Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 2
2. Обзор литературы 6
2.1. Общая модель хирального распознавания при хроматографическом разделении энантиомеров 6
2.2. Классификация хиральных неподвижных фаз 7
2.2.1. Ковалентно закрепленные хиральные селекторы 11
2.2.2. Полимерные хиральные селекторы 13
2.3. Строение и методы синтеза хиральных неподвижных фаз на основе низкомолекулярных селекторов 15
2.4. Эволюция хиральных неподвижных фаз, работающих по принципу образования комплексов с переносом заряда 18
2.5. Хиральные неподвижные фазы, содержащие я-донорную и я-акцепторную группы 26
2.6. Модель энантиораспознавания для хиральных селекторов, работающих по принципу образования комплексов с переносом заряда 31
2.7. Прочие хиральные неподвижные фазы на основе низкомолекулярных хиральных селекторов 34
2.8. Новые подходы при синтезе ХНФ на основе низкомолекулярных хиральных селекторов 50
2.9. Заключение 55
3. Экспериментальная часть 59
3.1. Исходные вещества, аппаратура, методика эксперимента 59
3.2. Синтез сорбентов 62
3.3. Изучение параметров матриц полученных ХНФ 66
3.4. Изучение хроматографических свойств силикагеля, модифицированного хитозаном и его производными 72
3.5. Изучение адсорбции оптических изомеров 1,Г-бинафтил-2,2'-диола на хиральных неподвижных фазах 75
3.6. Характеристика синтезированных хиральных селекторов 81
3.7. Хроматографическое исследование сорбентов 84
3.8. Изучение энантиоселективных свойств сорбентов, модифицированных N-(0)-пропил-1Ч-(8)-(1-фенилэтил)-тиооксамидом 100
3.9. Изучение удерживания тестовых соединений на силикагеле, модифицированном М-(3,5-динитро,4-хлор)-(Ь)-фенил-аланинолом 110
3.10. Изучение энантиоселективных свойств сорбентов, модифицированных ДНБ-фенилаланинолом 125
Выводы: 137
- Классификация хиральных неподвижных фаз
- Модель энантиораспознавания для хиральных селекторов, работающих по принципу образования комплексов с переносом заряда
- Изучение параметров матриц полученных ХНФ
- Изучение энантиоселективных свойств сорбентов, модифицированных N-(0)-пропил-1Ч-(8)-(1-фенилэтил)-тиооксамидом
Введение к работе
Актуальность темы. Феномен оптической изомерии является неизменным атрибутом живого мира. Бурное развитие биохимических исследований, возросшие требования фармацевтической промышленности и новые возможности современной медицинской химии требуют разработки методов получения оптически-чистых форм соединений. ВЭЖХ является одним из наиболее мощных методов разделения веществ с близкими свойствами, в том числе и энантиомеров. Разделение оптических изомеров принципиально возможно только в системах, содержащих хиральный селектор.
Для того чтобы молекула, содержащая оптически активный центр, могла проявить себя как селектор, способный специфично «распознавать» пространственную конфигурацию энантиомеров, в ней необходимо наличие нескольких функциональных групп, взаимодействующих с разделяемыми молекулами. Причем, расположение этих групп в пространстве должно в большей степени соответствовать строению одного из оптических изомеров.
Метод ВЭЖХ с хиральными неподвижными фазами (ХНФ) широко применяется для разделения оптических, изомеров органических соединений. Наибольшее распространение получили ХНФ на основе низкомолекулярных хиральных селекторов, закрепленных на силикагеле. Строение хиральных селекторов в этих неподвижных фазах строго задается схемой синтеза, что позволяет целенаправленно изменять их структуру и изучать энантиоселективные свойства на вполне рациональной основе. Наибольшее развитие получили низкомолекулярные селекторы на основе образования комплексов с переносом заряда (так называемые фазы Пиркла) и селекторы, работающие по принципу образования водородных связей. Пока немногочисленный класс ариламидных селекторов, сочетающий в себе свойства обоих типов является наиболее перспективным. Поэтому создание новых ариламидных хиральных селекторов и изучение возможностей их применения является весьма актуальной задачей.
