Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Свойства фенолов и анилинов. методы их количественного химического анализа в водных средах (литературные данные) 14
1 Общая характеристика физико-химических свойств, токсичность и источники поступления в биосферу 14
1.1 Фенол и его хлор-, алкил- и нитрозамещенные 14
1.2 Анилин и его хлор-, метил- и нитрозамещенные 31
1.3 Количественный химический анализ анилинов и фенолов в воде 41
1.3.1 Нехроматографические методы анализа 41
1.3.2 Хроматографические методы анализа 44
1.3.2.1 Химическая модификация анилинов и фенолов в газовой хромато
графии 45
1.3.2.1.1 Получение производных по функциональным группам 47
1.3.2.1.2 Получение производных по ароматическому ядру 1.3.2.2 Методы экстракционного концентрирования анилинов и фенолов 59
1.3.2.3 Химическая модификация анилинов и фенолов в ВЭЖХ 65
ГЛАВА 2 Методика эксперимента 70
2.1 Приборы и оборудование 70
2.2 Стандартные образцы, реактивы и растворители 71
2.3 ГХ/ МС идентификация и расчет хроматографических параметров галоген-производных 73
2.4 Расчет экстракционных характеристик галогенпроизводных 77
ГЛАВА 3 Химическая модификация фенолов и анилинов 80
3.1 Галогенирующие системы 83
3.1.1 Бромирующие системы 83
3.1.2 Йодирующие системы 88
3.2.1 Бронированные хлорфенолы 93
3.2.1.1 Получение бронированных хлорфенолов в водных средах 99
3.2.1.2 Дериватизация бронированных хлорфенолов по ОН-группе 107
3.2.2 Йодированные хлорфенолы 115
3.2.2.1 Получение йодированных хлорфенолов в водных средах 119
3.2.2.2 Дериватизация йодированных хлорфенолов по ОН-группе 125
3.3.1 Бронированные алкилфенолы 132
3.3.1.1 Получение бронированных алкилфенолов в водных средах 136
3.3.1.2 Дериватизация бронированных алкилфенолов по ОН-группе 145
3.3.2 Йодированные алкилфенолы 150
3.3.2.1 Получение йодированных алкилфенолов в водных средах 152
3.3.2.2 Дериватизация йодированных алкилфенолов по ОН-группе 158
3.4.1 Бронированные нитрофенолы 162
3.4.1.1 Получение бронированных нитрофенолов в водных средах 164
3.4.1.2 Дериватизация бронированных нитрофенолов по ОН-группе 169
3.5.1 Бронированные нетиланилины 176
3.5.1.1 Получение бронированных нетиланилинов в водных средах 178
3.5.1.2 Дериватизация бронированных нетиланилинов по NH2-rpynne 185
3.5.2 Йодированные нетиланилины 189
3.5.2.1 Получение йодированных нетиланилинов в водных средах 192
3.5.2.2 Дериватизация йодированных нетиланилинов по NH2-rpynne 196
3.6.1 Бронированные хлоранилины 202
3.6.1.1 Получение бронированных хлоранилинов в водных средах 204
3.6.1.2 Дериватизация бронированных хлоранилинов по NH2-rpynne 210
3.7.1 Бронированные нитроанилины 214
3.7.1.1 Получение бронированных нитроанилинов в водных средах 216
ГЛАВА 4 Концентрирование галогенпроизводных фенолов и анилинов (жидкостная экстракция)
4.1. Экстракционное концентрирование галогенированных фенолов
4.1.1 Жидкостная экстракция с промежуточной реэкстракцией
4.1.2 Закономерности экстракции замещенных фенолов
4.2 Экстракционное концентрирование галогенированных анилинов
4.2.1 Жидкостная экстракция с высоким соотношением фаз
4.2.2 Закономерности экстракции замещенных анилинов
ГЛАВА 5 Идентификация и определение фенолов и анилинов методом ГХ/ДЭЗ
5.1. Идентификация фенолов и анилинов методом ГХ/ДЭЗ
5.1.1 Индексы удерживания замещенных фенолов и анилинов
5.1.2 Идентификация анилинов и фенолов в воде (способ А)
5.1.3 Идентификация анилинов и фенолов в воде (способ Б)
5.2 Определение анилинов и фенолов в воде методом ГХ/ДЭЗ
5.2.1 Определение фенола в высокоцветных природных водах
5.2.2 Определение алкилфенолов в водных средах
5.2.3 Определение хлорфенолов в водных средах
5.2.4 Определение нитрофенолов в водных средах
5.2.5 Определение хлоранилинов в водных средах
5.2.6 Определение метиланилинов в водных средах
5.2.7 Определение нитроанилинов в водных средах
5.3 Метрологические характеристики способов определения анилинов и фенолов в водных средах
Заключение
Библиографический список
- Нехроматографические методы анализа
- МС идентификация и расчет хроматографических параметров галоген-производных
- Дериватизация йодированных хлорфенолов по ОН-группе
- Индексы удерживания замещенных фенолов и анилинов
Введение к работе
Актуальность исследований в области аналитической химии гидрофильных органических экотоксикантов, значительную часть которых составляют замещенные фенолы и анилины, обусловлена тем, что в различных водных объектах нормируют содержание нескольких десятков таких соединений. Их распространению и накоплению в объектах биосферы способствуют активное промышленное применение и достаточно хорошая растворимость в воде. Строгого аналитического контроля требуют сточные воды предприятий деревообрабатывающей и фармацевтической промышленности, органического синтеза и нефтехимии, где фенолы и анилины являются основными или побочными продуктами технологического цикла. Их контакт с хлором в этих процессах ведет к образованию еще более токсичных хлорсодержащих продуктов. Хлорзамещенные фенолы образуются и при дезинфекции питьевой воды различными хлорирующими агентами и, что особо опасно, являются прямыми предшественниками полихлорированных дибензо-п-диоксинов. В естественных условиях соединения этих классов продуцируются при гидролитической и биохимической деструкции органического вещества почвы, а также широко применяемых антисептиков и пестицидов, таких как хлоргексидин, триклозан, линурон, аминокарб и др.
