Содержание к диссертации
Введение
1 Аналитический обзор 9
1.1 Органические кислоты как основной компонент вин, определяющий их качество 9
1.2 Теория и практика применения кулонометрических методов анализа при титровании кислот 19
1.3 Классификация кулонометрических методов анализа 21
1.4 Титрование кислот кулонометрически генерированным основанием 22
2 Экспериментальная часть 26
2.1 Автоматизация метода определения титруемых органических кислот в винах и соках на установке, совмещающей потенциометрию и кулонометрию 26
2.2 Структура димеров монокарбоновых кислот в водных растворах .41
2.3 Протолитические равновесия в водных растворах при образовании объёмных бициклов некоторых многоосновных органических кислот 53
3 Анализ экспериментальных данных и построение математической модели 71
3.1 Анализ экспериментальных данных 71
3.2 Результаты исследования, их анализ и обсуждение 76
3.2.1 Обработка и оформление результатов измерений 76
3.2.2 Определение подлинности вина 79
3.2.3 Общее содержание катионов щелочных и щелочноземельных металлов 84
3.2.4 Определение суммы аминокислот 85
Выводы 89
Список литературы 90
Приложение А 1
- Классификация кулонометрических методов анализа
- Титрование кислот кулонометрически генерированным основанием
- Структура димеров монокарбоновых кислот в водных растворах
- Обработка и оформление результатов измерений
Классификация кулонометрических методов анализа
Достаточно сложным является переход -кетоглутаровой кислоты в сукцинил-КоА, а затем в янтарную кислоту в присутствии гуанизиндифосфата и фосфора.
Янтарная кислота превращается под действием сукциндегидрогеназы в фумаровую, которая гидратируется в присутствии фумаразы в яблочную кислоту. На последнем этапе яблочная кислота дегидрируется под действием маликодегидрогеназы в щавелевоуксусную кислоту. Затем данный цикл замыкается. При каждом превращении отщепляются три молекулы и пять пар водородных атомов, которые получает цитохромоксидазная система для окисления в воду, при этом клетка получает энергию.
Кратко процесс окисления пировиноградной кислоты можно представить, как: В результате окисления молекулы пировиноградной кислоты по циклу Кребса выделяется свободная энергия, которая равна 889,5 кДж/моль.
С помощью цикла Кребса осуществляется окисление не только продуктов распада углеводов, но и жиров, белков. Как видно из цикла ди- и трикарбоксильных кислот, продукты распада белков – аминокислоты входят в этот цикл. В результате прямого аминирования из кетокислот, пировиноградной, щавелевоуксусной, -кетоглутаровой, образуются следующие аминокислоты: аланин, аспарагиновая, глютаминовая кислоты, гистидин, аргинин, тирозин, фениналанин.
Таким образом, при превращении отдельных органических кислот образуются различные продукты, т.е. углеводный и белковый обмен связываются в одно целое.
Установлено, что содержание кислот и сахаров в стеблях и листьях на протяжении срока вегетации неравномерно и колеблется в зависимости от возраста листьев. Чем моложе лист, тем больше его кислотность и меньше сахаристость. По мере старения листа кислотность уменьшается, а сахаристость увеличивается. Присутствуют две максимальные точки накопления кислот: в молодых листьях и в начале созревания ягод [17].
В ягодах количество винной кислоты бывает максимальным в июле и сильно снижается в октябре. Содержание винной кислоты в листьях и стеблях в период с июля по октябрь не претерпевает изменений. Содержание яблочной кислоты в ягодах практически такое же, как и винной, однако в листьях ее содержание меньше. Характер колебания количества яблочной кислоты такой, как и винной. Установлено, что лимонная кислота в ягодах, листьях и стеблях винограда находится в количестве от 0 до 0,5% и это содержание не претерпевает практически никаких колебаний [24].
Согласно многим данным, посвящённым изучению данных о содержании органических кислот в винограде на протяжении срока вегетации показано, что в августе и сентябре основные кислоты - это винная и яблочная. Наибольшее содержание яблочной кислоты в августе составляет в листьях и наименьшее в ягодах. Наибольшее значение по содержанию винной и лимонной кислот в виноградной лозе приходится на августе и сентябрь. В этот же промежуток времени в черенках листьев наблюдается образование винной кислоты. Количество фумаровой и глицериновой кислот больше в виноградном листе, чем в других частях растения.
Процесс дыхания во время созревания ягод очень интенсивен, содержание кислот в винограде в это время составляет от 3,0 до 5,0%. В начале созревания, когда дыхание ослабевает, сахар расходуется меньше, новообразование кислот замедляется, и частично кислоты снова могут восстанавливаться в сахара. В конце срока вегетации для винограда в целом характерен переход от интенсивного кислотообразования к сахаронакоплению.