Разница в силах взаимодействия пары оптических изомеров с хиральным селектором незначительна. В связи с этим необходимо тщательно подбирать условия хроматографического разделения. В первую очередь - состав подвижной фазы. Компоненты подвижной фазы влияют не только на «элюирующую силу», но и активно участвуют в процессе энантиораспознавания разделяемых оптических изомеров. Понимание процессов, лежащих в основе энантиораспознавания, и прогнозирование оптимальных условий разделения оптических изомеров возможно только при детальном изучении закономерностей удерживания и разделения энантиомеров различных классов органических соединений.
Цель работы состояла в разработке и синтезе новых низкомолекулярных хиральных селекторов и изучении хроматографических и энантиоселективных свойств силикагелей, модифицированных этими селекторами. Для достижения этой цели были решены следующие задачи:
Разработаны методики синтеза хиральных неподвижных фаз путем модификации аминопропилсиликагелей Н-(5)-пропил-К-(0)-(1-фенилэтил)-тиооксамидом и N-(3,5-динитрофенил)фенилаланинолом;
Изучена возможность хирального распознавания эцантиомеров различной структуры и полярности (траис-стильбеноксида, флаванона, бензоина, 1-фенил-1-пропанола, 1-фенил-2-пропанола, 1-фенил-1,2-этандиола, 1,Г-бинафтил-2,2'-диола и основания «Трёгера») на синтезированных хиральных неподвижных фазах в условиях нормально-фазовой жидкостной хроматографии;
Исследована зависимость энантиоселективных свойств от строения молекул хирального селектора и от плотности их пришивки к поверхности сорбента на примере разделения оптических изомеров основания «Трёгера» и 1,Г-бинафтил-2,2'-диола;
Установлены закономерности влияния природы и концентрации полярной добавки в подвижной фазе на удерживание и энантиоселективность разделения модельных соединений.
Изучены энантиоселективные свойства хиральной неподвижной фазы на основе N-
(3,5-динитрофенил)фенилаланинола по отношению к оптически-активным амидам и
предложены условия хроматографического разделения оптических изомеров, определено
их соотношение для К-(фенилэтил)-фенилацетамида, N-[l-(l-
нафтил)этил]фенилацетамида и Н-[1-(4-хлорфенил)этил]фенилацетамида..
Научная новизна. Получены хиральные неподвижные фазы для жидкостной хроматографии на основе К-(5)-пропил-М-(0)-(1-фенилэтил)-тиооксамида и N-(3,5-динитрофенил)фенилаланинола, энантиоселективность которых определяется суммарным эффектом водородных связей и 71-я взаимодействий с оптическими изомерами. Созданные сорбенты могут успешно применяться для разделения энантиомеров І.Г-бинафтил-2,2'-диола, основания «Трёгера» и ряда ароматических амидов в условиях нормально-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Показано, что с увеличением плотности пришивки молекул хирального селектора на поверхности энантиоселективные свойства сорбента улучшаются.
По изотермам адсорбции индивидуальных изомеров 1,Г-бинафтил-2,2'-диола оценены вклады в удерживание энантиоселективных и неселективных взаимодействий между молекулами сорбата и сорбента.
Проведено систематическое изучение влияния природы полярной добавки на удерживающие и на энантиоселективные свойства синтезированных сорбентов. Установлено, что молекулы полярной добавки участвуют в процессе хиральной дискриминации и оказывают значительное влияние на разделение оптических изомеров, основной вклад в удерживание вносит образование водородных связей.
Практическая значимость: Предложены простые схемы синтеза хиральных неподвижных фаз из доступных и недорогих реактивов и материалов. Проведена оптимизация состава подвижной фазы (концентрации и природы полярной добавки) для повышения селективности и эффективности разделения оптических изомеров. Выбраны подвижные фазы, позволяющие разделить с разрешением больше 1,0 энантиомеры ряда соединений, играющих важную роль в качестве промежуточных хиральных соединений при синтезе биологически активных структуре, Г-бинафтил-2,2'-диола, основания «Трёгера», трифтороантранилэтанола, К-(фенилэтил)-фенилацетамида, N-[l-(l-нафтил)этил]фенилацетамидаиЫ-[1-(4-хлорфенил)этил]фенилацетамида.
