Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 7
1.1. Общая характеристика жирорастворимых витаминов 7
1.2. Основные методы определения и обнаружения жирорастворимых витаминов 13
1.2.1. Биологические, биохимические, химические, оптические и электрохимические методы 14
1.2.2. Хроматографические методы 16
1.3. Нормально-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография 30
1.3.1. Сорбенты 30
1.3.2. Подвижные фазы 31
1.3.3. Закономерности и модели удерживания 34
2. Экспериментальная часть 41
2.1. Цель и задачи исследования 41
2.2. Объекты, реактивы, аппаратура и расчет параметров разделения 41
2.3. Изотермы адсорбции жирорастворимых витаминов из н-гексана и их коэффициенты распределения 48
2.4. Измерение дипольных моментов и расчет критериев гидрофобности 52
2.5. Квантово-химические расчеты строения молекул витаминов 54
3. Разделение витаминов групп A, D, Е, К в нормально-фазовой ВЭЖХ 57
3.1. Элюирование н-гексаном и его бинарными смесями с полярными растворителями 57
3.2. Многопараметрическая оптимизация состава трехкомпонентнои подвижной фазы 77
3.3. Анализ более сложных смесей витаминов 100
4. Определение жирорастворимых витаминов в объектах пищевой, фармацевтической и парфюмерной промышленности 102
4.1. Расчет градуировочных уравнений и определение предела обнаружения витаминов 104
4.2. Определение витаминов групп А5 Е и D в поливитаминных фармацевтических препаратах 106
4.2.1. Определение витаминов в поливитаминных препаратах с водорастворимой матрицей 107
4.2.2. Унифицированная методика определения витаминов в поливитаминных препаратах 112
4.3. Определение витаминов групп А, Е и D в косметических кремах 121
4.4. Определение витаминов групп А и Е в продуктах детского питания 125
4.5. Определение витаминов групп А, Е и D в "мягких" маслах 130
4.6. Определение витамина Е в маслах растительного происхождения 135
Выводы 139
Литература 141
- Биологические, биохимические, химические, оптические и электрохимические методы
- Изотермы адсорбции жирорастворимых витаминов из н-гексана и их коэффициенты распределения
- Многопараметрическая оптимизация состава трехкомпонентнои подвижной фазы
- Определение витаминов в поливитаминных препаратах с водорастворимой матрицей
Введение к работе
Актуальность темы. Жирорастворимые витамины (ЖРВ) - незаменимые органические вещества, являющиеся биологическими катализаторами химических реакций и реагентами фотохимических процессов, протекающих в живой клетке. ЖРВ участвуют в обмене веществ преимущественно в составе ферментных систем и поступают в организм человека практически полностью из внешней среды. Для поддержания баланса витаминов в человеческом организме в профилактических и лечебных целях нашли широкое применение поливитаминные препараты, витаминизированные продукты питания и косметические средства. Одним из важнейших показателей потребительского качества продукции подобного рода является соответствие содержания биологически активных веществ согласно заявленной рецептуре. В связи с этим актуальной задачей аналитической химии витаминов является разработка экспрессных и высокоточных методик количественного определения содержания ЖРВ в многокомпонентных смесях.
Сложность этой задачи обусловливается высокой чувствительностью витаминов к термическому, фотоокислительному и химическому воздействиям; их низкими концентрациями в объектах анализа, содержащих наполнители, пищевые и минеральные добавки, красители и т.п. Эффективным способом решения данных проблем может стать применение метода изократической нормально-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (НФ ВЭЖХ) в сочетании с экстракционными способами пробоподготовки. К преимуществам изократического элюирования, по сравнению с градиентным, относятся стабильность базовой линии и низкий уровень "шумов", большая воспроизводимость параметров удерживания и невысокая стоимость серийных анализов. Градиентное элюирование, позволяющее разделять большее число витаминов, приводит к нестабильности базовой линии, более низкой воспроизводимости параметров удерживания и увеличению длительности анализа, поскольку после каждого цикла определения необходимо время для восстановления исходного рабочего режима колонки, требует дополнительного дорогостоящего оборудования.
Цель работы. Выбор оптимальных условий анализа и разработка экспрессных структуросберегающих методик аналитического контроля содержания ЖРВ в продуктах пищевой, фармацевтической и парфюмерной промышленности.
Работа выполнена в соответствии с Координационным планом Научного Совета РАН по адсорбции и хроматографии на 2000-2004 г., по проблеме "Применение хроматографических процессов для выделения и очистки биологически активных соединений", раздел 2.15.11.4.
