Введение к работе
Актуальность проблеш. Особое место среди имеющихся в приїде белков занимают протачины - основные ядерные белки половах нэток ряда организмов. Интерес к протаминам обусловлен не только їм, что этим белкам принадлепіт ключевая роль в процессах хране-ія и переноса генетической информации. Протамины являются единс-зенными на сегодняшний день препаратами, использующимися в меди-їнской практике для нейтрализации гепарина - что является важным монизм успешного проведения экстракорпоральной гемоперфузші зппарата искусственного кровообращения, гемосорбции, змодиализа). Эти белки также нашли широкое применение в качестве юокоектиЕных добавок при лечебном питании и пролонгаторов дейс-зия ряда лекарственных препаратов, в частности, инсулина. Кроме эго, протачаны обнаруживают онкостатическую активность, в связи
чем особое внимание исследователей в области химиотерапии рака зивлекают препараты на основе ковалентних соединений протаминов
противоопухолевыми антибиотиками. Для этих соединений характер-з способность направленного транспорта в злокачественную клетку, го в значительной степени повышает терапевтический эффект. Важно гметить, что вышеуказанные продукты модификации протаминов яв-готся малотоксичними препаратами. Высокий научный интерес к этим эединенпям обусловлен такге и тем, что детальное их исследование
значительной мере облегчит решение многих проблем, связанных с іясненнем биологической функции протаминов.
Необходимым и ванным этапом в исследовательской и, особенно,
клинической практике является быстрое и точное определение со-зрзакня протачпна или его ковалентного соединения с противоопу-элевнм антибиотиком в фармацевтических препаратах и индиЕИДуаль-п. лекарственных дозах, поскольку недостаток или избыток прота-ша в организме человека приводит к тяжелым ослозгаениям, вплоть j летального исхода. Однако, следует отметить, что в Государст-знной Фармакопее СССР - ГФ XI на препарат протамин - цинк - пн-ґліш и фармакопейной статье на препарат протамина, использую-ійся для нейтрализации гепарина - ФС N 42 - 1256 - 79 предусмот-эны лишь биологические методы определения этих белков. Эти мето-1 трудоемки, недостаточно чувствительны, дают плохо воспронзво-ашэ результаты, длительны, с трудом поддаются метрологической
оценке. Применение до настоящего времени биологических методе определения объясняется отсутствием современных быстрых, надежш и достаточно цростых химических и физико-химических методов ощх деления протаминов и их производных, удовлетворяющих требованш клинической и исследовательской практики. Для определения ков< лентных соединений протаминов с противоопухолевыми антибиотикаш настоящее время используется метод аминокислотного анализа, коте рый не годится для серийных лабораторных анализов ввиду длителі ности и дорогостоящей аппаратуры.
В связи с вышеизложенным разработка экспрессных и надежш методов определения протаминов и их ковалентних соединений с щх тивоопухолевыми антибиотиками в фармацевтических препаратах, г< товых лекарственных формах, а также в индивидуальных дозах яі ляется важной и актуальной.
Цель работы. Целью настоящей диссертационной работы яз ляется разработка экспрессных и надежных методов определения щх таминов и их ковалентних соединений с противоопухолевыми антибю тиками в коммерческих фармацевтических препаратах и готовых лі карственных формах.
Научная новизна работы. Разработан.метод определения щх таминов с помощы) спектрополяриметрии кругового дихроизма; установлены оптимальные условия определения.
Впервые инструментальным методом исследованы фармацавтиче кие препараты протаминов, использующиеся в отечественной клин ческой практике.
Проведена оптимизация условий електрофоретического разделен препарата ковалентного соединения протамина из гонад Aotpans ataiiatua - стеллина В с противоопухолевым антибиотиком рубошщ ном; найдены оптимальные условия разделения. Предложен спектроф тометрический метод определения ковалентного соединения стелж В с рубомицином, для разработки которого использован простой эффективный способ предварительного разделения проб электрофор зом на бумаге в найденных оптимальных условиях.
По данным аминокислотного анализа и УФ-спектров установл состав комплекса стеллин В-рубомицин : 1:1.
Практическое значение работы. . Разработана методика опреде-іения протаминов в коммерческих фармацевтических препаратах с по-гащью спектрополярпмвтрии КД. Достоинствами методики являются ростота, экспрессность ( продолжительность анализа - 20 мин ), озможность многократного проведения анализа одной и той же про-ы. Методика исключает использование дорогостоящих и токсичных еактивов. Предел обнаружения составил 0,20 мкг/мл.
Исследовано содержание протаминов в фармацевтических препа-атах, использущихся в отечественной клинической практике. Полу-екные достоверные данные представляют практический интерес для ценки качества этих препаратов. По результатам исследований под-отовлена справка в Государственный НИИ по контролю и стандарти-ации лекарственных средств.
Разработана методика спектрофэтометрического определения овалентного соединения протамина из гонад лсірвпзвг steiiatus теллина В с противоопухолевым антибиотиком рубомицином с. предва-нтельным разделением электрофорезом на бумаге. Предел обнаруже-ня составил 21,2 мкг/мл.
Апробация разработанной методики спектрсфотометрического опре-
9ЛЄНИЯ КОВалеНТНОГО соединения ПрОТаМИНа ИЗ ГОНаД Лсірвпзвг
teliatus - стеллина В с противоопухолевым антибиотиком рубомици-зм с предварительным разделением электрофорезом на бумаге прове-эна на препаратах, полученных из ВНИИ по изысканию новых анти-ютиков РАМН. На основании полученных данных сделаны заключения чистоте синтезируемых препаратов.
Разработанные методы и методические приемы были успешно ис-зльзованы для анализа коммерческих фармацевтических препаратов эотаминов и препаратов на основе ковалентних соединений прота-гаов с противоопухолевыми антибиотиками в НИИ физико-химической гологии им. А.Н.Белозерского МГУ, во ВНИИ по изысканию новых гтибштиков РАМН, на кафедре химии природных соединений МГУ.
і зануіту выносятся:
метод определения протаминов в коммерческих фармацевтических юпаратах с помощью спектрополяриметрии КД;
результаты анализа используемых в отечественной медицинской эактике препаратов протаминов методом спектрополяриметрии КД.
оптимизация условий электрофоретического разделения препарата
на основе ковалентного соединения протамина из гонад доірвпзвг stoiiatus - стеллина В с противоопухолевым антибиотиком рубомици-ном;
- спектрофотометрический метод определения ковалентного соединения протамина из гонад Aciponser staiiatus - стеллина В с противоопухолевым антибиотиком рубомицином, включащий стадии разделения и очистки препарата с применением электрофореза на бумаге и подтверждения правильности идентификации.
Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на 8-й международной конференции молодых ученых по органической и биоорганической химии (Рига, 1991), на конференции "Применение хроматографии в пищевой, микробиологической и медицинское промышленности" (Краснодар, 1991), на 1-м Европейском Симпозиуме по высокоскоростной жидкостной хроматографии биомолекул (Страсбург, Франция, 1992), на 12-м Международном Симпозиуме по высокоэффективной жидкостной хроматографии белков и полинуклеотидої (Сидней, Австралия, 1992), на кафедре неорганической и аналитической химии ШШБ.
По теме диссертации опубликовано Ь работ.
Структура и обьем работы. диссертационная работа изложен* на ІЬІ страницах машинописного текста и состоит из введения, 6 глав, выводов, списка использованной литературы и приложений; содержит IS таблиц и 25 рисунков. Список использованной литератур включает 1ST- наименований работ отечественных и зарубежных авторов.