В последнее время, в связи с увеличением производства полимерных материалов, большое внимание уделяется алкилфенолам. Эти вещества активно применяют в качестве отвердителей и стабилизаторов различных пластических материалов. Структурное сходство некоторых длинноцепочечных алкилфенолов с гормонами, вызывает нарушение эндокринных функций и негативно влияет на репродуктивную систему живых организмов.
Высокая токсичность фенолов и анилинов, предельно-допустимые концентрации
(ПДК) которых в воде составляют 0.1-100 мкг/дм3, требует разработки
высокочувствительных и селективных методов их определения на уровне следовых концентраций – 0.005-0.01 мкг/дм3. Потребность в методиках индивидуального определения этих поллютантов связана со значительными различиями в токсичности даже их изомерных форм. Это обстоятельство предопределяет необходимость использования именно хроматографических методов, прежде всего – капиллярной газовой хроматографии, которая обеспечивает возможность разделения изомеров. Однако пределы прямого (без дериватизации) хроматографического определения фенолов и анилинов даже с применением современных методов концентрирования и селективного детектирования, в большинстве случаев, составляют 0.1-5.0 мкг/дм3, что выше нормируемых значений их концентраций в водных средах.
Основная причина таких ограничений – наличие в составе молекул полярных гидроксильных (фенолы) и аминогрупп (анилины), снижающих эффективность их экстракционного концентрирования, а при хроматографическом разделении вызывающих размывание и асимметрию хроматографических пиков (peak broadening, peak tailing). С другой стороны, их объединяет такой общий признак, как наличие в составе молекул функциональных групп, содержащих активные атомы водорода, что открывает возможность использования на стадии пробоподготовки такого приема, как получение производных с целью направленного улучшения экстракционных и хроматографических характеристик целевых аналитов.
Известные к настоящему времени методы, реализующие подобный подход, предполагают проведение химической модификации непосредственно в воде, либо в органическом растворителе после проведения экстракционного концентрирования. Однако, оба этих варианта имеют существенные недостатки, значительно снижающие эффективность применения химической модификации фенолов и анилинов. Так, дериватизация в воде сопровождается гидролизом как получаемых производных, так и применяемых реагентов, а предварительная экстракция фенолов и анилинов из водных фаз малоэффективна, вследствие их гидрофильности. Известную проблему представляет и зависимость чувствительности определения этих аналитов от числа и типа заместителей, которая в этих методах полностью не решается. Так, из-за различий в экстракционных и хроматографических свойствах пределы обнаружения фенола и пентахлорфенола при определении с детектором электронного захвата (ДЭЗ) могут отличаться на 3-4 порядка, что делает невозможным их одновременное определение.
Обозначенные выше проблемы могут быть решены при проведении галогенирования производных фенола и анилина в ароматическое ядро по реакции электрофильного замещения. Однако, исследования в этом направлении практически не проводились, поскольку традиционно считается, что галогены (Br2 и I2) малопригодны для проведения дериватизации органических аналитов в воде из-за их высокой окислительной активности в этих средах.
Таким образом, существует объективная необходимость в развитии новых методических подходов к дериватизации гидрофильных органических экотоксикантов, один из которых состоит в проведении химической модификации фенолов и анилинов, как по функциональной группе, так и по ароматическому ядру. Такой подход, в зависимости от целей анализа, позволяет «гибко» варьировать свойства получаемых производных и одновременно решать сразу несколько аналитических задач (многофункциональная дериватизация), конечной целью которого является снижение пределов обнаружения и повышение надежности идентификации целевых аналитов.
Цель исследования:
Разработка новых газохроматографических способов определения гидрофильных
органических поллютантов (замещенные фенолы и анилины) в водных средах на уровне
предельно допустимых и фоновых концентраций (0.005-0.05 мкг/дм3), основанных на
проведении двухстадийной химической модификации, обеспечивающей их
высокоэффективную экстракцию, высокочувствительное детектирование и надежную идентификацию.
Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Для каждого из шести классов исследованных органических токсикантов (хлор-,
алкил- и нитрофенолы, хлор-, метил- и нитроанилины) разработать алгоритмы и способы
химической модификации, основанные на введении в их молекулы атомов брома или йода
по реакции электрофильного ароматического замещения в водных растворах (первая стадия)
с последующим ацилированием или силилированием гидроксильных (фенолы) и аминогрупп
(анилины) полученных галогенпроизводных в органических экстрактах (вторая стадия).
-
Разработать составы галогенирующих систем (бромирование и йодирование), обеспечивающих получение галогенпроизводных фенолов и анилинов непосредственно в водных средах с близкими к количественным выходами. Теоретически и экспериментально обосновать выбор условий галогенирования для каждого из исследованных классов фенолов и анилинов.
-
Адаптировать методологию жидкостной экстракции анилинов и фенолов для концентрирования их галогенпроизводных на стадии подготовки проб к газохроматографическому анализу в вариантах, исключающих отгонку экстрагента для их дополнительного концентрирования.
-
Разработать способы идентификации анилинов и фенолов в водных растворах, основанные на вариациях хроматографических характеристик получаемых галогенпроизводных, а также различиях скоростей их окисления в присутствии избытка галогена.
-
Предложить способ удаления гумусовых веществ из питьевых и природных вод, оказывающих мешающее влияние при определении фенольных соединений в этих объектах.
-
Обобщить полученные результаты в методических подходах к разработке методик КХА экотоксикантов исследуемых классов в питьевых, поверхностных, грунтовых, сточных водах, снежном покрове и атмосферных осадках в диапазонах концентраций, перекрывающих нижние границы областей нормируемых значений. Провести апробацию разработанных методик на реальных объектах и внедрить их в практику аналитических лабораторий, осуществляющих экологический контроль различных водных объектов.