Научная новизна. Для достижения поставленной цели решены следующие задачи: систематизированы и обобщены результаты исследования хроматографического поведения ретинилацетата, ot-токоферилацетата, менадиона, эргокальциферола на гидроксилированном силикагеле при изократическом элюировании н-гексаном, его бинарными и трехкомпонентными смесями с полярными модификаторами различных групп селективности; экспериментальным и квантово-химическим методами определены дипольные моменты витаминов; показана перспективность применения уравнения универсальной квазихимической модели удерживания для оценки роли межмолекулярных взаимодействий сорбат-сорбент, модификатор-сорбент, модификатор-сорбат, модификатор-модификатор; разработана процедура многопараметрической оптимизации состава трехкомпонентной подвижной фазы на основе симплекс-решетчатого планирования Шеффе {3, 3}, которая включает алгоритм проведения активного эксперимента и программу обработки полученных данных, разработанную в среде "Mathcad 2001"; предложена рациональная схема выбора алгоритма анализа пробы на содержание ЖРВ, исключающая этапы деструктивного разложения исходных форм определяемых веществ. Показана перспективность применения ультразвуковой обработки проб для интенсификации стадии экстракционного извлечения витаминов.
Практическая и теоретическая значимость работы.
На основании комплексного исследования хроматографического поведения ЖРВ и разработанной процедуры многопараметрической оптимизации состава трехкомпонентной подвижной/фазы выбран элюент оптимального состава я-гексан-1,2-дихлорэтан-1,4-диоксан, который в условиях изократической нормально-фазовой ВЭЖХ на гидроксилированном силикагеле обеспечивает эффективное разделение сложных смесей витаминов: р-каротин, ретинилпальмитат (или токоферол), ретинилацетат, токоферилацетат, менадион, эргокальциферол (или холекальциферол).
С использованием оптимальной хроматографической системы разработаны экспрессные структуросберегающие методики количественного определения Р-каротина, ретинилпальмитата, ретинилацетата, токоферола, токоферилацетата, эргокальциферола и холекальциферола в продуктах пищевой (каши, "мягкие" и растительные масла), фармацевтической (поливитаминные препараты) и парфюмерной (косметические кремы) промышленности.
Методики количественного определения жирорастворимых витаминов в "мягких" и растительных маслах внедрены на предприятиях Белгородской и Тульской областей.
Предложенная процедура многопараметрической оптимизации состава трехкомпонентной подвижной фазы является достаточно универсальной, и ее применение может быть расширено.
Установленные зависимости удерживания и параметры разделения витаминов от состава элюентов, позволяющие оптимизировать условия разделения различных смесей ЖРВ, представляется целесообразным включить в хроматографические базы данных.
Положения, представляемые к защите:
Закономерности хроматографического поведения витаминов на гидроксилированном силикагеле при элюировании н-гексаном и его смесями с полярными растворителями.
Анализ закономерностей удерживания, межмолекулярных взаимодействий и механизмов удерживания ЖРВ с позиций теории универсальной квазихимической модели удерживания в ВЭЖХ, данных по адсорбции и пространственно-электронном строении молекул сорбатов.
Процедура многопараметрической оптимизации состава трехкомпонентной подвижной фазы для разделения смеси ЖРВ.
Методики экстракционно-хроматографического определения витаминов в реальных объектах.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международных конференциях по аналитической химии (Алматы, 1998 г.), "Концентрирование в аналитической химии" (Астрахань, 2001 г.), "Проблемы сольватации и комплексообразования в растворах" (Иваново, 1998 и 2001 г.); XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 1998 г.); II Международной научно-технической конференции "Актуальные проблемы химии и химической технологии "Химия-99"" (Иваново, 1999 г.); Международном симпозиуме "Разделение и концентрирование в аналитической химии" (Краснодар, 2002 г.); Всероссийской конференции "Химический анализ веществ и материалов" (Москва, 2000 г.); VI, VIII, IX Региональной научно-технической конференции "Проблемы химии и химической технологии" (Воронеж, 1998 и 2000 г., Тамбов 2001 г.); VI конференции "Аналитика Сибири и Дальнего Востока" (Новосибирск, 2000 г.); Поволжской конференции по аналитической химии (Казань, 2001 г.).
