных результатов и подготовка материалов для публикаций проводилась совместно с научным руководителем и соавторами.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, трех глав экспериментальных исследований, выводов, списка цитируемой литературы и приложения. Материал работы изложен на 113 страницах,
Фармакодинамика и фармакокинетика баклофена
Хроматографические методы анализа являются наиболее распространенными в анализе лекарственных и наркотических средств. Тонкослойная хроматография – один из скрининговых методов качественного и количественного определения наркотических и лекартсвенных веществ. Доступность метода ТСХ, широкий круг решаемых с ее помощью аналитических задач и, главное, возможность одновременного анализа от 2 до 50 проб на одной хроматографической пластинке обеспечили методу ТСХ очень широкое распространение [14, 20, 36, 100]. Метод ТСХ используют для определения подлинности баклофена в таблетках; при этом применяют следующие системы растворителей: н-бутанол – ледяная уксусная кислота – вода (4:1:1), уксусная кислота – изопропиловый спирт – вода (3:14:3), муравьиная кислота – вода – метанол – хлороформ – этилацетат (5:5:20:30:40). Учитывая, что баклофен относится к группе аминокислот, в качестве проявляющего реагента находит примение раствор нингидрина [31, 33, 58].
В настоящее время широкое распространение в химико токсикологическом анализе получила газовая хроматография с масс селективным детектированием (ГХ/МС) как высокоспецифичный, чувствительный и достаточно экспрессный метод. По сравнению с прочими хроматографическими методами надежность идентификации наркотических средств, психотропных и лекарственных веществ существенно повышается по причине использования специфической характеристики вещества—масс спектра, в дополнение к параметрам удерживания, получаемым в хроматографическом процессе [16, 20, 27, 41]. При газохроматографическом методе определения происходит детектирование не самого баклофена, а его производного, 4-(пара-хлорфенил)-пирролидин-2-она, образующегося при нагревании баклофена выше 117-118 0С [31, 56]. Предел детектирования баклофена в плазме крови и моче составляет 50 мг/л [64]. При сочетании газо-хроматографического разделения с масс спектрометрическим детектором предел детектирования баклофена в сыворотке крови увеличивается в 10 раз [116].
Для наиболее успешного решения задачи по определению баклофена применяют дериватизацию. С этой целью определяемое вещество переводят в его производное, обладающее иными (лучшими с точки зрения используемого аналитического метода) аналитическими свойствами. В газовой хроматографии применение дериватизации связано с получением более летучих соединений, снижением полярности функциональных групп, и, как следствие, улучшение хроматографических свойств вещества, либо получение продуктов, специфичных для определенного типа детекторов (ЭЗД, ПИД и т.п.). Применение дериватизации позволяет развивать химический анализ, делать его более экспрессным, чувствительным и надежным [9-11, 15, 27]. При газохроматографическом методе анализа для дериватизации применяют уксусный, трифторуксусный, пропионовый и пентафторпропионовый ангидриды, пентафторпропанол, триметилсилильные производные и др. Применение ацетилирования является наиболее доступной и широко распространенной процедурой в анализе лекарственных и наркотических веществ. Фторорганические реагенты являются дорогостоящими, что ограничивает их использование в ежедневном анализе. Метильные и триметилсилильные производные соединений также имеют специфичные масс-спектры, но процедура анализа силилированной пробы сопровождается загрязнением масс-селективного детектора и приводит к изменению свойств хроматографических колонок [27, 94]. В литературе описано определение баклофена методом обращено фазовой ВЭЖХ на неполярных колонках с ультрафиолетовым, флуоресцентным, масс-спектрометрическим или электрохимическим детектором.
Значительное число работ [1, 37, 40-41, 43, 50-51] показывает, что огромное влияние на общие характеристики хроматографического разделения оказывает выбор состава подвижной фазы (ПФ). Последняя состоит из основных и второстепенных компонентов. Второстепенные компоненты ( 5%) обычно носят название модификаторов ПФ. Типичными модификаторами ПФ являются неразбавленные кислоты (фосфорная, трифторуксусная и уксусная) и основания (триэтиламин, триэтаноламин и диэтиламин), а также буферные системы (фосфат, ацетат или смешанные, такие как трифторуксусная кислота/триэтиламин) и ион-парные реагенты.