На защиту выносятся следующие положения:
Методики синтеза хиральных неподвижных фаз на основе аминопропилсиликагеля и низкомолекулярных селекторов (3)-пропил-(>})-(а-фепилэтил)-тиооксамида и N-(3,5-динитробензоил)-фенилаланинола.
Данные по расчету изотерм адсорбции и термодинамических параметров адсорбции оптических изомеров 1,Г-бинафтил-2,2'-диола на хиральных неподвижных фазах.
- Закономерности удерживания ряда кислород- и азотсодержащих органических
соединений, обладающих оптической изомерией, на синтезированных сорбентах в
условиях нормально-фазовой ВЭЖХ.
Зависимости энантиоселективных свойств сорбентов от строения молекул хирального селектора, их плотности пришивки к поверхности матрицы и состава подвижной фазы.
Данные по энантиоразделению ряда ароматических амидов на хиральной неподвижной фазе с селектором на основе М-(3,5-динитробензоил)-фенилаланинола, условия и результаты определения их онантиомерного состава.
Апробация работы. Результаты работы доложены на международных конференциях
и симпозиумах Результаты работы доложены на международных конференциях и
симпозиумах: Euroanalysis, Dortmund, Germany, 8-13 September, 2002, Седьмая
Международная конференция "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана", Санкт-Петербург- Репино, 15-18 сентября 2003 г., Всероссийский симпозиум "Хроматография и хроматографические приборы", Москва, 15-19 марта 2004 г., Всероссийская конференция по аналитической химии "Аналитика России 2004", Москва,
27 сентября — 1 октября 2004 г., Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-2002". Секция "Химия" Москва, 9-12 апреля 2002 г., Всероссийская конференция «Теория и практика хроматографии. Применение в нефтехимии", Самара, 3-8 июня 2005 г., II Международного симпозиума "Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии", Краснодар, 25-30 сентября 2005 г, X международная конференция «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии», Москва, 24-28 апреля 2006 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи и 9 тезисов докладов. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 10 глав экспериментальной части, общих выводов и списка цитируемой литературы. Материал диссертации изложен на 148 страницах машинописного текста, содержит 91 рисунок и 22 таблицы, в списке литературы 120 наименований.
Классификация хиральных неподвижных фаз
Хиральные сорбенты, используемые в жидкостной хроматографии, делятся на две большие группы: хиральные неподвижные фазы на основе природных и синтетических полимеров и неподвижные фазы на основе ковалентно-связанных хиральных лигандов (селекторов). Дальнейшая классификация может быть основана на происхождении молекул селектора (природные или синтетические), содержании тех или иных функциональных групп, проявлении различных типов взаимодействий. Основные классы хиральных селекторов и типы взаимодействий, проявляемых ими, приведены в табл.1. Присутствие групп, способных к проявлению тех или иных взаимодействий, в структуре хирального селектора обязательное условие, которое, однако, не гарантирует возникновения хиральных свойств. Как было отмечено, требуется как минимум трехцентровое взаимодействие, чтобы процесс энантиораспознавания стал возможен. Причем, что особенно важно, это трехцентровое взаимодействие должно «нести информацию» о хиральности молекулы селектора. В простейшем случае это подразумевает расположения функциональных групп вокруг асимметрического атома углерода. Как следует из таблицы, природа взаимодействий, проявляемых молекулами хиральных селекторов, может быть самой разнообразной. Уже одного типа взаимодействий может оказаться достаточным для разделения энантиомеров. Но, в большинстве случаев разделение осуществляется за счет комбинации различных типов взаимодействий. Определяющим фактором в проявлении тех или иных взаимодействий является строение хирального селектора. Далее рассмотрено строение хиральных селекторов (рис. 2) и возможности их применения для разделения оптических изомеров. В основе механизма хирального распознавания пространственной структуры энантиомеров для данных селекторов используется многоточечное образование водородных связей. В своих работах Хара и сотр. [3] предложили ряд селекторов на основе производных валина и винной кислоты. В неводных средах, способствующих проявлению взаимодействий за счет образования водородных связей, образуются диастереомерные пары между молекулой селектора и молекулами оптических изомеров разделяемого вещества. Устойчивость диастереомерных пар (ассоциатов) определяется конформацией молекул, и, для ряда структур (например, N-ациламинокислот) наблюдается различие в их устойчивости, за счет чего и происходит разделение энантиомеров. Соединения с п-донорными или п-акиепторными свойствами Для селекторов такого типа характерен существенный вклад ароматического я-л-связывания в процесс удерживания сорбата.