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 35 печатных работ, из них: 9 статей в "Журнале аналитической химии", "Журнале физической химии", журналах "Заводская лаборатория. Диагностика материалов", "Известия вузов. Химия и химическая технология", "Сорбционные и хроматографические процессы" и "Экология ЦЧО РФ"; 8 статей в сборниках статей и трудов конференций; 18 тезисов докладов.
Структура и объем диссертации:
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, трех разделов экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы и восьми приложений. Работа изложена на 197 страницах машинописного текста, содержит 30 рисунков и 38 таблиц. Список литературы включает 200 наименований.
Биологические, биохимические, химические, оптические и электрохимические методы
Жирорастворимые витамины (ЖРВ) - это незаменимые биологически активные соединения органической природы, которые в организме человека не синтезируются или синтезируются в незначительных количествах. Специфичность химического строения ЖРВ определяет их высокую физиологическую активность. Они обеспечивают нормальный зрительный процесс, реакции, связанные с кроветворением и кальцификацией костей, устраняют проницаемость капиллярных сосудов, предупреждают ожирение печени, расщепляют вещества, токсически действующие на нервные клетки, катализируют реакции переаминирования, декарбоксилирования, гидрирования и дегидрирования с образованием и разрушением связей С=С ; С=0; C=N, С-С, C-N и C-S, осуществляя нормальное функционирование органов и желез внутренней секреции /1-7/.
Отсутствие ЖРВ в организме человека, в количествах, необходимых для его нормальной жизнедеятельности и функционирования, приводит к гипо- и авитаминозам /3,6, II. При потреблении витаминов в количествах, превышающих необходимые /6, 7/, их концентрация в организме достигает токсического уровня, вызывая гипервитаминоз /3, 5/.
Жирорастворимые витамины условно делят на пять основных групп /1-4, 6, II: А (ретинолы и каротиноиды), Е (токоферолы). К (филлохиноны), D (кальциферолы), F (незаменимые полиненасыщенные жирные кислоты).
К ретинолам относятся соединения с общей формулой С20Н30О, в структуре которых присутствует триметилгексеновое кольцо, связанное с тетраеновой сопряженной цепью изопреноидного типа, оканчивающейся оксиметильной группой.
Для витамина А в соответствии с количеством двойных связей аолиеновой алифатической цепи возможно 16 геометрических изомеров. Из теоретически возможных стереоизомеров ретинола число изомеров, не испытывающих пространственных затруднений и полученных синтетически или из природных источников ограничивается четырьмя: полный транс-, 9-цис, \Ъ-цис и 9,13-ди- ис-ретинол. Остальные 12 изомеров пространственно затруднены и синтетически из них получены только два 1 \-цис и 11,13-ди- wc-ретинол. Полиеновая сопряженная система ретинолов представляет собой хромофор, обуславливающий окраску этих соединений. В /ираноконфигурациях вся система двойных связей выступает как общий хромофор, свободно проводящий электронные колебания от конца к концу сопряженной системы. Изгибание зигзагообразной молекулы при цис-превращениях связано с уменьшением общего хромофора или с разрывом его на частичные хромофоры с укороченными полнено выми системами; полосы поглощения таких соединений смещены в коротковолновую часть с ослаблением их интенсивности. Изомеры ретинола с цепью искривленных tywc-конфигурацшши двойных связей обладают меньшей биологической активностью, чем полный /пракс-ретинол /4/.
Ретинолы представляют собой желтоватые маслообразные или низкоплавящиеся кристаллические вещества, легко окисляемые кислородом воздуха, подверженные деструктивному разложению под действием УФ-излучения и температуры, неустойчивые к минеральным кислотам и щелочам. Для витаминов группы А характерна растворимость во многих органических растворителях (бензол, ацетон, хлороформ, н-гептан, л-гексан и др.); они растворимы в жирах и совершенно нерастворимы в воде.
(З-Каротин представляет собой кристаллическое вещество темно-красного или темно-фиолетового цвета. Каротин очень чувствителен к различным химическим воздействиям, но устойчив к действию щелочей. Длительное термическое воздействие вызывает изомеризацию и расщепление молекулы. Кислоты не оказывают влияния в отсутствие воздуха, однако в присутствии кислорода сильно ускоряют окисление и распад каротина, с предварительной изомеризацией промежуточных соединений /4/.
Фармацевтической промышленностью витамины группы А в основном производятся в виде (Ь-каротина и эфиров (ретинилацетат и ретинилпальмитат), характеризующихся большей устойчивостью к умеренно\гу нагреванию и длительному хранению в виде кристаллов, запаянных в капсулы под вакуумом, в масляных и спиртовых растворах, в посуде, защищенной от действия прямого УФ-излучения /4, 8/.