В работе [31] отмечено, что исследованиями как качественного, так и количественного состава винограда в процессе вегетации занимались такие ученые, как Н.М. Сисакян, И.А. Егоров, Б.Л. Африкян, В.В. Вильямс, Е.Е. Елецкий. На основе сводных данных [31] видно, что особенно резкое уменьшение содержания винной и яблочной кислот наблюдается в процессе созревания винограда, причём содержание яблочной снижается более интенсивно. По мнению авторов [31], при созревании винограда яблочная кислота более заметно, чем винная участвует в процессах дыхания. Немного уменьшается количество янтарной, щавелевой и пировиноградной кислот, количество же лимонной кислоты в процессе созревания все время увеличивается, хотя незначительно. В винограде технической зрелости количество лимонной кислоты достигает максимального значения (0,41 г на 1 кг винограда), а содержание всех остальных кислот убывает: яблочной – до 4,15, винной – до 6,35, янтарной – до 0,115, щавелевой – до 0,115 г на 1 кг винограда [31].
В стадии физиологической зрелости винограда наблюдается дальнейшее уменьшение количества винной, яблочной, янтарной и щавелевой кислот. Содержание винной кислоты в ходе созревания винограда сорта Алиготе уменьшается с 13,3 до 4,05, яблочной - с 13,75 до 2,05 г на 1 кг винограда, содержание янтарной, щавелевой, пировиноградной кислоты уменьшается незначительно [31].
Соотношение винной и яблочной кислот меняется в процессе созревания винограда. У зелёного винограда это соотношение составляет приблизительно 1:1 и в ходе созревания винограда повышается. Данное соотношение в винограде технической зрелости не превышает 1,5:1, как видно из данных рисунка 2, построенного нами по данным [31].
Титрование кислот кулонометрически генерированным основанием
Растворы кислот готовили из реактивов не ниже квалификации ч.д.а. на бидистиллированной воде, хранящейся под слоем азота для исключения попадания углекислого газа. Величину рН раствора в процессе титрования кулонометрически генерированным основанием измеряли с помощью анализатора жидкости стандартной точности (модели "Эксперт-001-3(0.1)", "Эксперт-001-3(0.4)") в электрохимической ячейке, состоящей из термостатированного стакана, лабораторного комбинированного pH-электрода общего назначения марки ЭСК-10307. В ячейку помещались генерирующие электроды (графитовый катод и серебряный анод) и с помощью источника постоянного тока Б5 – 49 задавался необходимый ток генерации.
Массовые концентрации катионов щелочных и щёлочноземельных металлов и аминокислот определяли методом электрофоретического разделения на приборе для капиллярного электрофореза «Капель-105» по разработанным в ГНУ СКЗНИИСиВ методикам. Титруемую кислотность в виноматериалах находили по ГОСТ Р 51621-2000 [79].
Математическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью персонального компьютера в математическом пакете Mathcad. Одномолярный фоновый раствор хлористого калия готовили следующим образом: необходимую навеску квалификации х.ч. увлажняли небольшим количеством соляной кислоты для разрушения карбонатов, затем высушивали и прокаливали в муфельной печи до постоянного веса при температуре 200 С для удаления избытка . Рабочий раствор готовили непосредственно перед работой на дистиллированной воде, свободной от углекислого газа. Раствор перемешивали воздухом, свободным от углекислого газа. То, что в процессе титрования не происходило разбавления титранта, упрощало расчёты и уменьшало вероятность влияния угольной кислоты. При титровании в среде постороннего электролита с постоянной ионной силой раствора коэффициенты активности находили по калибровке соляной кислотой. В некоторых случаях вначале определяли смешанные константы, то есть принимали в первом приближении, что . Применяли химически чистые кислоты.
Для подтверждения правильности сделанных выводов, в обсуждении результатов диссертации, использованы справочные данные и работы других авторов. Кроме того, при анализе ряда выдвинутых положений использованы литературные данные по строению кристаллической решетки рассматриваемых кислот.
Для автоматизации опытов была использована экспериментальная установка как для разового потенциометрического титрования одной пробы, так и для одновременного титрования нескольких проб с кулонометрической генерацией основания.
Комплекс кулонометрического титрования кислот с автоматической записью кривых титрования создан на базе анализатора жидкости «ЭКСПЕРТ-001», персонального компьютера, источника стабилизированного тока и специальной ячейки.