Если заряд может быть перенесён с молекулы донора на молекулу акцептора, пара образует комплекс, прочность которого в ряде случаев довольно высока. Большинство я-акцепторных сорбатов можно разделить с высокой эффективностью и селективностью на сорбенте, полученном ковалентным связыванием N-производных аминокислот с силикагелевой матрицей. Исходя из представлений теории трёхточечного взаимодействия, Пиркл объяснил успешные результаты разделений на таких сорбентах одновременным действием я-л-взаимодействий и образованием водородных связей в неполярном растворителе, выполняющем роль подвижной фазы. Лигапдообменные Способность металлов образовывать комплексы используется в целях разделения энантиомеров уже давно. Основополагающие работы в этой области выполнены проф. Даванковым, который еще в 1970 г. опубликовал первые исследования о новом методе -хиральной лигандообменной хроматографии. Предложенный им метод предусматривает закрепление L-пролина на хлорметилированном сополимере стирола с дивинилбензолом и использование для разделения тройных комплексов, образующихся в присутствии ионов меди (II) и анионов аминокислот. Поскольку аминокислотные лиганды противоположной оптической конфигурации образуют диастереомерные комплексы, любое различие в стабильности этих комплексов обязательно приводит к различию в хроматографической подвижности энантиомеров аминокислот. После опубликования результатов первых успешных экспериментов данный метод начал интенсивно изучаться, и на сегодня это, пожалуй, самый изученный метод хиральной ЖХ. Макроциклические соединения Циклодекстрины Наличие полости в кольцевой структуре обуславливает разделение за счет образования комплексов включения с соединениями подходящего размера. Диаметр ft \ кольца Р-циклодекстрина 8А , а его объем составляет примерно 350А . Стабильность комплекса в значительной степени зависит от гидрофобности и стерической природы «гостя». Это делает циклодекстрины, и особенно легкодоступный Р-циклодекстрин, весьма удобным для использования в хиральной ЖХ. Хиральность циклодекстринов определяется спиралеобразным расположением гидроксильных групп по верхнему и нижнему краям тороидального кольца молекулы, а энантиоселективность соответствующих неподвижных фаз определяется совокупностью водородных связей и гидрофобных взаимодействий с субстратом.