Витамины группы D (кальциферолы) являются производными 6-(3-Р-окси-10 метилциклогексан-5-илен)-7-(13-Р-метилгидриндан-8-илен)-этана, замещенными в положении 17 алифатической разветвленной цепью из 8-10 атомов углерода. Они относятся к классу секостероидов, являющихся одним из главных регуляторов обмена кальция в организме. Сходство строения витаминов группы D и стеринов носит генетический характер 14,9/, поскольку они образуются в результате фотоизомеризации соответствующих стеринов. В молекулах кальциферолов, помимо двух циютогексановых и одного конденсированного циклопентанового кольца, присутствует характерная ненасыщенная система трех сопряженных двойных связей: Cs-Сб, С7-С8, Сю-Cig, ответственная за поглощение в УФ-области.
Витамины группы D имеют близкие физико-химические свойства /1, 2, 4/, которые обусловлены схожестью их химического строения. Это бесцветные кристаллы без запаха, хорошо растворимые в органических растворителях (спирт, ацетон, н -гексан, я-гептан, хлороформ и т. д.), жирах и нерастворимые в воде. Эрго- и холекальциферол устойчивы по отношению к минеральным кислотам, щелочам и нагреванию (до 125 С); однако уже при комнатных температурах чувствительны к кислороду воздуха; способны легко образовывать сложные эфиры.
Из природных источников выделены эргокальциферол (D2), холекальциферол (D3) и дигидроэргокальциферол (D4) /4/. В практических целях нашли широкое применение эрго- и холекальциферол /5-7/, синтез которых осуществляется в промышленном масштабе.
Витамины группы Е являются производными 6-окси-2-метил-2-(4 ,8 ,12 -триметилтридецил)-хромана или токола. При полном метилировании бензольного ядра токола образуется а-токоферол (5,7,8-триметилтокол).
Токоферолы - прозрачные маслянистые жидкости светло-желтого цвета, нерастворимые в воде, хорошо растворимые в диэтиловом и петролейном эфирах, н-гексане, хлороформе, хуже - в спиртах и ацетоне. а-Токоферол чувствителен к УФ-излучению и действию окислителей. При мягком окислении молекулярным кислородом, солями серебра, хлорными железом и золотом, сернокислым церием и электролитическим путем образуется желтый у-оксиалкил-и-хинон; при действии азотной кислотой в спиртовом растворе происходит окисление в положении 5, с образованием о-токохинона; озон, марганцевокислый калий, пербензойная кислота, производят более глубокие изменения молекулы токоферола. Устойчив к нагреванию (до 200 С) в присутствии кислорода и действию минеральных кислот (до 100 С); реагирует с щелочами; способен к образованию сложных эфиров с фософорной, уксусной, пропионовой, янтарной, капроновой, стеариновой, бензойной и пальмитиновой кислотами. Сложные эфиры а-токоферола обладают меньшей биологической активностью по сравнению с витамином Е /10, 11/. Являясь сильными восстановителями, токоферолы проявляют антиоксидантные свойства, связанные с предотвращением процессов окисления органических веществ, протекающих по свободнорадикальному механизму.
Изотермы адсорбции жирорастворимых витаминов из н-гексана и их коэффициенты распределения
Квантово-химические расчеты геометрического и электронного строения молекул ЖРВ осуществляли на персональном компьютере с процессором Pentium II 400 МГц, RAM 128 Мбайт, HDD 20 Гбайт в программном пакете "HyperChem 5.0" (HyperChem, Hypercube, Inc., 1115 NW 4th Street, Gainesville, Florida 32601, USA). Компьютерное моделирование проводили полуэмпирическим методом РМЗ /163, 164/, с полной оптимизацией геометрических параметров молекул по алгоритму Polak-Ridber. Выбор метода РМЗ обусловлен соответствием результатов расчета геометрических и электронных параметров молекул органических соединений /165-171/ с данными ab initio (неэмпирических) расчетов и экспериментов. Достаточно большие размеры исследуемых систем практически не позволяют провести неэмпирические расчеты в расширенных базисах.
