ИССЛЕДОВАНИЯ В ОБЛАСТИ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ DART И ЕЁ СОЧЕТАНИЯ С ПЛАНАРНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ. БЫСТРЫЙ СКРИНИНГ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ Чернецова Елена Сергеевна

Введение к работе

Актуальность темы

Актуальной является разработка универсальных и экспрессных подходов к анализу лекарственных средств (ЛС) для обеспечения высокой производительности анализов, необходимой как для проведения быстрого скрининга фармацевтических препаратов для обнаружения фальсификатов, так и для контроля качества ЛС. Различают несколько видов фальсификации ЛС: препараты, не содержащие активное вещество; препараты, содержащие недостаточное количество активного вещества; препараты, содержащие другое активное вещество (не соответствующее указанному в маркировке); а также препараты, содержащие загрязняющие или токсические вещества. Содержание активного вещества в ЛС чаще всего определяют методом ВЭЖХ (после предварительной экстракции), титриметрией или другими аналитическими методами, требующими использования специальных условий селективного определения. Во всех этих случаях необходимы соответствующие образцы сравнения определяемых соединений.

Для экспрессного анализа ряда фармацевтических субстанций и таблеток определенными преимуществами обладает метод инфракрасной спектроскопии в ближнем диапазоне (БИКС), для которой пробоподготовка минимальна и не требуется использование растворителей. При этом для однозначной интерпретации регистрируемых спектров, состоящих из широких полос, необходимо иметь библиотеку спектров сравнения, что приводит к затруднениям в случае отсутствия необходимого спектра в базе данных. Методы масс-спектрометрии (МС) более привлекательны с точки зрения однозначности интерпретации данных. Существует необходимость разработки новых подходов к качественному и количественному анализу таких объектов, как субстанции лекарственных веществ, таблетки, капсулы, мази, суппозитории и различные виды природных ЛС. Интерес представляет не только контроль заданных аналитов, но и идентификация неизвестных компонентов, а также рассмотрение сигналов соединений-маркеров в качестве «отпечатков пальцев» для классификации и исследования состава объектов.

Одним из новых способов ионизации для масс-спектрометрии является «прямой анализ в режиме реального времени» (Direct Analysis in Real Time, DART), появившийся в 2005 году , и название которого подобрано специально для ассоциации со словом «дротик» (dart - англ.), чтобы подчеркнуть экспрессность метода. Во второй половине 2013 года ионизацию DART попытались описать названием, описывающим суть метода - «химическая ионизация при атмосферном давлении, индуцированная термодесорбцией и ионизацией Пеннинга» (thermal desorption Penning ioni-zation-induced atmospheric pressure chemical ionization, или TDPIIAPCI)^Z, которое представляется не вполне удачным. В связи со сложностью и недостаточной изученностью механизмов DART и для однозначности сопоставления с литературными данными, в данной работе придерживаемся устоявшегося в литературе названия.

¹ Cody КВ., Laramee J.A., Durst H.D. Versatile new ion source for the analysis of materials in open air under
ambient conditions II Anal. Chem. 2005. V. 77. № 8. P. 2297 - 2303.

² J.H. Gross. Direct analysis in real time - a critical review on DART-MS II Anal. Bioanal. Chem, статья
опубликована на странице журнала в Интернет 15 сентября 2013 г. DOI: 10.1007/s00216-013-7316-0.