Поскольку образование комплексов включения с циклодекстринами в водных системах связано в основном с гидрофобными взаимодействиями, то разделение осуществляется главным образом в режиме обращенно-фазовой хроматографии. Но, в ряде работ использовали так называемый «полярно-органический» вариант хроматографии. Подвижная фаза в этом случае содержит до 95% полярного компонента (метанола, ацетонитрила) в смеси с водным буферным раствором. В обоих режимах удерживание и селективность разделения оптических изомеров зависит от ионной силы и величин рН. Краун-эфиры. Макроциклические полиэфиры, известные под названием краун-эфиры, способны к образованию комплексов по типу «гость-хозяин», копируя природный принцип структурного распознавания, который очень распространен в биологических регулируемых системах. После первых успешных синтезов оптически активных краун-эфиров Крам и сотр. [4] приступили к изучению из способности разделять оптические изомеры. Разработанные принципы разделения были применены ими в ЖХ, хиральные краун-эфиры при этом вводились либо в подвижную фазу, или ковалентно связывались с силикагелевой подложкой. Одной из первых и наиболее успешных попыток получения хиральной неподвижной фазы для ВЭЖХ явилась работа по закреплению на поверхности силикагеля макроциклической хиральной молекулы дибинафтил-2,2 -краун-6 (рис. 2). Антибиотики. Концепция использования макроциклических антибиотиков в качестве неподвижных хиральных фаз для жидкостной хроматографии была впервые предложена Армстронгом на Питсбургской конференции в 1994 году. Представленные хиральные селекторы были основаны на амфотерных гликопептидах - ванкомицине, тикопланине и ризоцетине А. Тикопланин имеет в своей структуре 20 хиральных центров, окружающих 4 полости ароматических колец и функциональные группы, обеспечивающие водородные связи и 7Г-7Г взаимодействия. Многообразие возможных взаимодействий позволяет использовать этот селектор для разделения широкого круга органических соединений. Антибиотиковые хиральные неподвижные фазы обладают энантиоселективными свойствами в обращенно-фазовом, нормально-фазовом и полярно-органическом режимах жидкостной хроматографии. Выбор подвижной фазы обусловлен природой разделяемого рацемата и его потенциальной энергией взаимодействия с поверхностью неподвижной фазы. В обращенно-фазовом варианте жидкостной хроматографии идет предпочтительно электростатические взаимодействия, и образование комплексов включения между сорбатом и хиральной поверхностью, а изменением рН подвижной фазы можно регулировать ионное состояние сорбата. Энантиоразделение электронейтральных соединений, нерастворимых в полярных растворителях, возможно только в нормально-фазовом режиме, в котором характерно образование я-я комплексов и взаимодействия за счет образования водородных связей [5]. 2.2.2. Полимерные хиральные селекторы Белковые селекторы.
Модель энантиораспознавания для хиральных селекторов, работающих по принципу образования комплексов с переносом заряда
Полученный Пирклом хиральный селектор (как и многие селекторы с одним хиральным центром, синтезированные позже) содержит четко выраженные фрагменты для трехточечного взаимодействия, необходимого для энантиораспознавания оптических изомеров. Исходя из представлений теории Далглиша, автор объяснил столь успешное разделение существенным вкладом ароматического л-я связывания в процесс удерживания сорбата [45]. Взаимодействия такого типа хорошо изучены, они происходят между так называемыми л-донорными и л-акцепторными молекулами, я-доноры имеют тенденцию к отдаче электрона, поскольку образующийся положительный заряд хорошо распределяется по л-системе. Напротив, л-акцептор стабилизируется вследствие принятия отрицательного заряда и поэтому стремится принять дополнительный электрон в свою я-систему. Таким образом, если заряд может быть перенесен с молекулы донора на молекулу акцептора, пара л-донор / л-акцептор образует комплекс, прочность которого в ряде случаев довольно высока. На Рис.25 представлена схема разделения спирта «Пиркла» на хиральном селекторе, являющимся производным №(3,5-динитробензоил)-аминоки слоты. При образовании диастереомерных ассоциатов между молекулами селектора и сорбата, ароматические кольца л-донорной и л-акцепторной систем располагаются параллельно друг к другу. Дополнительные взаимодействия проявляются за счет водородных связей, которые обеспечиваются за счет присутствия в молекулах и сорбата, и селектора полярных групп (сложноэфирных, амидных и пр.). Так, в представленной модели л-акцепторное динитрофенильное кольцо располагается параллельно одному из сопряженных колец антранильной группы «спирта Пиркла». Дополнительные взаимодействия по механизму образования водородных связей возникают между гидрокси-группой «спирта Пиркла» и кислородом карбонильного фрагмента амидной группы (ближней к динитробензойному фрагменту) молекулы хирального селектора, а также за счет присутствия второй амидной группы в составе молекулы хирального селектора, карбонильный фрагмент которой проявляет сродство к атому водорода, находящемуся при хиралыюм атоме углерода. Успех фаз типа Whelk-0 1 обусловлен наличием «полости», содержащей три функциональные группы, необходимые для хирального распознавания энантиомеров.