Результаты расчета геометрических и электронных параметров молекул ЖРВ в развернутом виде представлены в приложении 1. Наиболее поляризованными участками в молекулах витаминов являются атомы кислорода и их ближайшее окружение, которые могут быть активными центрами в межмолекулярном водородном связывании. В молекулах сложных эфиров (А-ацетат, Е-ацетат) при наличии sp -гибридизованного атома углерода сложноэфирной группировки относительно эфирного атома кислорода наблюдается цисоидная конформация, наиболее предпочтительная для сложных эфиров /172/. Поворот полиеновой цепи в молекуле полностью транс-ретинилацетата относительно циклогексенового цикла (торсионный угол Сі8-Сі9-Сп-Сіб) составляет 61.50, что соответствует экспериментальным данным для 20 подобных соединений /173/. Циклогексеновое кольцо имеет конформацию "полукресло".
В молекуле витамина Е-ацетат торсионный угол О29-С30-С22-С21, образованный углеводородной цепочкой линейного строения, относительно гетероциклического кольца составляет 56.68; в гетероциклическом и сопряженном ему бензольном кольце наблюдаются отклонения от плоскостного строения.
Для полиеновой системы (С24=С2з-С25-Сгб) эргокальциферола предпочтительна S-/яра«с-конфигурация, так как для s-г с-конфигурации характерны большие стерические помехи. Гидроксильная группа у Сг-атома расположена в экваториальной плоскости, что характерно для стериновых провитаминов /4/. Кольца С и D в молекуле эргокальциферола соединены путем транс-сочленения, заместители: ангулярная метильная группа у С22 и алифатическая боковая цепь у Сго, пространственно представляют р-конфигурацию (т. е. находятся в г/ис-положении и, условно, лежат над плоскостью чертежа молекулы), которая характерна для стеринов /4, 9/. Циклогексановые кольца А и С по своей конформации представляют собой энергетически более выгодную форму "кресло". Полученные результаты квантово-химического расчета пространственного строения молекулы витамина D2 подтверждаются литературными данными /4, 9/.
Сопряженная система колец молекулы менадиона имеет плоскостное строение. Рассчитанная энергия образования витамина Кз (-133.72 кДж/моль) соответствует экспериментально измеренным энтальпиям образования и окисления родственных соединений /174/. Сопоставление рассчитанных в настоящей работе значений дипольных моментов (ip, D: 2.288 - А-ацетат, 2.547 - Е-ацетат, 1.136 - Кз, 1.587 - D2) с экспериментальными (табл. 2.4) свидетельствует о хорошей сходимости эксперимента с расчетом. Существующее расхождение между цр и \хэ для эргокальциферола вызвано, вероятно, пренебрежением при расчете фактом существования молекулы в виде смеси конформеров, а также наличием свободного или заторможенного внутримолекулярного вращения отдельных фрагментов молекулы вокруг простых связей. Величина дипольного момента, экспериментально измеренного в данной работе, имеет существенно меньшие отклонения от расчетной по сравнению с приведенной в работе /103/.
Хроматографическое поведение витаминов А-ацетат, Е-ацетат, Кз, D2 на гидроксилированном силикагеле изучено при элюировании н-гексаном (неактивный компонент подвижной фазы) и его смесями с полярными растворителями (активный компонент подвижной фазы, специфический модификатор) I (диэтиловый эфир), II (метанол, н-пропанол, изопропанол, н-бутанол, изобутанол, к-пентанол, изопентанол, н-гексанол, н-октанол, н-деканол), III (тетрагидрофуран), V (дихлорметан, 1,2-дихлорэтан), VI (этилацетат, бутилацетат, 1,4-диоксан), VIII (хлороформ) групп селективности по классификации Снайдера. Результаты исследования представлены в табл. 3.1.
При элюировании витаминов н-гексаном наблюдается значительное удерживание сорбатов (к 32, табл. 3.1) с одновременным формированием размытых в тыловой области асимметричных хроматографических пиков (As 1.5, табл. 3.1) и значительное уменьшение удерживания с увеличением концентрации витамина в инжектируемой пробе. Рассчитанные из изотерм константы распределения ЖРВ уменьшаются с ростом концентрации сорбатов, что согласуется с соответствующими временами их удерживания (табл. 2.3). Это соответствует типу выпуклой изотермы сорбции, L-изотерме по классификации Гильса /175/. Такая изотерма типична для вещества сорбируемого за счет физической адсорбции на сорбенте с энергетически неоднородной поверхностью /39, 88, 108, 125/. Размывание и перекрывание хроматографических зон определяемых веществ затрудняет их количественную идентификацию. Система H-reKcaH-Silasorb-600 характеризуется низкой избирательностью сорбента по отношению к паре Е-ацетат/Кз и, как следствие, малой эффективностью их разделения (Rs = 0.13).