Особенностью масс-спектрометрии DART является возможность анализа жидких и твердых объектов без пробоподготовки и хроматографирования, что делает масс-спектрометрию DART привлекательной для идентификации и определения состава органических компонентов различных объектов, в том числе для анализа ЛС. В связи с новизной метода его достоинства и ограничения малоизвестны, а способы улучшения аналитических возможностей малоизучены. Для DART важна эффективная десорбция аналитов, поэтому свойства матрицы образца и особенности его поверхности влияют на факторы откликов аналитов. Описанные в первых работах о DART возможности анализа любых твердых и жидких образцов в отсутствие пробоподготовки в действительности не так широки, как это представлялось в первых публикациях. Они зависят от типа матрицы, конфигурации масс-спектрометра, а также от способа подачи образца и его позиционирования по отношению к источнику DART и входу в масс-анализатор. До начала данного исследования практически все опубликованные данные были получены с использованием одной и той же модели времяпролетного масс-спектрометра. Ограничением масс-спектрометрии DART является сравнительно невысокая чувствительность, но возможности преодоления этого ограничения за счет использования простых быстрых способов концентрирования были мало изучены. Отсутствовали литературные данные о возможностях повышения селективности идентификации компонентов сложных смесей за счет сочетания DART с масс-анализатором на основе орбитальной ионной ловушки и с тонкослойной хроматографией (ТСХ). Не были изучены достоинства и ограничения сочетания масс-спектрометрии DART и ТСХ в режиме сканирования пластин. Возможность экспрессной идентификации активного компонента фармацевтических субстанций была показана только на небольшом числе примеров - на наркотических субстанциях и антималярийных препаратах. При этом проводили качественный анализ, и не предложен способ, который позволил бы проводить следующую стадию скрининга для быстрого определения содержания активного компонента в отсутствие образцов сравнения - в чем, с нашей точки зрения, органический элементный анализ (ОЭА) может хорошо дополнить метод масс-спектрометрии DART.

Актуальным являлось исследование возможностей и ограничений масс-спектрометрии DART и поиск способов минимизации ограничений, в том числе снижение пределов обнаружения по концентрации. Особый интерес представляло изучение возможности повышения селективности идентификации компонентов сложных смесей за счет сочетания масс-спектрометрии DART с ТСХ online и offline, а также за счет сочетания с орбитальной ионной ловушкой. Большой практический интерес представляла разработка новых подходов для решения различных задач фармацевтического анализа, основанных на масс-спектрометрии DART и ее сочетании с ТСХ и ОЭА.

Цель и задачи работы

В связи с этим, целью работы являлась разработка новых подходов к экспрессному анализу лекарственных средств, основанных на масс-спектрометрии DART и ее сочетании с ТСХ, а также на органическом элементном анализе.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить масс-спектры DART широкого круга органических соединений различных классов и выбрать критерии оптимизации условий анализа методом масс-спектрометрии DART.

2. Разработать способ обнаружения следовых концентраций органических соединений методом масс-спектрометрии DART, основанный на концентрировании аналитов с удалением растворителя из раствора (экстракта) и анализе всего концентрата.

3. Разработать способ межлабораторного анализа, основанный на концентрировании аналитов на подложке и анализе концентрата методом масс-спектрометрии DART.

4. С целью обеспечения возможности сочетания масс-спектрометрии DART и ТСХ, разработать способ визуального определения точки фокусирования ионизирующего потока из источника DART на поверхности объекта исследования для повышения воспроизводимости результатов анализа за счет улучшения позиционирования пробы в области ионизации.

5. Разработать способ сканирования различных подложек и ТСХ-пластин методом масс-спектрометрии DART, исследовать возможности и ограничения сочетания масс-спектрометрии DART с ТСХ online и offline.

6. Разработать быстрый и универсальный способ определения содержания активного компонента лекарственных препаратов и субстанций при использовании ОЭА, в целях дополнения возможностей масс-спектрометрии DART для количественного анализа.

7. Разработать методологию быстрого контроля проб лекарственных препаратов на фальсификаты, основанную на масс-спектрометрии DART низкого и высокого разрешения и ОЭА, и методологию анализа природных ЛС, основанную на масс-спектрометрии DART и ее сочетании с ТСХ.

Научная новизна

8. Изучены масс-спектры DART широкого круга органических соединений различных классов (алифатические и ароматические углеводороды, спирты, карбоновые кислоты, аминокислоты, сахара, гетероциклические соединения) и показана зависимость их состава от условий эксперимента. Выбраны критерии оптимизации условий анализа в зависимости от аналитов и параметров эксперимента.