Научная новизна работы:
1. Для газохроматографического определения в водных средах следовых количеств
экотоксикантов, молекулы которых включают гидрофобный арильный фрагмент и
гидрофильную функциональную группу, предложен новый подход, включающий
многофункциональную двухстадийную дериватизацию аналитов с экстракционным
концентрированием получаемых производных.
2. Предложенный подход реализован для определения замещенных фенолов и
анилинов (хлор-, нитро- и алкилфенолы, хлор-, метил- и нитроанилины) и включает
проведение их двухстадийной химической модификации, а именно – введение атомов
галогенов в ароматическое ядро (бромирование или йодирование) по реакции
электрофильного ароматического замещения в среде анализируемого водного раствора и
последующую дериватизацию галогенпроизводных по функциональной группе
(ацилирование или силилирование) в среде органического экстрагента.
3. Для получения галогенпроизводных фенолов и анилинов непосредственно в водных
средах впервые предложено и теоретически обосновано применение принципиально новых
галогенирующих систем. Использованы вещества, обратимо реагирующие с галогенами
(аминокислоты, бромид-анионы и аммиак), что снижает окислительную активность
реагентов в водных растворах, повышает эффективность галогенирования и обеспечивает
получение галогенпроизводных фенолов и анилинов с выходами, близкими к
количественным.
4. Для каждого из 50 исследуемых соединений, предложено и получено от 5 до 16
новых аналитических форм для их газохроматографического определения – собственно
галогенпроизводное (бромпроизводное и/или йодпроизводное), а также продукты его
взаимодействия с ангидридами этановой (AA), трифторэтановой (TFAA),
пентафторпропановой (PFAA) и гептафторбутановой (HFAA) кислот, хлоридом
перфторбензойной кислоты (PFB-Cl), N-метил-N-трет-бутилдиметилсилил-
трифторацетамидом (MTBSTFA) и N,O-бис(триметилсилил)трифторацетамидом (BSTFA).
Для всех аналитических форм впервые определены хроматографические индексы
удерживания на стандартных полидиметилсилоксановых неподвижных фазах.
5. Для концентрирования замещенных фенолов на стадии подготовки проб предложена
новая последовательность операций, включающая галогенирование фенолов, их
количественное извлечение в экстракт и промежуточное концентрирование в водно-
щелочном растворе, что позволяет достигать высоких коэффициентов концентрирования
(Кex = 5000-10000). Для концентрирования замещенных анилинов теоретически обосновано
применение жидкостной экстракции с высокими фазовыми соотношениями (r = 1000-2000).
Впервые определены экстракционные характеристики для более, чем 100 галогенированных
фенолов и анилинов (хлор-, бром- и йодсодержащих) в трех экстракционных системах.
6. Разработаны способы идентификации замещенных анилинов и фенолов в водных
средах, основанных:
– на сравнении хроматографических параметров удерживания двух или более аналитических форм идентифицируемых соединений;
– на различиях скоростей окисления галогенированных фенолов в водных средах в присутствии избытка галогена.
7. Предложен новый способ устранения мешающего влияния гумусовых веществ при
анализе природных и питьевых вод на результаты определения содержания фенола и его
хлорзамещенных. Способ реализован в варианте колоночной хроматографии на оксиде
алюминия в присутствии катионов меди (II).
Положения, выносимые на защиту:
1. Обоснование нового подхода для газохроматографического определения в водных
средах гидрофильных органических токсикантов (хлор-, нитро- и алкилфенолы, хлор-,
метил- и нитроанилины), основанного на их двухстадийной химической модификации.
-
Новые галогенирующие системы (бромирование и йодирование) для получения галогенпроизводных фенолов и анилинов непосредственно в водных средах.
-
Новый способ концентрирования фенольных соединений, предполагающий их галогенирование и количественное извлечение в экстракт с промежуточной реэкстракцией в водно-щелочной раствор.
4. Новые способы идентификации замещенных анилинов и фенолов в водных средах,
основанные на сравнении газохроматографических характеристик разных аналитических
форм этих веществ и различиях скорости окисления их галогенпроизводных в водных средах
избытком галогена.
5. Новый способ удаления из питьевых и природных вод гумусовых веществ,
оказывающих мешающее влияние при определении фенолов, реализуемый в варианте
колоночной хроматографии на оксиде алюминия в присутствии катионов меди (II).
6. Комплекс методик газохроматографического определения органических токсикантов
(хлор-, нитро- и алкилфенолы, хлор-, метил- и нитроанилины) в питьевых, поверхностных,
грунтовых, сточных водах, атмосферных осадках и снежном покрове.
Практическая значимость работы и использование полученных результатов
1. Разработаны методология и общие подходы определения замещенных фенолов и анилинов в водных средах, предполагающие направленное изменение их экстракционных и хроматографических свойств в результате многофункциональной (двухстадийной) химической модификации.
2. На основании результатов проведенных исследований разработан комплекс
высокочувствительных селективных методик определения производных фенола и анилина
(хлор-, нитро- и алкилфенолы, хлор-, метил- и нитроанилины) в водных средах с пределами
обнаружения 0.002-0.01 мкг/дм3. Для диапазона значений массовых концентраций аналитов
0.02-10 мкг/дм3 значение погрешности измерений не превышает 25 %.
3. Три методики количественного химического анализа прошли аттестацию в Центре
метрологии и сертификации «Сертимет» УрО РАН: «Методика измерений массовой
концентрации фенола методом капиллярной газовой хроматографии» (№ 88-17641-001-
01.00076-2014), «Методика измерений массовой концентрации анилина и хлоранилинов
методом капиллярной газовой хроматографии» (№ 88-17641-006-2014), «Методика
измерений массовой концентрации метилфенолов методом капиллярной газовой
хроматографии» (№ 88-17641-035-2014). Все аттестованные методики внесены в
Федеральный информационный фонд по обеспечению единства измерений
(ФР.1.31.2013.15054, ФР.1.31.2014.17622, ФР.1.31.2014.18522).