Отсутствие корреляции между факторами емкости, параметрами гидрофобности и диполь ными моментами (табл. 2.4) молекул ЖРВ позволяет предполагать, что дисперсионные и диполь-дипольные межмолекулярные взаимодействия не доминируют в системе витамин-н-гексан. Наблюдаемый порядок элюирования ЖРВ (табл. 3.1, рис. 2.1) аналогичен эмпирическому ряду удерживания на специфических силикагелях, соответствующему увеличению водородного связывания в ряду функциональных групп сорбатов: простая эфирная сложноэфирная хиноидная гидроксильная /96/.
Многопараметрическая оптимизация состава трехкомпонентнои подвижной фазы
Для оценки хроматографических возможностей элюентов с добавками алифатических спиртов содержание модификатора (я-бутанола) меняли от 0.0014 до 0.0284 мол. долей. Выбор н-бутанола определялся его промежуточным положением между спиртами с низкими (Сі-Сз) и высокими (Cs-Сю) молекулярными массами, что позволило достичь оптимальных значений к и As при меньших концентрациях спирта и большего относительного прироста величины Rs для трудно делимой пары А-ацетат/Е-ацетат.
Подвижная фаза я-гексан-н-бутанол во всем диапазоне изменения концентраций модификатора обеспечивает эффективное отделение пиков витаминов Кз и D2 от суммарного пика витаминов Е-ацетат и А-ацетат. Зависимость IIк = f(Mm) (рис. 3 приложения 2), для адекватного описания которой требуется применение полинома третьего порядка, имеет сложный вид. Это свидетельствует о многообразии процессов протекающих в рассматриваемой хроматографической системе и изменениях механизма удерживания ЖРВ по мере увеличения содержания полярной добавки в элюенте. При низких концентрациях модификатора (не более 0.0029 мол. долей), т.е. в отсутствие ассоциатов в растворе, молекулы адсорбатов могут образовывать водородные связи с силанольными группами поверхности силикагеля. При содержании спирта от 0.0029 до 0.0180 мол. долей поверхность силикагеля уже в значительной мере покрыта молекулами модификатора, и удерживание ЖРВ происходит на адсорбционно модифицированной поверхности силикагеля. В этом случае наклон зависимости I/к = f(Mm) меньше, а отрезок, отсекаемый на оси ординат при Мт = 0, больше, чем для области низких концентраций. Это свидетельствует об ослаблении взаимодействия витаминов с модифицированной поверхностью силикагеля по сравнению с исходной гидроксилированной и о возрастании роли межмолекулярных взаимодействий модификатор-модификатор. Дальнейшее увеличение полярности подвижной фазы (Мот 0.0180) приводит к увеличению угла наклона зависимости, что связано с межмолекулярными взаимодействиями сорбат-модификатор. Модификаторы с диполь-дипольными свойствами Применение элюентов с добавками 1,2-дихлорэтана (дихлорметана) не менее 0.1554 (0.1848) мол. долей приводит к изменению последовательности элюирования ретинилацетата и а-токоферилацетата по сравнению с н-гексаном. Возрастание роли диполь-дипольных взаимодействий сопровождается отклонением от линейности зависимостей 1/к = f{Mm) (рис. 4 и 5 приложения 2). Значения Rs для пар Е-ацетат/Кз и K3/D2 во всем диапазоне изменения концентраций модификаторов V группы больше единицы; для пары Е-ацетат/А-ацетат в области от 0.1554 до 0.6235 мол. долей 1,2-дихлорэтана и от 0.1848 до 0.4665 мол. долей дихлорметана разрешение возрастает и достигает максимума соответственно при 0.6235 (Rs =0.3%) и 0.4665 ( 5=0.84) мол. долях. Значения к и As достигают области оптимальных значений при содержании 1,2-дихлорэтана (дихлорметана) не менее 0.3431 (0.2793) и 0.2200 (0.1848) мол. долей соответственно. Модификаторы с протоноакцепторными и диполь-дипольными свойствами Тетрагидрофуран и 1,4-диоксан относятся к простым циклическим эфирам; для оценки их влияния целесообразно проводить сравнение с подвижной фазой, модифицированной диэтиловым эфиром. Замена диэтилового эфира на тетрагидрофуран существенно влияет на изменение селективности удерживания сорбатов (табл. 3.1, рис. 1 и 6 приложения 2). Алкильные группы тетрагидрофурана "объединены" в циклическую структуру, что делает его кислородный атом более "открытым" по сравнению с атомом кислорода в молекуле диэтилового эфира /176-180/. В связи с этим тетрагидрофуран способен легче образовывать водородные связи, т.