9. На основании проведенных исследований предложен способ снижения пределов обнаружения по концентрации для масс-спектрометрии DART на 2 порядка и более. Способ основан на концентрировании аналитов из больших проб органических растворов и анализе концентрата, свободного от растворителя, методом масс-спектрометрии DART.

10. Исследована возможность и разработаны способы использования подложек, изготовленных из различных материалов, для анализа методом масс-спектрометрии DART с предварительным удалением растворителя для обеспечения отбора проб на месте контроля и транспортировки к анализатору.

4. Разработаны способы визуального определения точки фокусирования (визуализации) ионизирующего потока из источника DART на поверхности объекта исследования. Эти способы позволили впервые разработать способ сканирования поверхностей методом масс-спектрометрии DART и существенно увеличить воспроизводимость анализа методом масс-спектрометрии DART и при его сочетании с ТСХ.

5. Разработанные новые способы анализа, основанные на сочетании масс-спектрометрии DART с ТСХ online и offline позволяют проводить одновременную регистрацию десятков соединений в идентичных условиях и увеличить достоверность идентификации компонентов сложных смесей.

6. Показана возможность быстрого обнаружения активного компонента в лекарственных препаратах (субстанции, капсулы, таблетки, суппозитории, мази) при анализе методом масс-спектрометрии DART низкого и высокого разрешения.

7. Разработан быстрый и универсальный способ определения содержания активного компонента в различных лекарственных препаратах (субстанции, капсулы, таблетки, растворы в ампулах), основанный на ОЭА. Показана высокая точность определения, соответствующая или превосходящая общепринятые методы. Способ не требует использования образцов сравнения аналитов, как и способ обнаружения активных компонентов ЛС методом масс-спектрометрии DART.

8. С использованием разработанных подходов, основанных на масс-спектрометрии DART низкого и высокого разрешения и его сочетании с ТСХ, исследован состав примесей, характеризующих качество таких природных ЛС, как прополис, бадан и мед. Показана возможность быстрого контроля качества проб благодаря одновременной регистрации десятков соединений, в отличие от общепринятых методов анализа.

9. Разработана методология экспрессного определения качества лекарственных препаратов и субстанций, основанная на масс-спектрометрии DART низкого и высокого разрешения и органическом элементном анализе, позволяющая решить проблему быстрого обнаружения фальсификатов, а также методология быстрого контроля качества природных ЛС, основанная на масс-спектрометрии DART и ее сочетании с ТСХ.

Практическая значимость

1. Полученные данные о составе масс-спектров DART и их зависимости от условий эксперимента для широкого круга органических соединений различных классов позволяют сделать выводы о возможностях и ограничениях масс-спектрометрии DART и выявить критерии выбора условий анализа различных объектов.

2. Разработанные способы концентрирования растворов (экстрактов) расширяют возможности масс-спектрометрии DART для обнаружения аналитов на уровне следов и перспективны для решения ряда задач в фармацевтическом анализе, контроле качества лекарственных препаратов и продуктов питания и в идентификации компонентов других объектов сложного состава.

3. Предложен способ анализа, обеспечивающий возможность осуществления оперативного контроля благодаря отбору проб на месте контроля и транспортировке к анализатору, основанный на анализе концентратов с различных подложек методом масс-спектрометрии DART.

4. Разработанные способы визуализации ионизирующего потока из источника DART на объекте исследования и основанный на них способ сканирования объектов позволяют расширить существующие способы подачи пробы в масс-спектрометрии DART, исследовать ограничения ее сочетания с ТСХ online и существенно увеличить воспроизводимость анализа методом масс-спектрометрии DART.

5. Разработанный подход к скринингу мёда на 5-оксиметилфурфурол позволяет повысить производительность анализов в 10-15 раз, что важно для эффективного контроля качества.

6. На основании анализа более 100 образцов прополиса, собранных в различных регионах, разработан новый подход к классификации образцов прополиса, основанный на обнаружении фенольных соединений при совместном использовании масс-спектрометрии DART и ТСХ.