Ячейка состоит из серебряного анода и графитового катода, в ней нет диафрагмы, разделяющей катодное и анодное пространство. На аноде выделяется осадок хлорида серебра, который выполняет роль диафрагмы, а на катоде - газообразный водород, препятствующий поглощению углекислого газа из воздуха раствором. Именно такая конструкция значительно увеличивает точность титрования. Мы добились относительной погрешности 0,2%, что ниже капельной ошибки. Электролиз ведётся до появления четкого скачка рН на кривой титрования, записываемой прибором. Для регенерации анода необходимо погрузить его на ночь в разделённый диафрагмой стакан, заполненный раствором хлоридом натрия, подкисленным 1 моль/дм3 . В одну из камер помещали пластинку цинка, в другую серебряный анод и замыкали электроды. Чтобы показать возможность титрования растворов с небольшим содержанием кислот (опыты с уксусной и муравьиной кислотой) поступали следующим образом. В ячейки для титрования помещали 50 см3 пробы и добавляли навеску сухой соли хлорида щелочного металла до его концентрации в ячейке 1 моль/дм3 (этот приём позволил исключить разбавление анализируемого раствора) и перемешивали магнитной мешалкой или воздухом, свободным от двуокиси углерода, до полного растворения соли. Включали перемешивание, регистрацию рН и источник тока. Так как при использовании трёх каналов регистрации наблюдается задержка сигнала от каждого последующего сигнала, то запись текущих значений рН проводили с интервалом в три секунды. Отсюда следует неопределенность в точности измерения количества электричества примерно равная tЧ100/tk, %. Здесь t - время задержки сигнала, tk - время, затраченное на титрование до точки эквивалентности. При t =3 с и tk = 1000 с ошибка равна 0,3%.
Проведено титрование ряда неорганических и органических кислот в модельных смесях и реальных объектах.
Установка работает стабильно при значениях тока от 0,1 до 50 мА. Методика позволяет практически исключить влияние диоксида углерода, в то время как при обычном титровании кислот, точность определения осложняется трудностью получения раствора основания, не содержащего карбонатов, образующихся при поглощении углекислого газа из воздуха. Ниже будет показано, что ввиду высокой информативности кривой титрования можно отделить область влияния углекислого газа. Существенным преимуществом предлагаемого способа является исключение разбавления раствора титрантом.
Кроме того, результат дает детальную информацию об экстремальных участках кривой титрования, что позволяет интерпретировать механизм изучаемого процесса.
Изучению структуры димеров органических кислот посвящено множество работ [73, 74, 75, 76, 77]. В целях совершенствования метода по определение суммы минеральных и органических кислот, предложенного в работе [66], нами был проведён анализ природы водородных и межмолекулярных связей димеров уксусной кислоты в водных растворах. Установлено, что в процессе титрования при переходе кислоты в её среднюю соль происходит образование димера, что приводит к стабилизации протона и затрудняет его последующую диссоциацию [81]. Теории водородной связи и возможности её образования в растворах карбоновых кислот посвящено немало работ. Кристаллические структуры и состояние карбоновых кислот в газовой фазе довольно хорошо изучено [73; 76; 77; 116], построены кривые распределения молекулярных и ионных форм при титровании, рассмотрены причины устойчивости димеров уксусной кислоты в водных растворах, приведены доказательства существования димерной формы уксусной кислоты в жидкой фазе, а также было доказано, что одноосновные органические кислоты, а также и их соли, существуют в водных растворах в виде димеров и последовательно титруются по двум степеням как двухосновные, приведено математическое описание данной модели, проведён её анализ [80]. Следует отметить, что авторы работы [102] на основании данных ИК – спектроскопии по исследованию растворов уксусной, щавелевой и лимонной кислот проишли к выводу, что эти кислоты, даже в сильноразбавленных растворах, находятся в виде димеров., ИК - спектры кислот, полученные авторами в работе [102] приведены на рисунках 7-9.
Структура димеров монокарбоновых кислот в водных растворах
Для проведения анализа с достаточной точностью, необходимо, чтобы время титрования составляло 10-15 минут. При проведении эксперимента применено одновременное использование трёх ячеек, соединённых последовательно и подключённых одновременно к источнику стабилизированного тока. В каждую ячейку помещался серебряный анод и платиновый или графитовый катод. Для измерения рН во все ячейки погружали электроды (стеклянный и хлоридсеребряный). Стеклянный электрод подключали к соответствующему каналу анализатора жидкости «ЭКСПЕРТ-001», а хлорид-серебрянные, через специальный коммутатор, подсоединяли к гнезду для электрода сравнения. Анализатор "Эксперт - 001" подключали к компьютеру. В ячейки помещали 50 см3 1,0 моль/дм3 хлорида щелочного металла и аликвотную часть анализируемого раствора (1-2 см3). Чтобы показать возможность титрования растворов с небольшим содержанием кислот (например, опыты с уксусной и муравьиной кислотой) поступали следующим образом [51; 52; 53].