е. склонен к созданию более эффективного модифицирующего слоя на поверхности сорбента, чем диэтиловый эфир. Зависимости 1/к = f(Mm) для витаминов А-ацетат, Е-ацетат, Кз (рис. 6 приложения 2) наиболее адекватно (приложение 4) описываются полиномом второго порядка, учитывающим взаимодействия сорбат-сорбент, модификатор-сорбент и модификатор-модификатор (табл. 3.3). Поэтому можно предполагать, что удерживание этих сорбатов осуществляется на адсорбционно модифицированной поверхности силикагеля. Функциональная зависимость 1/ к = f(M,„) витамина D2 близка к линейной, т.е. молекулы эргокальциферола могут непосредственно контактировать с поверхностными ОН-группами сорбента, вытесняя с нее молекулы модификатора. Отличие в механизмах удерживания витаминов А-ацетат, Е-ацетат и Кз от D2 сопровождается различной динамикой изменения коэффициентов асимметрии пиков, факторов емкости и разрешений (табл. 3.1): As для первых трех сорбатов оптимальны при содержании тетрагидрофурана не более 0.0094 мол. долей, тогда как для D2 только при 0.0310 мол. долях; А для Бг во всем диапазоне концентраций модификатора больше 20, на фоне резкого снижения факторов емкости остальных сорбатов с увеличением полярности элюента; при увеличении содержания тетрагидрофурана в элюенте разрешение для пар А-ацетат/Е-ацетат и Е-ацетат/Кз уменьшается, а для K3/D2 увеличивается.
При введении диоксана в концентрации недостаточной для создания эффективного монослоя модификатора на поверхности сорбента As для пары А-ацетат/Е-ацетат близко к единице, As для всех сорбатов (кроме Кз и D2) и к (кроме D2) оптимальны (табл. 3.1). Содержание диоксана более 0.0031 мол. долей, достаточное для модифицирования поверхности сорбента, приводит к изменению порядка элюирования витаминов А-ацетат и Е-ацетат (рис. 7 приложения 2). Это связано с высокой сорбционной активностью 1,4-диоксана на гидроксилированном силикагеле /181/ и его способностью к диполь-дипольным взаимодействиям с молекулами сорбатов /39, 109/. Высокая сорбционная активность диоксана обусловлена особенностями его строения /176-179/: 1,4-диоксан содержит два эфирных атома кислорода на четыре атома углерода с локализованными р-электронами, т.е. способен образовывать большее число водородных связей, чем тетрагидрофуран или диэтиловый эфир, и соответственно, перекрывать одной молекулой доступ сразу к нескольким центрам адсорбции на поверхности сорбента, формируя эффективный модифицирующий слой. Однако способность этого растворителя к диполь-дипольным взаимодействиям недостаточна для того, чтобы более полно подчеркнуть различие в полярности молекул ЖРВ. Поэтому с ростом концентрации диоксана в подвижной фазе разрешения для всех пар сорбатов, проходя через максимумы, уменьшаются, оставаясь для пары пиков А-ацетат/Кз и K3/D2 больше единицы (табл. 3.1).
При введении в состав подвижной фазы сложных эфиров на поверхности сорбента отсутствует эффективный адсорбционно-закрепленный модифицирующий слой. Это подтверждается линейным видом зависимостей I/ к = f(Mm) (рис. 8 и 9 приложения 2, табл. 3.3) и порядком выхода ЖРВ из хроматографической колонки, аналогичным ряду установленному при элюировании / -гексаном. Во взаимодействии витамин-модификатор в большей степени проявляются диполь-дипольные, а во взаимодействии модификатор-сорбент - протоноакцепторные свойства подвижной фазы. Значения Rs для всех пар витаминов больше единицы, но к для эргокальциферола существенно превышает 20 и As всех витаминов более 1.5. Увеличение содержания сложных эфиров приводит к ухудшению разрешения пар сорбатов на фоне уменьшения к витаминов и повышения симметричности профилей хроматографических пиков (табл. 3.1). При концентрациях этилацетата (н-бутилацетата) в н-гексане более 0.0250 (0.0190) мол. долей As и к для всех витаминов входят в диапазон оптимальных значений, но Rs для пары А-ацетат/Е-ацетат близко к нулю.