Одним из важнейших параметров оптимизации селективности в обращено-фазовой ВЭЖХ является рН подвижной фазы. В зависимости от рН элюента изменяется время удерживания слабых кислот.
Действие модификаторов может быть связано с различными физико-химическими процессами. Модификатор может использоваться для подавления ионизации сорбата, что в обращено-фазовой хроматографии приводит к улучшению формы пика. Введение специфического модификатора направляет сорбцию по наиболее выгодному в данном случае механизму. Модификаторы водных и водно-органических подвижных фаз придают элюенту желаемую ионную силу и рН [40]. В качестве ПФ для определения баклофена методом ВЭЖХ используют: метанол – вода (45:55) [69], ацетонитрил – 0,25% раствор уксусной кислоты [95], метанол – фосфатный буфер (36:74) [96], ацетонитрил – 0,05 М KH2PO4 (25:75) [84] и др.
Баклофен может быть определен методом ион-парной хроматографии [67, 79]. Суть метода ион-парной хроматографии заключается в динамическом модифицировании обращено-фазового сорбента (октил-, октадецилсиликагеля) группами, обладающими ионообменными свойствами. Для этих целей в типичные ПФ для обращено-фазовой хроматографии добавляют гидрофобные органические соединения с ионогенными группами. Для разделения оснований используют алкилсульфаты натрия (алкил от С4 до С12) в количестве 0,001-0,01 моль/л, создавая буферным раствором рН 2-5. Для разделения кислот применяют соли тетраалкиламмония (фосфат тетрабутиламмония, бромид цетилтриметиламмония и др.) в концентрациях 0,001-0,01 моль/л и рН 3-7 [37, 40].
Методы исследования, аппаратура и условия
Объектами исследования являлись лекарственный препарат «Баклофен» («Polpharma PW», Польша) таблетки по 10 и 25 мг, полученная из них субстанция баклофена, а также стандартный образец баклофена с чистотой 98% (Sigma, США).
Для изучения методов обнаружения и изолирования баклофена из биологических объектов использовали образцы крови, мочи и тканей печени, предварительно проверенные на отсутствие наркотических и лекарственных веществ, предоставленные Красноярским государственным бюджетным учреждением здравоохранения «Красноярское краевое бюро судебно-медицинской экспертизы» (ККБСМЭ).
Разработанные методики применяли для определения баклофена в реальных образцах крови и мочи, полученных от лиц, поступавших в течение 2013 г в отделение острых отравлений Красноярской межрайонной клинической больницы скорой медицинской помощи №6 им. Н.С. Карповича (КМКБСМП) с предварительным диагнозом отравление лекарственными средствами и клиническими симптомами, характерными для отравления баклофеном, а также от трупов, поступивших в ККБСМЭ с подозрением на отравление баклофеном.
Поскольку состояние пациентов не позволяло выразить свое согласие и в большинстве случаев угрожало их жизни, решение о проведении лечения и взятии биологических жидкостей (крови, мочи) для проведения диагностики принималось консилиумом врачей-токсикологов в соответствии с п.п. 9.1, 10.1 ст. 20 Федерального закона «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации» от 21.11.2011 № 323-ФЗ.
Для определения баклофена в работе использовали следующие методы анализа: - Исследование баклофена методом ГХ/МС проводили в судебно-химическом отделении ККБСМЭ с помощью газового хроматографа Agilent Technologies 6890N (США) с автосамплером Agilent Technologies 7683В и квадрупольным масс-спектрометром Agilent Technologies 5973 Network в качестве детектора. Использовали кварцевую капиллярную колонку НР-5MS (сополимер 5%-дифенил-95%-диметилсилоксана) длиной 30 м, с внутренним диаметром 0.25 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0.25 мкм. Режим программирования температуры колонки: начальная температура термостата колонки 80 0С, экспозиция при начальной температуре 1 мин, далее нагрев до температуры 200 0С со скоростью 40 0С/мин и до температуры 300 0С со скоростью 12.5 0С/мин, экспозиция 10 мин при конечной температуре. В качестве газа-носителя использовали гелий (марка А); скорость потока газа-носителя 1.2 мл/мин (режим постоянного потока). Температура инжектора – 250 0С. Ввод пробы осуществляли с помощью автосамплера в режиме без деления потока (Splitless); объем пробы – 1 мкл. Ионизация электронным ударом (70 эВ). Время задержки растворителя 3.5 мин.