В ячейки для титрования помещали 50 см3 пробы и добавляли навеску сухой соли хлорида щелочного металла до его концентрации в ячейке 1 моль/дм3 и перемешивали магнитной мешалкой или воздухом, свободным от СО2, до полного растворения соли. Включали перемешивание, регистрацию рН и источник тока. Так как при использовании трёх каналов регистрации наблюдается задержка сигнала от каждого последующего сигнала, то регистрацию величин рН проводили с интервалом 3 секунды. Отсюда следует неопределенность в точности измерения количества электричества примерно равная t 100/tK,%. Здесь t - время задержки сигнала, tk - время, затраченное на титрование до точки эквивалентности, при t =3c и tk = 1000 с. Ошибка составляет меньше 0,3%. Результаты экспериментальных работ представлены на рисунках 4, 6 [50; 51; 52; 53].
На рисунке 4 приведены кривые титрования трёх одинаковых по объёму (50 см3 раствора кислоты + 2,9 - 3,0 г сухого NaCl) проб уксусной и трёх проб муравьиной кислот в тех же условиях в трехзвенной ячейке, основанием, генерированным током 10 мА [51; 52; 53]. Кривые кулонометрического титрования получены для сильно разбавленных растворов. Казалось, что это даст практически сразу же возможность получить величины констант диссоциации мономерных форм изучаемых кислот. Однако это не так. Рассмотрим это на примере анализа средней кривой титрования уксусной кислоты. Справочное значение константы ионизации уксусной кислоты Ка = 1,75Ч10-5 [112]. Сравнение средних значений рН (из данных рисунка 4 а) с рассчитанными величинами рН по данному значению Ка для концентрации уксусной кислоты (Ка = 1,199 моль/дм3) с применением общепринятого уравнения (27) [115] приведено на рисунке 26а. На рисунке 26 показан расчёт константы ионизации уксусной кислоты с применением наших данных.
Из рисунка 26 видно, что реальная и расчётная кривые титрования совпадают только в интервале степени нейтрализации (отношение добавленного основания к общей концентрации кислоты) 0,30,7. Теоретическая кривая (2) на рисунке 26а показывает, что при данной концентрации уксусная кислота должна диссоциировать в десятки раз сильнее, чем это наблюдается в реальных условиях (кривая 1 рисунка 26а). Реальная константа диссоциации (рисунок 26б) фактически не является постоянной, а проходит через максимум, приближаясь к общепринятому значению при степени нейтрализации, равной 0,5. Небольшое отличие можно объяснить тем, что титрование проходило в среде 1,0 моль/дм3 раствора NaCl. Подобные (кажущиеся) изменения величин констант ионизации для уксусной и муравьиной кислот по мере титрования были проанализированы в работах [81; 82; 83; 84; 85]. Исходя из того, что в твёрдом состоянии и в парах уксусная и муравьиная кислоты практически находятся в димерной форме авторы в работах [81; 82; 83; 84; 85] предположили, что и в водных растворах они существуют в димерной форме и, следовательно, могут диссоциировать и титроваться как двухосновные по схеме:
Анализируя результаты титрования и предложенную схему (28), авторы в работах [82; 83] пришли к выводу, что Ка1 = 4Ка2 и процесс титрования и диссоциации описывается следующим кинетическим уравнением
Из таблицы 7 видно, что данные статьи близки к другим данным наших работ, с учётом различия в условиях опыта, хотя и несколько ниже. Последнее наблюдение возможно связано с тем, что по мере разведения степень ионизации уменьшается. Эти результаты свидетельствуют о том, карбоксильные группы связаны в кольцо связями более прочными, чем обычные водородные, и не разрушаются под влиянием растворителя с образованием цепочечных и других ассоциатов. Основным аргументом, подтверждающим то, что растворы имеют ближний порядок, является размытая дифракционная картина при отражении рентгеновского излучения, в отличие от дискретной дифракционной картины для кристаллического состояния. Проделаем мысленный опыт. Направив поток рентгеновских лучей в определённую точку раствора, получим конкретную дифракционную картину. Сдвинем источник излучения и направим его в другую точку раствора - дифракционная картина не изменится, и так далее. Следовательно, в любой точке жидкость структурирована, но в отличие от твёрдых тел эта структура способна изменяться под действием более слабых возмущений, чем возмущений, необходимых для твёрдых тел. Кроме того, жидкость восстанавливает свою исходную структуру после прекращения воздействий механических и электромагнитных сил. В твёрдых телах электронная плотность, которая рассеивает рентгеновское излучение, локализована в малых объёмах, а в жидкости она более размыта.