4. Разработанные методики определения фенолов и анилинов в воде внедрены и
применяются при проведении научных исследований по плановым темам фундаментальных
НИР отдела почвоведения Института биологии Коми НЦ УрО РАН, организации
экологического мониторинга в различных районах Республики Коми, а также при
проведении научных исследований в аналитическом центре Байкальского института
природопользования СО РАН, Институте проблем мониторинга окружающей среды НПО
«Тайфун» и других аналитических лабораториях различной ведомственной принадлежности,
осуществляющих экологический контроль питьевых, природных и сточных вод.
5. Материалы диссертации использованы при разработке методических рекомендаций,
чтении лекций и проведении учебных практикумов по дисциплинам «Инструментальные
методы анализа», «Хроматографические методы в химическом анализе» и «Контроль
состояния окружающей среды» на кафедре химии Института естественных наук
Сыктывкарского госуниверситета.
Вклад автора в разработку проблемы. Разработка концепции, общее планирование работы, экспериментальные исследования, обработка и анализ результатов выполнены либо лично автором, либо при его непосредственном участии. В выполнении работы принимали участие соискатели ученой степени кандидата химических наук М.В. Филиппова (Алферова) и И.М. Кузиванов, а также студенты Сыктывкарского госуниверситета и сотрудники экоаналитической лаборатории Института биологии Коми НЦ УрО РАН, что отражено в соответствующих публикациях.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены и
обсуждались на II Международном симпозиуме "Хроматография и спектроскопия в анализе
объектов окружающей среды и токсикологии" (Санкт-Петербург, 1996), I Российской
конференции “Актуальные проблемы медицинской экологии” (Орел, 1998), XVI
Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Санкт-Петербург, 1998), XI
Всеросийской конференции по экстракции (Москва, 1998), Всеукраинской конференции по
аналитической химии (Ужгород, 1998), III Всероссийской конференции “Анализ объектов
окружающей среды” (Краснодар, 1998), III Югославском симпозиуме “Chemistry and The
Environment” (Vrnjacka Banja, Yugoslavia, 1998), Международной конференции “Молодежь и
химия” (Красноярск, 1999), II Всероссийской конференции молодых ученых “Современные
проблемы теоретической и экспериментальной химии” (Саратов, 1999), XLII съезде
Польского химического общества (Rzeszow, Poland, 1999), Международной конференции
“Separation of Ionic Solutes” (Stara Lesna, Slovakia, 1999), Всеукраинской конференции по
аналитической химии (Харьков, 2000), VI конференции по аналитической химии (Gliwice,
Poland, 2000), Республиканской конференции “Эколого-экономические проблемы охраны
окружающей среды” (Сыктывкар, 1998), III Всероссийском совещании “Лесохимия и
органический синтез” (Сыктывкар, 1998), IV-VI молодежных научных конференциях
“Актуальные проблемы биологии” (Сыктывкар, 1996, 1998, 1999), XIII-XV Коми
республиканских молодежных научных конференциях (Сыктывкар, 1997, 2000, 2004),
Международной конференции “Научно-технический прогресс в лесном комплексе”
(Сыктывкар, 2000), I и II Международных форумах "Аналитика и Аналитики" (Воронеж,
2003, 2008), V Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды
"Экоаналитика-2003” (Санкт-Петербург, 2003), III и IV Международных конференциях
«Экстракция органических соединений» (Воронеж, 2005, 2010), IV Международном
контактном форуме по сохранению местообитаний в Баренцовом регионе (Сыктывкар,
2006), VI Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды
«Экоаналитика-2006» (Самара, 2006), XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной
химии (Москва, 2007), II Всероссийской конференции «Масс-спектрометрия и ее
прикладные проблемы» (Москва, 2007), VII Всероссийской конференции по анализу
объектов окружающей среды «Экоаналитика-2009» (Йошкар-Ола, 2009), XIX
Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011), VIII Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-2011» (Архангельск, 2011) и Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Экология родного края: проблемы и пути их решения» (Киров, 2013).
Публикации. Основные теоретические и практические результаты диссертации опубликованы в 93 работах, в том числе 28 статьях, среди которых 18 публикаций в ведущих рецензируемых изданиях, рекомендованных в действующем перечне ВАК. Все основные положения диссертации защищены 11 патентами на изобретение.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа содержит введение, пять глав, заключение, библиографический список и приложения. В первой главе представлен обзор литературных данных, во второй главе приведены условия эксперимента и использованные в работе методики, в главах 3-5 обсуждаются полученные результаты. Работа изложена на 334 страницах, включает 68 таблиц, 137 рисунков и список литературы из 414 наименований.
Нехроматографические методы анализа
Большое влияние на свойства хлорфенолов оказывает гидроксильная группа и ее способность образовывать внутри- и межмолекулярные водородные связи. Как и фенол, хлор-фенолы благодаря межмолекулярной ассоциации характеризуются высокими температурами плавления (кипения) и низкой летучестью. Только 2-ХФ имеет аномально высокое значение давления насыщенных паров (220 Па) и при комнатной температуре является жидкостью (Тпл. = 9.3 С). Эти особенности 2-ХФ объясняются наличием водородной связи внутри молекулы, которая значительно ослабляет межмолекулярное взаимодействие [10]:
Введение атомов хлора в молекулу органического соединения, как известно, оказывает гидрофобное действие [11], поэтому с увеличением степени хлорированности растворимость хлорфенолов в воде закономерно снижается. Одновременно с этим повышается сродство хлорфенолов к органическим средам – коэффициенты их распределения в системах с органическими растворителями последовательно возрастают (табл. 1).