7. Благодаря масс-спектрометрии DART и ее сочетанию с ТСХ получены новые данные о составе экстрактов прополиса и бадана, имеющие значение для оценки качества и их целебных свойств. Показана перспективность разработанных подходов для быстрой характеристики качества природных лекарственных средств и их составляющих.

8. Разработанная методология скрининга активного вещества в лекарственных препаратах и субстанциях методами масс-спектрометрии DART и ОЭА обеспечивает быстрый контроль на фальсификаты и некачественные образцы в отсутствие образцов сравнения аналитов.

9. Разработанная методология анализа природных Л С, основанная на масс-спектрометрии DART и ТСХ, обеспечивает возможность быстрого сопоставления объектов исследования по многомерным признакам и обнаружения примесей, определяющих качество продукции. Разработанные подходы к классификации и идентификации ключевых компонентов растительного сырья перспективны для быстрого установления его происхождения, что важно для контроля качества препаратов на его основе и для быстрого анализа неизвестного растительного сырья, например, при криминалистической экспертизе.

Положения, выносимые на защиту

1. Данные изучения состава масс-спектров и критерии оптимизации условий анализа методом масс-спектрометрии DART в зависимости от аналитов и параметров эксперимента.

2. Способ снижения пределов обнаружения по концентрации для масс-спектрометрии DART на 2 порядка и более. Способ основан на концентрировании больших проб органических растворов и прямом анализе всего концентрата аналитов методом масс-спектрометрии DART.

3. Способ анализа методом масс-спектрометрии DART органических растворов (экстрактов), нанесенных на подложки из различных материалов, обеспечивающий возможность оперативного контроля благодаря отбору проб на месте контроля и транспортировке к анализатору.

4. Способы увеличения воспроизводимости анализа благодаря визуализации ионизирующего потока из источника DART на поверхности объекта исследования.

5. Новые способы анализа, основанные на сочетании масс-спектрометрии DART с ТСХ online и offline, включая впервые разработанный способ сканирования поверхностей.

6. Способ быстрого обнаружения активного компонента в органических субстанциях и лекарственных препаратах при использовании подходов, основанных на масс-спектрометрии DART низкого и высокого разрешения.

7. Способ быстрого определения содержания активного компонента в различных лекарственных препаратах (субстанции, капсулы, таблетки, растворы в ампулах), основанный на ОЭА, не требующий использования образцов сравнения аналитов.

8. Новые способы изучения состава природных ЛС при использовании подходов, основанных на масс-спектрометрии DART и ее сочетании с ТСХ.

9. Методология экспрессного определения качества лекарственных препаратов и субстанций, основанная на масс-спектрометрии DART низкого и высокого разрешения и органическом элементном анализе, а также методология быстрого контроля качества природных ЛС, основанная на масс-спектрометрии DART и ее сочетании с ТСХ.

Апробация работы и публикации

Работа частично выполнена в рамках следующих научных проектов: проект Международного научно-технического центра №2829 "Investigation of analytical approaches to determine the authenticity/quality of pharmaceutical products to improve the public health by identifying counterfeit and ineffective products" (2004-2006); грант Президента Российской Федерации МК-594.2010.3 «Масс-спектромет-рия DART: новый метод определения органических соединений в различных объектах без пробоподготовки и сопоставительная оценка возможности его использования для анализа лекарственных препаратов и биологических объектов» (2010-2011); совместный проект №2.2.2.3/9055 «Новые подходы к анализу препаратов природного происхождения, основанные на использовании плоскостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией» аналитической ведомственной целевой программы "Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 годы)" и программы Немецкой службы академических обменов (Deutscher Akademischer Austausch Dienst, DAAD) «Михаил Ломоносов» (2010-2011); совместный проект №15112 «Сочетание плоскостной хроматографии с масс-спектрометрией: новые подходы к анализу биологических образцов» аналитической ведомственной целевой программы "Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2011 годы)" и программы DAAD «Михаил Ломоносов» (2011); проект №C-2011b-xl Немецко-российского междисциплинарного научного центра (German-Russian Interdisciplinary Science Center, G-RISC) "Ion Formation in DART Mass Spectrometry"

(2011); проект «New hyphenated approaches for determination of phytochemicals in medicinal herbs using HPTLC/UV/Vis/FLD/HPLC/MS and bioassay-based detection» программы международного обмена между Россией и странами Евросоюза "Erasmus Mundus Action 2 - Partnerships II Project IAMONET-RU (Lot 5)" (2011-2012), и проект №2.1.2.1. Программы стратегического развития РУДЫ на 2012-2016 г.г. «Инновационные технологии мониторинга экзогенных веществ, биомаркеров и супертоксикантов в объектах окружающей среды и биофлюидах человека и животных».

