Введение к работе
Актуальность темы. Последние 20 лет биосенсоры (БС) как новое
средство получения информации занимают видное место среди подобных устройств, используемых для аналитических целей при определении различных физиологически активных веществ в медицине, сельском хозяйстве, пищевой промышленности и при контроле загрязнителей окружающей среды. Все чаще химики-аналитики обращаются при решении конкретных задач к биохимическим методам анализа, предполагающим использование БС в том или ином варианте. Причина привлекательности БС заключается в высокой селективности отклика биоматериала Сферментов, антител, рецепторов и т.д.}, используемых в создании сенсоров практически на любой субстрат. Кроме того, современные БС в той или иной мере моделируют функции живых организмов (отдельных частей), поэтому их применение обеспечивает получение результатов, позволяющих сделать более адекватные выводы о состоянии объектов окружающей среды. Одно из направлений разработки БС в настоящее время - использование тканей растений и млекапитающих в качестве биочувствительной части, что позволяет с легкостью создавать естественное окружение для представляющего интерес фермента и удобно при конструировании БС. Использование свойств ферментов, а также регистрация отклика в электрических единицах, позволяют создавать аналитические устройства, обладающие высокой селективностью, чувствительностью, быстродействием. На сегодняшний день наибольшее распространение получили электрохимические БС. Среди этих БС можно выделить две основные группы: амперометрические системы, регистрирующие ток, и потенциометрические приборы, основанные на измерении потенциала. Успешное развитие БС подготовлено как достижениями современной биохимии, иммунологии с одной стороны, так и микроэлектроники, аналитической химии и электрохимии с другой. Среди электрохимических преобразователей наибольшее распространение получили преобразователи типа электрода Кларка. На втором месте, как коммерчески доступные, так и описанные в литературе находятся потенциометрические датчики, связанные с использованием ионселективных электродов (ИСЭ). В последнее время все чаще в роли трансдьюсеров выступают ионселективные полевые транзисторы (ИСПТ) в связи с их миниатюрностью, а также технологичностью изготовления. Большие потенциальные возможности электрохимических БС, дающих отклик на широкий спектр физиологически активных веществ создают условия для
-4-использования их в скрининге на токсичность широкого круга сое динений. Именно электрохимические БС считаются перспективными при проведении экспрессного биотестирования и мониторинга обьектої эколого-аналитического контроля. Поэтому разработка подобных диаі ностируювдх устройств с привлечением новых трансдьюсеров и биолоп ческих материалов весьма актуальна.
Работа по теме диссертации выполнялась в соответствии с координационным планом РАН по направлению 2.20.1 С разделы 2.20.2.1 и 2.20.4.7) и грантом Российского фонда фундаментальных исследованиі "Реакции биоспецифического взаимодействия в вольтамперометрическо» анализе" Сномер проекта 94-03-09265)
Цель исследования заключалась в поиске, обосновании подходов и в разработке новых электрохимических биосенсоров с использованием различных биологических препаратов, в том числе, тканевых материалов, и изучении аналитических возможностей разработанных биосенсоров в анализе биологически активных соединений.
Научная новизна:
Показана и обоснована возможность вольтамперометрическоп контроля за ходом ферментативных реакций: гидролиза цистеина : присутствии L-цистеиндесульфгидролазы и окислительного дезамирові ния моноаминов с помощью моноаминооксидазы. Найдены условия и< пользования в качестве биочувствительной части амперометрически: сенсоров гомогенатов растительных и животных тканей, а также с; мих растительных тканей. Разработаны новые способы иммобилизаци: холинэстеразы в комбинированные пленки из хитозана и желатин; Разработаны и предложены новые амперометрические сенсоры: на о< нове тканевых растительных материалов, гомогенатов для определ ния активности L-цистеиндесульфгидролазы и ионов тяжелых мета лов; амперометрический сенсор на основе иммобилизованной моноам нооксидазы для определения биогенных моноаминов на концентрацио ных уровнях п*Ю - п*10-1 моль/л. Найдены условия функционир вания систем на основе иммобилизованных биологических препаратов электрохимических трансдьюсеров, позволяющих получить стабильны аналитический сигнал.
Разработан потенциометрический холинэстеразный биосенсор дл определения обратимых и необратимых ингибиторов холинэстеразы ра
-5-личной природы. Подобраны условия, позволяющие снизить нижние границы определяемых концентраций ингибиторов на фоне металлов-активаторов.
Практическая значимость:
Предложены новые электрохимические биохимические сенсоры с аналитическими характеристиками, позволяющими определять широкий круг биологически активных веществ на уровне и ниже ПДК. Показана возможность практического использования этих сенсоров для высокочувствительного и селективного определения адреналина, норадре-налина в лекарственных препаратах; метафоса, трихлорметафоса, фо-залона, прозерина, эзерина; свинца и кадмия в почвах.
Способы получения биочувствительной части как для ампероме-трического так и потенциометрического сенсоров могут быть использованы в лабораториях и на предприятиях аналитического, биохимического и медицинского профилей для получения образцов иммобилизованных биологических материалов, для применения в различных типах аналитических систем и изготовления на их основе высокочувствительных анализаторов.
На защиту выносятся:
Устройство электрохимических биосенсоров на основе стационарного ртутно-пленочного электрода с серебряной подложкой и рН-чув-ствительного полевого транзистора
Результаты исследования электрохимического поведения субстратов и продуктов ферментативных реакций гидролиза цистеина в присутствии L-цистеиндесульфгидролазы и окислительного дезаминирования биогенных моноаминов в присутствии моноаминооксидазы
Способы иммобилизации и подготовки к работе гомогенатов биологических тканей и холинэстеразы
Способы определения ионов свинца и кадмия по каталитической активности L-цистеиндесульфг'идролазы в составе амперометрического биосенсора
Способы определения биогенных моноаминов с помощью моноаминоок-сидазного биосенсора
Методы определения обратимых и необратимых ингибиторов холинэстеразы с помощью биосенсора на основе рН-чувствительного полевого транзистора
- Рабочие условия, определяющие величину аналитического сигнала при работе с амперометрическими и потенциометрическими биосенсорами
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на Итоговой научной конференции Казанского государственного университета С1995 г), конференции "Экоаналитика - 1994" СКраснодар, 1994 г), на 5-ом симпозиуме по кинетике в аналитической химии Сг.Москва, 1995 г). Международном симпозиуме по экологической химии С Кишинев, 1995 г), 6-той Европейской конференции по электроанализу СДарем, 1996 г), 9-той городской научной конференции молодых ученых СПущино, 1996), на 3-ей сессии по микросистемам и мониторингу окружающей среды С г.Москва, 1996), на Всероссийской конференции с международным участием " Химическое разору-жение-96. Экология и технология. CHEMDET -96" Сг.Ижевск, 1996), на Международном конгрессе по аналитической химии Сг.Москва,1997).
Основное содержание диссертации отражено в 11 публикациях, одна статья принята к печати.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста и содержит 14 рисунков, 38 таблиц и список литературы из 147 наименований. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов, списка литературы.