Введение электроноакцепторных атомов хлора усиливает дефицит электронной плотности, возникающий на атоме кислорода (–I-эффект). По этой причине, связь О–Н еще больше поляризуется: По этой причине, с увеличением хлорированности фенола, кислотные свойства пропорционально усиливаются (табл. 1). Следует отметить, что на кислотные свойства здесь влияет и положение атома хлора относительно фенольного гидроксила. Наибольшее влияние на величину рКа хлорфенолов оказывает заместитель, находящийся в орто-положении, с увеличением расстояния от OH-группы -I-эффект атома хлора ослабляется, как и кислотные свойства: о-ХФ м-ХФ п-ХФ
Количество и положение атомов Cl в бензольном ядре определяет и индивидуальную токсичность хлорфенолов по отношению к живым организмам. Эффективность влияния вещества на организм тесно связана с его способностью проникать через клеточную мембрану, которая возрастает при увеличении его гидрофобности (log Kow). Закономерно, что с увеличением числа атомов хлора в молекуле наблюдается рост токсичности хлорфенолов [12]. Так, летальная концентрация (ЛК50) для рыб (Pimephales promelas) в ряду фенол - 2-ХФ -2,4-ДХФ - 2,4,6-ТХФ уменьшается с 32,5 до 4.7 мг/дм3. Тетрахлорзамещенный 2,3,4,6-тетрахлорфенол и ПХФ характеризуются еще большей токсичностью, для которых значения ЛК50 равны 1.03 и 0.22 мг/дм3 соответственно.
Однако, положение атомов Cl в бензольном ядре также достаточно значимо: по данным [13] наибольшую устойчивость к биодеградации проявляют хлорфенолы с атомами хлора в мета-положениях, чем их орто-замещенные изомеры. Действительно, хлорфенолы, имеющие заместители в орто-положениях, проявляют наименьшую токсичность по отношению к живым организмам среди изомерных моно-, ди- и трихлорфенолов (табл. 2). По этой же причине, наибольшую токсичность среди всех хлорфенолов проявляет не пентахлорфенол, а 3,4,5-ТХФ не имеющий заместителей в орто-положениях [14].
Поскольку хлорфенолы проявляют кислотные свойства, то их токсичность будет определяться еще и значением рН среды в которой они находятся. Так, в нейтральных средах (рН 6-8), фенол и монохлорфенолы находятся в недиссоциированной (молекулярной) форме. Напротив, ди-, три-, тетрахлорфенолы и пентахлорфенол присутствуют, в основном, в ионизированном виде (фенолят-анионы). При повышении рН степень ионизации хлорфенолов возрастает, а способность к биоаккумуляции снижается. И наоборот, при значениях рН 4 все хлорфенолы полностью переходят в молекулярную форму и токсичность таких сред будет максимальной.
Вещество EC50 , водоросли P. subcapitata (72 часа) EC50, бактерии V. fischeri (0.25 часа) Фенол 197 165 – концентрация токсиканта, вызывающая в экспериментальных условиях гибель 50 % организмов. Хлорфенолы могут воздействовать на живые организмы через дыхание, пищу, слизистые оболочки и кожный покров. Интоксикация моно- и дихлорфенолами сопровождается судорогами, мышечной слабостью, болями в суставах, бессонницей и тошнотой [16]. Поли-хлорированные фенолы (3,4,6-ТХФ, 2,4,6-ТХФ, и 2,3,4,6-ТeХФ) могут запускать в клетках процессы окислительного фосфорилирования, сопровождающиеся образованием активных формы кислорода (Н2О2) и свободных радикалов, что повышает риск возникновения хромосомных аберраций [17]. Как показано в работе [18], ПХФ и 2,4,6-ТХФ обладают выраженной канцерогенной активностью, вызывая возникновение лейкемии и саркомы мягких тканей (мыши, крысы).
В соответствии с директивой ВОЗ, хлорфенолы включены в число приоритетных пол-лютантов питьевой воды [19]. Неопасной для человека считается суммарная концентрация хлорфенолов в питьевой воде, не превышающая 1.0 мкг/л. Значения ПДК хлорфенолов в природной воде, принятые ЕРА, составляют: для монохлорфенолов 25 мкг/дм3, дихлорфено-лов – 15 мкг/дм3, трихлорфенолов – 3 мкг/дм3, тетрахлорфенолов – 1 мкг/дм3, ПХФ – 4 мкг/дм3. В Канаде нормы еще жестче: ПДК моно- и дихлорфенолов в природных водах (пресные и морские) составляют 0.1 мкг/л.
В Российской Федерации, в воде культурно-бытового и хозяйственно-питьевого водопользования, а также в водных объектах, имеющих рыбохозяйственное значение, нормируются фенол, 2-ХФ, 2,4-ДХФ, 2,4,6-ТХФ и ПХФ (табл. 3).
МС идентификация и расчет хроматографических параметров галоген-производных
ГХ/МС идентификация галогенированных фенолов и анилинов. Получение галогенпро-изводных проводили отдельно для каждого вещества, придерживаясь известных рекомендаций галогенирования соединений этих классов [374]. Галогенирование проводили в водно-спиртовых растворах (20-30 % этанола) при массовой концентрации модифицируемого вещества 0.1-0.5 мг/см3. Галогены дозировали в стехиометрических количествах, а время гало-генирования варьировали в интервале от 1 до 20 мин оценивая химическую активность субстрата по числу и типу заместителей [4]. Для получения промежуточных продуктов галоге-нирования фенолов и анилинов пропорционально уменьшали время галогенирования или количество галогена.
После экстракции бензолом, проводили масс-спектрометрическую идентификацию и устанавливали хроматографические параметры удерживания полученных галогенпроизвод-ных. Идентифицированные дериваты далее использовали для получения их производных по реакциям ацилирования и силилирования. Для этого, в стеклянные виалы отбирали по 50-100 мкл экстракта, вводили 5 мм3 триэтиламина и 20 мм3 модифицирующего агента (разд. 2.2), выдерживали при температуре 75 С в течение 1 часа, проводили идентификацию и устанавливали хроматографические параметры удерживания соответствующих производных.
Хромато-масс-спектрометрическую идентификацию проводили в режиме электронной ионизации (70 эВ, сканирование масс в интервале 50-650 а.е.м.), применяя библиотеку масс-спектров NIST05 MS Library (210044 соединения) и учитывая характерное соотношение ин-тенсивностей сигналов в мультиплетах пиков хлор- и бромсодержащих ионов. Масс-спектры галогенпроизводных исследованных фенолов и анилинов представлены в приложении А.