На рисунке 28, изображенном ниже, на кривой титрования наблюдаются четыре скачка pH. До первого скачка - фиксируется значения pH хлористого калия. При добавлении образца виноматериала рН резко падает (pH1) и наблюдается первый скачок. Второй скачок (pH2) появляется после включения тока, за счёт поляризации раствора образуются направленные упорядоченные структуры, что вызывает изменение потенциала на стеклянном электроде. При выключении тока потенциал стеклянного электрода снижается на ту же величину (pH3). Эти скачки пропорциональны силе тока, протекающего через раствор, и равны падению напряжения на участке между стеклянным и хлорсеребряным электродами.
Обработка и оформление результатов измерений
Важным критерием является разность между t2 и t1, чем она больше, тем больше разнообразие присутствующих кислот в вине, что видно из данных таблиц 9 и 10. Анализ более 20 вин показал, что эта разность лежит в интервале 200-260 с для красных вин и 150-200 с для белых, что значительно больше, чем на кривых титрования моделей (таблицы 9 и 10). Следует отметить, что при искусственном моделировании вина и модельных смесей кислот эта разность значительно меньше, что позволяет выявить долю подлинного вина, добавляемого в винные напитки.
По трём точкам (h0, h0,25, h0,5) находятся параметры a и b характеристического уравнения h(x) = h0 + aЧx + bЧx2, по которому экстраполируется экспериментальная кривая из рисунка 31 до значения h(x) = 0,5 (данная часть кривой показана тонкой линией с точками). Это значение принимает винная и яблочная кислоты при концентрациях, соизмеримых с содержанием титруемых кислот в вине. На оси x находим величину отрезка a, который пропорционален содержанию солевой части кислот в вине, а б пропорционален содержанию титруемой части. Тогда, с/собщ= б Ч100 / (а+б), %. Как видно из данных таблицы 9, соотношение с/собщ для розового и белых вин больше, чем для красного, это связано с тем, что красные вина получают брожением на мезге, из которой в процессе брожения в виноматериал переходят катионы.
Таким образом, для виноградных вин выбраны специфические критерии (таблица 9), которые можно использовать для оценки подлинности и качества вин. Пример обработки кривых титрования для получения данных о содержании суммы кислот приведён в приложении А.
Оценка суммарного содержания аминокислот в винах по виду кривых потенциометрического титрования проведена на основании того, что в отличие от кривой титрования винной кислоты (рисунок 31, кривая 10) кривые титрования вин, приведённые на рисунке 31 (кривые 1-9) после достижения точки эквивалентности выходят на плато при более низких значениях pH.
Отдельными опытами было показано, что добавление соизмеримых количеств глицина, валина, аланина, пролина к раствору минеральной или винной кислот не мешает точному титрованию последних. Однако кривые титрования чистой винной кислоты и с добавками аминокислот несколько отличаются – начальное значение pH повышается с увеличением добавленного количества аминокислоты, а интервал скачка титрования уменьшается. После прохождения первого скачка титрования, pH медленно нарастает, но в выбранных нами условиях (малый ток генерации основания) не наблюдается второго скачка, который можно было бы связать с титрованием аминокислоты. После скачка титрования (рисунок 31, кривые 1–9) на кривых титрования вин наблюдается плавный подъём рН. Этот подъём начинается при более низких значениях pH, чем на кривой титрования чистой винной кислоты (рисунок 31, кривые 1). Для количественной оценки содержания суммы аминокислот поступали следующим образом. Проводили касательную к точке перегиба на кривой титрования вина. По верхней точке, в которой начиналось отклонение кривой титрования вправо от проведённой касательной, находили время t1 (время начала титрования аминокислот). Через найденную подобным образом точку на кривой титрования винной кислоты проводили горизонтальную линию, до пересечения с верхней частью кривой титрования виноматериала. Эту точку принимали за время t2, которое мы связали с окончанием титрования суммы аминокислот. Схема определения времени начала и конца титрования аминокислот показана на рисунке 32.
Качественный состав и суммарное содержание аминокислот в анализируемых виноматериалов, найденных методом электрофоретического разделения на анализаторе «Капель - 105», приведены в таблице 12. В последней строке таблицы 12 приведены суммарные концентрации аминокислот, найденные предложенным нами методом. Как видно из этой таблицы только один результат выпадает из корреляции (сорт Гранатовый). Если принять его за выброс, между остальными значениями наблюдается хорошая сходимость.