ГХ/МС анализ исследуемых растворов проводили в режиме сканирования (SCAN) в диапазоне масс от 40 до 600 а.е.м., и в режиме селективного ионного мониторинга (SIM) по характеристическим ионам производных баклофена. В качестве характеристических выбирали базовый ион масс-спектра и молекулярный ион анализируемого соединения. При отсутствии в масс-спектре интенсивного молекулярного иона в качестве дополнительного к базовому выбирали фрагментарный ион наибольшей интенсивности. Идентификацию масс-спектров проводили с использованием библиотечных данных MPWTOX7 и Wiley7.
Для уменьшения полярности функциональных групп в молекуле баклофена проводили его дериватизацию уксусным ангидридом в присутствии пиридина по следующей методике. В виалы помещали 10, 20, 100 мкл исходного раствора баклофена в этаноле с концентрацией 1 г/дм3 (п. 6), выпаривали досуха в токе теплого воздуха, прибавляли по 200 мкл смеси уксусный ангидрид – пиридин (3:2), выдерживали в термостате в течение 30 мин при 70 0С. После окончания реакции ацетилирования жидкость выпаривали в токе теплого воздуха, сухой остаток растворяли в 1 мл этилацетата и исследовали методом ГХ/МС.
Получение метилового эфира баклофена проводили следующим образом: к сухому остатку прибавляли 500 мкл безводного ацетона, 40 мкл йодистого метила и 20-25 мг безводного карбоната калия, герметично закрывали и выдерживали в термостате 60 мин при 60 0С. Флакон охлаждали, отбирали жидкую фракцию реакционной смеси, переносили в чистую виалу и испаряли в токе теплого воздуха. Сухой остаток растворяли в 100 мкл этилацетата. - Исследования методом ВЭЖХ-УФ проводили в лаборатории хроматографических методов анализа Центра коллективного пользования Сибирского федерального университета (ЦКП СФУ) с использованием высокоэффективного жидкостного хроматографа Agilent Technologies 1200 (США) с многоволновым диодно-матричным детектором. Условия анализа: колонка Phenomenex Luna 5u C18(2) 100 A, 2504.6 мм, 5 мкм; предколонка Eclipse XDB-C18 4-Pack 4.6x12.5 мм, 5 мкм. Температура термостата колонки 30 0С. Подвижная фаза (ПФ): ацетонитрил – 10мМ триэтиламина, градиентное элюирование, состав подвижной фазы изменялся от 0 до 20% ацетонитрила (таблица 1).
Исследование баклофена методом ГХ/МС
При разработке ВЭЖХ-методики определения баклофена необходимо было подобрать оптимальные условия для максимального отклика системы за минимальное время анализа. С этой целью осуществляли варьирование состава подвижной фазы (ПФ).
Выбор состава ПФ был основан на кислотно-основных свойствах баклофена. Баклофен является амфолитом, так как содержит в молекуле одновременно кислотный и основный центр. Для получения оптимальных параметров удерживания необходимо создание такого значения рН ПФ, при котором молекулы данного вещества будут находиться преимущественно в одной ионной форме, что увеличивает хроматографический отклик и предотвращает размывание хроматографической зоны. Изоэлектрическая точка баклофена находится при значении рН 6.75.