Линейные индексы хроматографического удерживания (RI) замещенных фенолов и анилинов определяли при программировании температуры колонки по известной формуле [375]: где tх, tn и tn+1 – приведенные времена удерживания аналита и ближайших к нему алка-нов с числом атомов в углеродной цепи n и n+1.
Мертвое время (время удерживания несорбирующегося компонента), необходимое для расчета приведенных величин, оценивали по формуле [376]: где tR – время удерживания одного из компонентов анализируемой в режиме программирования температуры; Т0 – начальная температура программирования; r – скорость подъема температуры, град/мин; a и b – коэффициенты, предварительно вычисленные по уравнению ln tR = а/Т + b для любого из алканов.
Суммарную случайную составляющую погрешности индексов оценивали по формуле: где Atх, Atn и Atn+j - соответствующие погрешности измерения времен удерживания, на основе которых вычисляются индексы удерживания
Для определения индексов, в органические экстракты с аналитами вводили смесь н-алканов С8-С24 и анализировали трижды методом ГХ/МС при следующих условиях: программирование температуры колонки 70 С - 4 С/мин - 320 С, гелий (99.995 %), скорость потока 1 мл/мин, делитель ККК 1:40, температура ионизационной камеры 200 С, испарителя 320 С, ГХ/МС интерфейса 250 С. Расчеты проводили в соответствии с рекомендациями руководства [376], применяя программное обеспечение Microsoft Excel и QBasic.
Линейные индексы удерживания установлены для замещенных фенолов и анилинов, их бром- и йодпроизводных, а также продуктов дериватизации галогенированных форм по функциональным группам на стандартной полидиметилсилоксановой НЖФ (разд. 5.1.1 и приложение Б). Погрешность определения RI, для большинства исследованных соединений, не превышает ± 3-5 ед. индекса.
Для оценки среднего значения величины RI, являющейся мерой межлабораторного разброса индексов, измеренных в неидентичных условиях, их определение повторяли на колонках с разным количеством НЖФ при отличающихся режимах программирования температуры [377]. Показано, что разброс значений индексов удерживания, измеренных в неидентичных условиях, закономерно увеличивается по мере увеличения молекулярных масс ана-литов, но, в целом, соответствует средним оценкам для стандартных неполярных фаз, составляющим ± 5-10 ед. индекса. Коэффициенты чувствительности ДЭЗ. Для оценки изменения чувствительности ДЭЗ к получаемым полигалогенированным производным фенолов и анилинов для соответствующих аналитических форм были рассчитаны коэффициенты чувствительности ДЭЗ – KECD [378], характеризующие отклик этого детектора на присутствие деривата по сравнению с фенолом (KECDPh) или анилином (KECDAn): где Ki – соотношение площадей пика аналита на хроматограммах с ДЭЗ и ПИД; KAn и KPh – соотношения площадей пика фенола и анилина на хроматограммах с ПИД и ДЭЗ, соответственно
При оценке значений KECD все исследуемые вещества были поделены на две группы: а) Соединения, не содержащие электроноакцепторных атомов или групп – алкилфено-лы и метиланилины. В качестве внутреннего стандарта в эти смеси вводили непосредственно фенол или анилин ( 0.5 мг/см3). После хромато-масс-спектрометрического подтверждения компонентного состава, получали не менее пяти хроматограмм смеси методом ГХ-ПИД в аналогичных с ГХ/МС условиях хроматографического разделения. На хроматограммах, площадь хроматографического пика каждого компонента соотносили с площадью пика соответствующего внутреннего стандарта (фенола или анилина):
Полученные для каждого компонента пять значений, для проведения последующих вычислений, усредняли. Далее смесь анализировали повторно методом ГХ/ДЭЗ, разбавляя ее таким образом (в 10-500 раз), чтобы аналитические сигналы компонентов смеси находились в линейном диапазоне ДЭЗ. Хроматографическое разделение компонентов смеси проводили в сходных с ГХ-ПИД условиях, также получая не менее пяти хроматограмм и нормируя площади пиков целевых компонентов к площади пика соответствующего внутреннего стандарта:
Дериватизация йодированных хлорфенолов по ОН-группе
Исследование реакции галогенирования всех изучаемых классов фенолов и анилинов проводилось для концентрационного интервала 0.01-20 мкг/дм . В соответствии с уравнениями реакций галогенирования, для получения конечных продуктов каждого класса анали-тов (от 5 до 15 веществ) требуется от 10 до 30 молекул галогена, поэтому для создания тысячекратного избытка расчетная концентрация галогена в воде создавалась на уровне 0.0005 -0,001 моль/дм3.
Поскольку прямое галогенирование фенолов и анилинов молекулярным бромом или йодом в воде невозможно из-за их высокого RedOx потенциала галогенов, для решения этой задачи нами впервые предложены системы, в которых основным галогенирующим агентом выступает не галоген, а галогенсодержащий продукт образующийся непосредственно в условиях водного раствора в присутствии галогена. Отметим некоторые преимущества предлагаемых систем: - образование галогенсодержащих продуктов сопровождается снижением концентрации галогена и его RedOx потенциала в системе, что положительным образом сказывается на устойчивости галогенированных форм исследуемых аналитов в водных растворах; - применяемые галогенирующие агенты проявляют высокую активность в реакциях электрофильного ароматического замещения, а количественный и качественный состав продуктов галогенирования не отличается от реакций, в которых качестве реагента выступает галоген в молекулярной форме; - используемые галогенирующие агенты не требуют их предварительного синтеза и выделения, образуются непосредственно в водных растворах галогена сразу после введения и являются широко распространенными доступными веществами.
При концентрациях 0.0005-0.002 моль/дм3, водные растворы брома в кислой и нейтральной областях характеризуются достаточно высоким RedOx потенциалом, который достигает 1000 мВ (рис. 9).