Эта полость содержит 71-основный ароматический заместитель, который служит «полом» и я-кислотную 3,5-динитробензаамидную группу, называемую «стенкой». Предполагается, что тс-донорная группа анализируемого образца входит в «полость» ХНФ и подвергается одновременным взаимодействиям с я-донором и я-акцептором. Так как я-акцепторная группа селектора и молекула сорбата, содержащего я-донорную группу, располагаются параллельно друг другу (Рис.26.), то такое взаимодействие назвали «лицо к лицу». При этом я-донорная группа в молекуле селектора оказывается расположенной перпендикулярно к молекуле разделяемого вещества, поэтому такое взаимодействие назвали «лицо к краю». Амидная группа служит центром образования водородной связи. Та молекула энантиомера, которая подвергается одновременно всем этим взаимодействиям без существенного отклонения от своей копформации, будет удерживаться дольше. Взаимодействие «лицо к краю» является по природе электростатическим и включает притяжение протона(ов) одной ароматической группы к электронно-обогащенному центру другой [46]. Значимость этого вида связи в межмолекулярных взаимодействиях подтверждается строением кристаллов простейших ароматических соединений, в которых взаимодействие «лицо к краю» определяет мотив ячейки [47], а также активным участием этого взаимодействия в формировании третичной структуры молекул белка [48]. Таким образом, присутствие одного ароматического фрагмента в составе молекулы сорбата оказывается достаточным для образования двух центров взаимодействия на структурах типа "Whelk-0 1", третье взаимодействие по механизму образования водородных связей с амидной группой молекулы хирального селектора возможно для многих классов органических соединений, таких, например, как спирты, сложные эфиры, амиды и пр. Все это обеспечивает высокую селективность хиральных разделений, и достаточно широкую применимость данного низкомолекулярного селектора. Представленные модели энантиораспознавания подтверждаются многочисленными хроматографическими [49] и ПМР-спектроскопическими исследованиями [50], и в ряде случаев позволяют определять по порядку выхода энантиомеров абсолютную конфигурацию оптических изомеров, тем самым, подтверждая правильность подхода в рассмотрении механизма энантиораспознавания на молекулярном уровне. 2.7. Прочие хиральные неподвижные фазы на основе низкомолекулярных хиральных селекторов Успех ХНФ, синтезированных Пирклом и сотр., положил начало синтезу еще целого ряда фаз на основе низкомолекулярных хиральных селекторов. Некоторые из них, как и фазы, синтезированные Пирклом, основаны на производных аминокислот, содержащих я-донорную или я-акцепторную группу; некоторые реализуют другие типы взаимодействий (без образования комплексов с переносом заряда) для осуществления процесса энантиораспознавания. Введение дополнительных функциональных групп, либо стерически объемных групп в состав молекулы селектора изменяет энантиоселективные свойства ХНФ. Используя мощный арсенал методов органической химии в направленном синтезе, можно получить достаточно широкое разнообразие типов хиральных селекторов. А, учитывая накопленный опыт в области хроматографического разделения энантиомеров и наличие разработанных моделей энантиораспознавания, проводить поиск новых структур на вполне рациональной основе.