В качестве модификатора ПФ для создания кислых значений рН была выбрана офосфорная кислота, т.к. ее растворы имеют минимальное поглощение в диапазоне длин волн 190-400 нм. Для создания щелочной среды элюента использовали сильное органическое основание - триэтиламин (рКа 10,87). Для стабилизации значения рН водного компонента ПФ использовали: - раствор о-фосфорной кислоты, рН от 1.8 до 5.5; - раствор гидрофосфата калия с о-фосфорной кислотой, рН от 1.8 до 5.5; - фосфатный буферный раствор, рН 8.0; - раствор триэтиламина, рН 9.5 и 7.5. ВЭЖХ-анализ проводили в диапазоне рН 1.8-9.5, соответствующем рабочему диапазону большинства неполярных колонок для обращено-фазового варианта жидкостной хроматографии. Установлено, что спектр раствора баклофена не изменяется в исследуемом диапазоне рН (рис. 14), а при использовании ПФ с рН 1.8 - 5.5 время удерживания баклофена и величина аналитического сигнала практически не изменяются при варьировании состава ПФ и величины рН. Рисунок 14 – УФ-спектр баклофена, полученный в ходе ВЭЖХ-анализа с использованием диодноматричного детектора, С 10 мг/дм3 (максимумы поглощения, нм: 1 – 220; 2 – 259; 3 – 266; 4 – 274) При использовании фосфатного буферного раствора с рН 8.0 время удерживания баклофена приближается (с учетом погрешности) к времени удерживания его при рН 7 (табл. 4). Величина аналитического сигнала незначительно увеличивается при высоких концентрациях баклофена по сравнению с данными, полученными для рН 7. Таблица 4 – Время удерживания баклофена при различных составах подвижных фаз Состав подвижной фазы рН Время удерживания, мин H3P04+K2HP04 2.5 7.42±0.01 Н3Р04 3.5 6.30±0.07 К2НРО4+ Na2HP04 8.0 7.32±0.03 триэтиламин 7.5 7.52±0.02 триэтиламин 9.5 7.53±0.01 Сравнение зависимости площади пика баклофена от его концентрации для различных значений рН представлены на рис. 15. Рисунок 15 – Зависимость площади пика баклофена от его концентрации при различных значениях рН: 1 – 9.5; 2 – 8.0; 3 – 3.5; 4 – 2.5
На основании сравнения зависимости площади пика баклофена от концентрации сделан вывод о том, что самая высокая чувствительность наблюдается при использовании в качестве модификатора ПФ раствора триэтиламина.
Применение в качестве модификатора водного компонента ПФ раствора триэтиламина с рН 9.5 приводит к увеличению аналитического сигнала примерно в 2 раза по сравнению с величиной аналитического сигнала для подвижных фаз с рН 7.
На рис. 16 приведена хроматограмма раствора баклофена, полученная в обращено-фазовом варианте метода жидкостной хроматографии с использованием раствора триэтиламина в качестве модификатора ПФ. Время удерживания баклофена составило 7.53 мин. Валидацию аналитической методики проводили по следующим параметрам: линейность, правильность, повторяемость [7, 38, 39, 48, 75]. Рисунок 16 – Хроматограмма раствора баклофена, =220 нм, С=20 мг/дм3, подвижная фаза: ацетонитрил – раствор триэтиламина, рН 9.5 Линейность градуировочной зависимости доказана в диапазоне концентраций от 0.5 до 50 мг/дм3 (рис. 17). Уравнение зависимости аналитического сигнала от концентрации баклофена имеет вид следующего уравнения y = 32.9867x – 22.2277, а коэффициент корреляции составляет 0.9995.
Градуировочный график количественного определения баклофена методом ВЭЖХ Проверку правильности методики проводили методом «введено-найдено» по девяти концентрационным уровням градуировочного графика в трех параллельных измерениях (табл. 5). Согласно представленным данным (табл. 5) отклонение от истинного значения составляет от 1.2 до 5.0%.
Обнаружение баклофена во внутренних органах методом ГХ/МС с применением методики пробоподготовки QuEChERS
Пробоподготовку образцов крови для исследования методом ВЭЖХ МС/МС проводили следующим образом: к 1 мл крови прибавляли 50 мкл водного раствора внутреннего стандарта фенибута (концентрация 0.001 г/дм3, РУП «БЕЛМЕДПРЕПАРАТЫ»), 2-3 капли 50%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, выдерживали на шейкере (S-3.02М, Латвия) 15 мин, затем центрифугировали в течение 15 мин при скорости 4000 об/мин (центрифуга типа ОПн-8, ротор РУ180Л, Россия). 20 мкл надосадочного слоя переносили в виалу и добавляли 980 мкл дистиллированной воды. При превышении концентрации баклофена верхней границы градуировочного графика в реальных образцах крови применяли прием разбавления.