При смещении в щелочную область, RedOx потенциал за счет усиления гидролиза брома снижается до 600-800 мВ, но, одновременно с этим, значительно уменьшается и его концентрация: Вг2 + Н20 "V Вг + НВЮ + Н + Е, мВ 1000 Зависимости концентрации молекулярного брома (1) и RedOx потенциала его водного раствора (2) от значения рН [382] Следует отметить, что бром (Кг = 5.810–9), по сравнению с йодом (Кг = 5.410 13) гораздо легче гидролизуется [292], поэтому и по этой причине проведение бромирования в щелочной среде будет малоэффективно. Так, даже в нейтральном водном 0.01 М растворе брома степень гидролиза составляет 4.2 %, в 0,001 М - уже 17 %. Кроме того, бром в щелочном растворе расходуется в результате необратимого диспропорционирования бромноватистой кислоты по реакции: ЗНВгО - ВгОз + 2Вг + ЗН4" В связи с этим, для проведения бромирования фенолов и анилинов нами рекомендованы системы на основе водных растворов Вгг (рН 6-7) в присутствии аминокислот.
Бромирующие системы с аминокислотами Эксперимент был основан на хорошо растворимых в воде и широко распространенных аминокарбоновых кислотах - а-аланине, [3-аланине и глицине (табл. 22). Таблица 22 - Основные свойства применяемых аминокарбоновых кислот [383] Обозначение Структура Растворимость в воде, г/100 мл (25 С) pKi рК2 pI а-А1а CH3-CH(NH2)-COOH 16.7 2.3 9.7 6.0 р-А1а CH2(NH2)-CH2-COOH 35.3 3.6 8.8 6.2 Gly CH2(NH2)-COOH 25.0 2.3 9.5 5.9 Рисунок 10 – Зависимость RedOx потенциала брома (1-3) и йода (4) в воде от концентрации веществ: 1 – KBr; 2 и 4 – Gly; 3 – -Ala Нами установлено, что в присутствии этих аминокислот RedOx потенциал водных растворов брома заметно снижается (рис. 10, зависимости 2 и 3). Снижение потенциала молекулярного брома в системах с аминокислотами, на нащ взгляд, связано с его участием в химической реакции с образованием N-бромпроизводных аминокислот: Химическое взаимодействие брома с аминокислотами подтверждается и данными спектроскопии. Характерные широкие полосы поглощения в спектре молекулярного брома с максимумом 260 и 410 нм в растворах аминокислот практически полностью отсутствует (рис. 11, зависимости A3, Б2 и Б3).
Следует отметить, что спектры поглощения водного раствора Br2 без глицина и Br2+Gly в сильнокислой области практически совпадают (рис. 11, зависимости A1 и A2), что указывает на невозможность образования в этих условиях связи Gly-Br из-за присоединения катиона водорода аминогруппой: Рисунок 11 – Спектры поглощения растворов брома в воде с добавками аминокислот: А: 1– без Gly, рН 1; 2 – Gly, рН 1; 3 – Gly, рН 6; С(Br2) = 0.001 М, С(Gly) = 0.05 М; Б: 1– без АК, рН 6; 2 – -Ala, рН 6; 3 – -Ala, рН 6. С(Br2) = 0.005 М, С(АК) = 0.1 М
На наш взгляд, в присутствии аминокислот основным бромирующим агентом является не Br2, а образующееся в растворе бромпроизводное аминокислоты, активно генерирующее электрофильные частицы Br+ [384]:
Мягкое бромирующее действие бромглицина можно сравнить с широко применяемым для бромирования органических соединений в неводных средах N-бромсукцинимидом, который так же легко продуцирует электрофильные частицы Br+ [385].
Важнейшее свойство обсуждаемых систем с аминокислотами – высокая эффективность бромирования, сопровождающаяся повышением устойчивости получаемых галогенирован-ных форм аналитов. Так, без применения аминокислот, в течение 3 мин, в результате окисления, содержание бромированных хлоранилинов уменьшается на 80-90 % (рис. 12, зависимости 1А-3А). C m , мкг/дм3
Зависимость концентрации бромированных хлоранилинов в воде от продолжительности контакта с бромом [384]: 6-бром-2,4,5-ТХА (1), 6-бром-2,4-ДХА (2), 4,6-дибром-2-ХА (3); А – без Gly, рН 1; Б – раствор Gly, 0.06 М; С(Br2) = 0.0005 М
В присутствии глицина (0.06 М) бромпроизводные хлоранилинов с количественным выходом образуются уже за 1 мин и при более продолжительном бромировании их концентрации не изменяются, что свидетельствует об отсутствии их окисления в этих условиях (рис. 12, зависимости 1Б-3Б).
Аналогичные закономерности наблюдаются и при галогенировании фенолов – при прямом бромировании получаемые дериваты подвергаются окислению (рис. 13, зависимости 3 и 4 ).
Введение в бромирующую смесь аминокислоты исключает окисление при сохранении достаточно высокой скорости бромирования – оно заканчивается за 3-4 мин (рис. 13, зависимости 2-4). Следует также отметить, что растворы исследуемых аминокислот обладают буферным действием [383], что дополнительно стабилизирует условия получения галогенпро-изводных фенолов и анилинов в водных растворах.
Индексы удерживания замещенных фенолов и анилинов
Исключить окисление малоустойчивых бромпроизводных полностью не удается, но его скорость значительно снижается. Так, Кок бромпроизводных 2-МФ, 2,5-ДМФ и 2,3-ДМФ в присутствии -Ala составляют 12, 15 и 21 (–104Кок) соответственно, что в 1.6-2 раза меньше прежних значений (табл. 58). Концентрация бромпроизводных алкилфенолов, которые менее активно взаимодействуют с Br2, в этих условиях также достигают максимума (рис. 53).