Определение витаминов в поливитаминных препаратах с водорастворимой матрицей
Пробоподготовка. Для усреднения состава пробы брали десять драже (таблеток) и измельчали в агатовой ступке. Навеску исследуемого препарата, равную массе одного драже (таблетки), взвешивали на аналитических весах и количественно переносили в мерную колбу емкостью 100 мл, доводили до метки дистиллированной водой, закрывали пробкой и перемешивали до растворения пробы. Аликвотную часть (50 мл) полученного раствора помещали в делительную воронку и дважды по 8 мин экстрагировали 5 мл н-гексана. Экстракты, отделенные с помощью пипетки от водной фазы, объединяли.
Концентрирование. При анализе поливитаминных препаратов, содержащих витамины группы D, дополнительно проводили концентрирование пробы. Для этого аликвотный объем (8 мл) н-гексанового экстракта помещали в стеклянный градуированный капилляр и упаривали до объема 0.2 мл на водяной бане при 50-60 С, с одновременным пропусканием над поверхностью жидкости азота. По мере испарения экстрагента стеклянный капилляр ополаскивали 5-6 раз небольшими порциями н-гексана (по 2-3 мл) из стеклянной пипетки.
Хроматографирование. Из экстрактов (концентратов) микрошприцем МШ-10М отбирали пробу объемом 10 мкл и вводили в колонку хроматографа.
Обработка результатов анализа. Количественную обработку результатов хроматографического анализа осуществляли методом абсолютной градуировки с применением ранее полученных уравнений (табл. 4.1). Градуировка проверялась не реже одного раза в неделю. Содержание витаминов в одном драже (таблетке) рассчитывали по формуле: где сг - концентрация витамина, рассчитанная по градуировочному уравнению, мг/мл; Уэ - объем экстрагента, равный 5 мл; NK - коэффициент концентрирования, равный 8/0.2 - 40; VK - объем колбы, равный 100 мл; Va - объем аликвоты, равный 50 мл. Метрологические характеристики методики представлены в табл. 4.5. Правильность, при сравнении с заявленным изготовителем содержанием ЖРВ, составляет 92.82-97.09%. Время проведения анализа не более 60 мин.
При разработке методики определения ЖРВ в поливитаминных препаратах с водонерастворимой матрицей в качестве экстрагентов р-каротина и токоферилацетата препарата "Триовит" применили «-гексан, изопропанол, 1,2-дихлорэтан и смесь н-гексан-изопропанол в объемных соотношениях 4:1, 3:2, 2:3, 1:4. Экстракционное извлечение проводили на электронном механическом встряхивателе THYS 2, с частотой 6 Гц в течение 5-60 мин. Для н-гексана характерны невысокие значениями степеней извлечения витаминов (рис. 4.3, а). Введение в состав экстрагента изопропанола приводит к растворению компонентов матрицы, что сопровождается появлением на хроматограмме неидентифицируемых пиков (рис. 4.4). Формирование примесных хроматографических зон вблизи пиков определяемых витаминов резко снижает разрешающую способность хроматографической системы и затрудняет количественную обработку хроматограмм. Применение 1,2-дихлорэтана в качестве экстрагента позволило достичь наиболее высоких степеней извлечения ЖРВ при незначительном растворении компонентов матрицы (рис. 4.4). Более полного извлечения ( 95 %) р-каротина при однократном экстрагировании достичь не удалось (рис. 4.3, б).
Из препаратов "Мультифит-М" и "Apicenter" витамины экстрагировали 1,2-дихлорэтаном. Зависимость степени извлечения ЖРВ от времени экстрагирования представлена на рис. 4.5. За 40-45 мин для всех витаминов, кроме р-каротина, достигается удовлетворительная степень извлечения.
Экстракционное извлечение ЖРВ 1,2-дихлорэтаном под действием механических колебаний сопровождается затратами времени на пробоподготовку и концентрирование проб, превышающими длительность хроматографического определения в 3-4 раза; р-каротин полностью извлечь из препарата оказалось невозможным. Поэтому изучено влияние на пробу ультразвукового воздействия (УЗ), генерируемого ультразвуковым низкочастотным диспергатором УЗДН-1. Пробы обрабатывали УЗ частотой 22 кГц с интенсивностью 15 Вт/см2 в течение 0.5-5.0 мин. Это приводит к повышению степени извлечения всех ЖРВ с 5-20 % до 97-99 % при однократном извлечении в течение 3 мин (рис. 4.3, 4.5 и 4.6).