Для построения градуировочного графика использовали трупную кровь, предварительно проверенную на отсутствие лекарственных веществ. Пробоподготовку образцов крови для построения градуировочного графика проводили следующим образом: по 1 мл крови помещали в стеклянные флаконы объемом 15 мл, прибавляли по 5, 10, 25, 50, 75, 100 мкл водного раствора баклофена (Sigma, США) с концентрацией 0.01 г/дм3, перемешивали, далее проводили пробоподготовку аналогично исследуемым образцам. Для получения более высоких концентраций баклофена в крови (0.0015, 0.002, 0.0025, 0.003 и 0.004 г/дм3) использовали водный раствор баклофена с концентрацией 0.1 г/дм3. Идентификацию пика баклофена проводили по времени удерживания заданных пар ионов (родительский ион – дочерний ион). При параметрах анализа, определенных для модельных растворов баклофена, время удерживания баклофена составило 3.59 мин, а фенибута – 2.95 мин (рис. 26). Определение концентрации баклофена проводили по наиболее интенсивному отклику пары ионов с m/z 214 151, отношение к площади пика внутреннего стандарта проводили по наиболее интенсивному отклику пары ионов фенибута с m/z 180 163.
Ввиду высокой селективности метода за счет МRM режима методика пробоподготовки заключается в осаждении белков и эритроцитов с помощью трихлоруксусной кислоты, дополнительной очистки не требуется, зато потребовалось дополнительное разведение из-за высокой чувствительности метода.
Метрологическую оценку пригодности методики проводили аналогично как в случае с методикой для мочи по показателям специфичность, линейность, правильность, повторяемость, предел обнаружения, предел количественного определения. Специфичность методики подтверждали отсутствием пиков эндогенных соединений в месте элюирования баклофена, хроматограмма образца крови, не содержащей баклофен, приведена на рис. 27. Из рисунков видно, что методика отличается высокой специфичностью, что подтверждается отсутствием пиков эндогенных соединений в месте элюирования баклофена.
Предел количественного определения баклофена в крови составил 5 мкг/дм3, который рассчитывали как наименьшую концентрацию баклофена, при которой отношение сигнал – шум составляло 10:1.
Линейность градуировочного графика для определения баклофена в крови доказана в диапазоне концентраций от 50 до 4000 мкг/дм3 (рис. 28), который можно определить как аналитическую область методики. Уравнение зависимости аналитического сигнала от концентрации баклофена в крови имеет вид y = 0.0232 x + 0.0931, коэффициент корреляции 0.9997.
Для оценки повторяемости методики проводили 5-кратное количественное определение баклофена в модельном образце крови, содержащем 100 мкг/дм3 баклофена (табл. 11). Таким образом, разработанная методика количественного определения баклофена в крови характеризуется специфичностью, линейностью, правильностью, повторяемостью, низким пределом количественного определения и небольшим временем проведения анализа. Преимущества методики количественного определения баклофена в моче представлены в табл. Характеристика методики За счет чего достигается эффект экспрессность - минимальное число операций припробоподготовке;- наименьшее время ВЭЖХ-анализа за счетподобранных условий (до 5 мин) высокая специфичность,полное отсутствие мешающеговлияния - использование масс-спектрометра стройным квадруполем в качестведетектора;- подбор параметров MRM-режима низкий предел количественного определения - использование MRM-режима работы масс-спектрометра с тройным квадруполем
В СХИ и ХТА часто возникают задачи анализа биологических объектов, направленных от лиц с отравлением неизвестным веществом. Для принятия во внимание возможное отравление баклофеном необходимо проводить исследование с учетом методик, подходящих для обнаружения, идентификации и количественного определения баклофеном. Объекты: кровь, моча, органы Скрининг мочи методом ГХ/МС после кислотного гидролиза и дериватизации (ацетилирования) При отрицательном результате скрининга на баклофена -исключение других лекарственных и наркотических веществ Положительный результат скрининга на баклофен (обнаружение маркеров) Количественное определение баклофена в крови методом ВЭЖХ-МС/МС Количественное определение баклофена в моче методом ВЭЖХ-УФ Идентификация баклофена в экстрактах органов методом ГХ/МС