Итак, получение бромированных алкилфенолов непосредственно в воде с максимальным выходом возможно при соблюдении следующих условий: – введение до проведения бромирования в анализируемый водный раствор -Ala для создания концентрации С(-Ala) = 0.1-0.3 M; – концентрации брома: 0.0005-0.001 М; – продолжительность контакта с Br2: 1 мин. Газохроматографические свойства алкилфенолов и их бромпроизводных
Бромированные алкилфенолы, в отличие от аналогичных производных хлорфенолов, могут рассматриваться в качестве самостоятельной аналитической формы. Хроматографиче-ские пики бромпроизводных алкилфенолов хоть и остаются асимметричными (рис. 54), но меньшая кислотность этих соединений не вызывает чрезмерного размытия хроматографиче-ской зоны.
Для сравнения газохроматографических свойств алкилфенолов и их бромированных форм использовали индексы удерживания (RI) и коэффициенты чувствительности ДЭЗ (KECDPh) значения которых представлены в табл. 32.
Наличие в молекуле алкильных радикалов практически не влияет на отклик ДЭЗ [378], поскольку не содержат атомов электроотрицательных элементов. Видно, что моно-, ди- и триалкилзамещенные фенолы характеризуются близкими значениями KECDPh. Прослеживается тенденция к снижению значений KECDPh с увеличением числа заместителей в ядре и удлинением алкильного радикала (табл. 32). Для бромированных алкилфенолов зависимость KECDPh от числа заместителей более явная. Так, максимальным значением KECDPh характеризуется трибромзамещенное 3-МФ (2134). Однако, дериват 3,5-ДМФ, также содержащий три атома брома, характеризуется KECDPh, значение которого в 2 раза меньше. Эту закономерность можно наблюдать и в других рядах однотипных бромпроизводных, отличающихся только количеством СН3-групп:
Наблюдаемые закономерности связаны, по-видимому, с уменьшением как подвижности молекул, так и стерическими препятствиями захвата электронов в ячейке ДЭЗ из-за перенасыщения аналитов заместителями.
Описанная выше зависимость KECDPh от положения и числа заместителей позволяет одновременно определять различно замещенные алкилфенолы методом ГХ/ДЭЗ (рис. 54). Хотя чувствительность ДЭЗ к бромированным алкилфенолам пропорциональна количеству введенных атомов галогена, но она уже не носит строго линейного характера и крайние значения KECDPh для моно-, ди- и тризамещенных отличаются всего в 20 раз:
Получение бромсодержащих производных алкилфенолов позволяет существенно повысить и селективность при хроматографическом разделении. Так, изомерные 4-МФ и 3-МФ, а также 3,5-ДМФ и 2,3-ДМФ, на полидиметилсилоксановой НЖФ неразделимы - ARI 5 (табл. 32). Введение атомов Вг в ароматическое ядро алкилфенолов значительно изменяет физико-химические и, следовательно, хроматографические свойства получаемых аналитических форм. Свойства бромпроизводных указанных пар изомеров настолько различаются, что ARI уже составляет 278 и 322, соответственно (табл. 32 и рис. 54). В целом, ARI для всех исследуемых бромированных алкилфенолов составляет более 20 единиц, что гарантирует их полное разделение на полидиметилсилоксановой НЖФ (табл. 32 и рис. 54) и позволяет эффективно применять программирование давления элюента и температуры термостата колонок. Несмотря на введение тяжелых заместителей (Вг), вызывающее увеличение RI в 1.4-1.8 раза, применение программирования позволяет добиться при полном разделении 10 анали-тов приемлемого времени ГХ-анализа - 25 мин (рис. 54).
После проведения бромирования, полученные аналитические формы не теряют способность в дальнейшей дериватизации из-за наличия активного атома водорода в ОН-группе. Как уже указывалось выше, бромированные формы рассматриваемых алкилфенолов элюи-руются отдельными хроматографическими пиками, поэтому повышать селективность разделения аналитов здесь не требуется. Однако для бромпроизводных алкилфенолов могут быть указаны следующие недостатки: - введение атомов Вг в ордао-положения к ОН-группе теоретически должно уменьшать активность ее взаимодействия с НЖФ и снижать размытие хроматографических зон, но на практике это не достигается - асимметрия пиков бромпроизводных явно прослеживается (рис. 54); - введение тяжелых заместителей (Вг) в ароматическое ядро снижает летучесть получаемых аналитов и плохо сочетается с методом газовой хроматографии.
Классический способ устранения таких недостатков - проведение этерификации фенолов (см. разд. 1.3.2.1), которая блокирует активность ОН-группы по отношению к НЖФ и, как правило, понижает температуры кипения получаемых эфиров. Для проведения дериватизации бромированных алкилфенолов по гидроксильной группе были выбраны хорошо зарекомендовавшие себя реагенты (см. разд. 1.3.2.1.1): – ангидрид трифторэтановой кислоты (TFAA); – ангидрид пентафторпропановой кислоты (PFAA); – ангидрид гептафторбутановой кислоты (HFAA); – хлорид перфторбензойной кислоты (PFB-Cl); – N-метил-N-трет-бутилдиметилсилил-трифторацетамид (MTBSTFA) – N,O-бис(триметилсилил)трифторацетамид (BSTFA);
Введение фторсодержащих ацильных фрагментов в молекулы бромированных алкил-фенолов сильно меняет их хроматографические характеристики (табл. 33). Так, введение перфторированных ацилов CF3CO-, C2F5CO- и даже C3F7CO-, действительно повышает летучесть модифицируемых соединений несмотря на введение достаточно тяжелых фрагментов в молекулу, – в случае HFAA его масса достигает 197 а.е.м. Повышенную летучесть соединений с фторсодержащими заместителями связывают со значительным снижением межмолекулярных сил притяжения и изменением формы молекул [390]. Увеличение индексов удерживания происходит только у пентафторбензоатов бромированных алкилфенолов (табл. 33 и рис. 55). Хотя здесь в молекулу вводится фрагмент с близкой массой (195 а.е.м.), большое влияние на летучесть фторсодержащих соединений оказывает еще строение и разветвлен-ность углеводородного радикала [391]