Основные результаты диссертационной работы опубликованы в более чем 50 тезисах докладов. Результаты исследований представлены на следующих международных и российских конференциях и симпозиумах, в том числе сделано 4 выступления в качестве приглашенного докладчика (выделены подчеркиванием):

28-м Международном симпозиуме по капиллярной хроматографии и электрофорезу (Лас Вегас, США, 2005); 1-й Конференции ВВВВ по фармацевтическим наукам (Сиофок, Венгрия, 2005); Международном конгрессе ICAS-2006 (Москва, Россия, 2006); Международной конференции «Biocatalysis-2007: Fundamentals and Applications» (Москва - Санкт-Петербург, Россия, 2007); Всероссийском научно-практическом семинаре «Методы и приборное обеспечение для агропромышленного комплекса и пищевой промышленности» (Москва, Россия, 2009); III Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения - 2009» (Санкт-Петербург, Россия, 2009);

II Международном симпозиуме по сорбции и экстракции с заочным участием
(Владивосток, Россия, 2009); III Всероссийской конференции с международным
участием «Аналитика России» (Краснодар, Россия, 2009); 11-й Международной
конференции ISMAS по масс-спектрометрии (Хайдерабад, Индия, 2009);

III Всероссийской конференции с международным участием «Масс-спектрометрия
и ее прикладные проблемы» (Москва, Россия, 2009); Съезде аналитиков России
"Аналитическая химия - новые методы и возможности" (Москва, Россия, 2010);
Всероссийской конференции «Хроматография - народному хозяйству»
(Дзержинск, Россия, 2010) 11-м Международном симпозиуме по гибридным
методам в хроматографии и гибридным хроматографическим анализаторам
НТС-11 (Брюгге, Бельгия, 2010); 4-й Всероссийской конференции с элементами
научной школы для молодежи «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и
ее аналитические применения» (Звенигород, Россия, 2010); Международной
научной конференции по аналитической химии и экологии (Алматы, Казахстан,
2010); 28-м Международном симпозиуме по хроматографии (Валенсия, Испания,
2010); Съезде Британского сообщества по масс-спектрометрии (Кардифф,
Великобритания, 2010); 1-й Международной академической конференции молодых
ученых "Chemistry and Chemical Technology 2010" (Львов, Украина, 2010); Съезде
пищевых химиков Германии "Deutscher Lebensmittelchemikertag" (Халле, Германия,
2011); Съезде немецкого сообщества специалистов по пищевой химии
"Lebensmittelchemische Gesellschaft. Fachgruppe in der Gesellschaft Deutscher
Chemiker. Regionalverbande Nord & Stid-West. Gemeinsame Arbeitstagung 2011"
(Кассель, Германия, 2011); Конференции "ANAKON 2011" (Цюрих, Швейцария,
2011); 13-м Весеннем симпозиуме молодых химиков Немецкого химического
сообщества 2011 (Эрланген, Гермнаия, 2011); 36-м Международном симпозиуме
"HPLC 2011" (Будапешт, Венгрия, 2011); 9-й Международной конференции по

масс-спектрометрии "PETROMASS 2011" (Москва, Россия, 2011); 5-м Международном симпозиуме по анализу продуктов питания "RAFA-2011" (Прага, Чехия, 2011); 2-м научном семинаре FCUB-ERA "Food chemistry and biotechnology" (Белград, Сербия, 2011); Европейской конференции по аналитической химии "EuroAnalysis XVI" (Белград, Сербия, 2011); IV-й Всероссийской конференции с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы» (Москва, Россия, 2011); Международном симпозиуме по высокоэффективной тонкослойной хроматографии (Базель, Швейцария, 2011); XXXIV симпозиуме "Chromatographic Methods of Investigating the Organic Compounds" (Катовице -Шчырк, Польша, 2011); Европейской зимней конференции по спектрохимии плазмы (Сарагоса, Испания, 2011); 1-м Европейском научном семинаре "European Workshop on Ambient Mass Spectrometry and Related Mass Spectrometry-Based Techniques in Food I Natural Products Control: Safety, Authenticity, Forensics, Metabolomics" (Прага, Чехия, 2012); 8-м Зимнем симпозиуме по хемометрике "Modern Methods of Data Analysis" (Дракино, Россия, 2012); Российско-Немецком коллоквиуме общества Гумбольдта "Die Rolle der Grundlagenwissenschaften in der Gesellschaft" (Москва, Россия, 2012); Международной конференции по масс-спектрометрии NVMS - BSMS (Ролдук, Нидерланды, 2012); XVI Международном конгрессе "PHYTOPHARM 2012" (Санкт-Петербург, Россия, 2012); Совместной конференции немецкого и польского сообществ по масс-спектрометрии (Познань, Польша, 2012); 9-й Всероссийской конференции «Химия фтора» (Москва, Россия, 2012); 13-й Европейской конференции по химии объектов окружающей среды (Москва, Россия, 2012).

По материалам работы опубликовано 30 статей в рецензируемых журналах, в том числе 6 обзоров.

Вклад автора в работы, выполненные в соавторстве и включённые в диссертацию, состоит в формулировании направления исследования и общей постановке задач, непосредственном участии в экспериментальных исследованиях и апробации их результатов, творческом участии на всех этапах исследований, в обсуждении, интерпретации, обработке, обобщении и оформлении результатов исследований, а также в подготовке основных публикаций по теме диссертации.

Структура и объём работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5-й глав с обсуждением полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 192 страницах текста, содержит 24 таблицы и 44 рисунка. Список цитируемой литературы содержит 305 наименований.

Похожие диссертации на ИССЛЕДОВАНИЯ В ОБЛАСТИ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ DART И ЕЁ СОЧЕТАНИЯ С ПЛАНАРНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ. БЫСТРЫЙ СКРИНИНГ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Обнаружение F-,Cl-,Br- и S-содержащих органических соединений на уровне следов в сельскохозяйственной продукции и лекарственных средствах, основанное на сочетании высокотемпературной окислительной конверсии и ионной хроматографииНикошина, Анна Валентиновна

Исследование и устранение неспектральных помех при анализе биологических жидкостей и лекарственных средств методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмойОсипов Константин

Идентификация следовых количеств компонентов сложных смесей методами хромато-масс-спектрометрии и тандемной хромато-масс-спектрометрииВирюс Эдуард Даниэлевич

Анализ фармацевтических веществ методами газовой хромато-масс-спектрометрии и капиллярной хромадистилляции-масс-спектрометрииГуляев, Иван Владимирович

Определение газообразующих примесей в твердых веществах методом времяпролетной лазерной масс-спектрометрии на тандемном лазерном масс-рефлектронеОвчинников Дмитрий Константинович

Модель импульсного тлеющего разряда как источника ионов для масс-спектрометрииВоронов Максим Викторович

Учет экспериментальных погрешностей в информационно-поисковой системе по масс-спектрометрии и разработка на этой основе методов решения типичных аналитических задачПокровский, Леонид Михайлович

Идентификация органических соединений в пробе неизвестного состава методами хромато-масс-спектрометрии и хромато-икфурье спектроскопииСавельева, Елена Игоревна

Изотопный и элементный анализ изотопно-обогащенных твердых высокочистых веществ методом лазерной масс-спектрометрииПотапов Александр Михайлович

Модель импульсного тлеющего разряда как источника ионов для масс-спектрометрии Воронов Максим Викторович