Хиралыше неподвижные фазы на основе п-гидроксифенилглицина Увеличивая вклад полярных групп в процесс энантиораспознавания, тс-донорную ХНФ получили привитием пропиланилида К-бутаноил-(11)-и-гидроксифенилглищша через фенольный атом кислорода к силикагелевой матрице [51]. В отличие от классических фаз Пиркла (на основе производных аминокислот (Рис.8, Рис.10)), в этом селекторе изменен порядок следования ароматической функциональности и полярных групп (амидных) в молекуле селектора. Считая от поверхности силикагеля, первым после пропильной ножки идет фенольный фрагмент (л-донорный), а уже за ним - две амидные группы н-пропиланилидного и N-бутаноилпроизводного фрагментов полностью замещенного глицина (Рис.27) Полученная ХНФ показала высокие энантиоселективные свойства по отношению к ДНБ-производным анилидов аминокислот. Для всех производных аминокислот R-изомер элюировался первым. По составу полярных групп, более сильное удерживание наблюдали для вторичных амидов и сложных эфиров, по сравнению с третичными амидами и карбоксильными группами соответственно. При замене в составе молекулы селектора N-бутаноильного фрагмента на N-трифторацетил, либо при замене пропиланилидного фрагмента на третичный амид, энантиоселективные свойства новых ХНФ ухудшаются. Подобное поведение позволило предположить следующую модель энантиораспознавания: ДНБ ароматический фрагмент молекулы сорбата располагается параллельно я-донорному фенольному кольцу молекулы селектора, в то время как между амидными группами идет образование водородных связей. Стерическая доступность амидных групп селектора (лучшая, по сравнению с фазами Пиркла) приводит к весьма высоким значениям коэффициентов селективности в случае производного лейцина а=26,59. В качестве подвижной фазы использовали смесь гексана с изопропанолом. Хиральные неподвижные фазы на основе N-фенилпроизводного ДНБ-лейцина Один из вариантов ХНФ Пиркла на основе ЦЗ,5-динитробензоил)-лейцина получили заменой водорода амидной группы на фенильное кольцо (Рис.28). В молекуле селектора помимо я-акцепторной динитробензойной группы, появляется ароматическая группа, способная к проявлению я-донорных взаимодействий. Такая ХНФ проявила намного лучшую энантиоселективность по отношению как к -акцепторным рацематам 3,5-динитробензоилпроизводных аминокислот, так и к я-донорным 1М-(диметоксибензоил) алкиланилидам аминокислот [52].
Изучение параметров матриц полученных ХНФ
Высокая эффективность используемых колонок крайне важна для успешного разделения оптических изомеров, чтобы компенсировать невысокие значения коэффициентов селективности (в хиральной хроматографии селективность выше 1,1 считается весьма хорошей). Одинаковый состав функциональных групп энантиомеров не позволяет улучшать селективность разделения за счет использования градиента концентрации полярной добавки в подвижной фазе. Все разделения оптических изомеров проводятся при изократическом режиме элюирования. Кроме того, присутствие нескольких (как минимум трех) функциональных групп, различающихся между собой по силе и/или природе проявляемых взаимодействий, необходимо в соответствии с моделью энантиораспознавания Далглиша. Содержание таких групп в молекуле хирального селектора приводит к неоднородному составу адсорбционных центров. Тем самым эффективность ХНФ при разделении оптических изомеров изначально «ухудшена» по сравнению с однородными по составу полярных групп сорбентами. В таких условиях ключевую роль в получении высокоэффективных колонок играет матрица сорбента. Основные требования, предъявляемые к матрице, на которой будет закреплён селектор, - хорошее сродство к разделяемым на ней молекулам и к элюентам, необходимая геометрическая структура, термическая и химическая инертность. В нашей работе в качестве инертной матрицы использовали сферические силикагели Silasorb SPH Amin 5цт и Kromasil 100-5-sil б um. Ввиду сильного влияния матрицы сорбента на эффективность получаемых хроматографических колонок, было проведено исследование силикагелей на соответствие паспортным данным и испытание их химической стабильности и механической прочности. Распределение частиц сорбента по размеру (фракционная однородность) оценивали визуально по данным электронной сканирующей спектроскопии. Для получения микрофотографий порошкообразные образцы помещали на поверхность кюветы при помощи эпоксидной смолы, играющей роль плоской основы и клейкой поверхности. Съемка проводилась на сканирующем электронном микроскопе CamScan-4DV в лаборатории локальных методов исследований кафедры петрологии географического факультета МГУ. Полученные микрофотографии приведены на Рис. 53 Как видно из приведенных рисунков, сорбент Silasorb SPH Amin содержит как большое количество мелких частиц, так и относительно крупные частицы. То есть фракционный состав сильно неоднороден, и ожидать высокой эффективности от сорбента не приходится. Силикагель Kromasil ЮО-5-sil имеет гораздо лучшее однородное распределение частиц по размерам и, что особенно важно, не содержит мелких частиц (менее 2 мкм). Хроматографические колонки, заполненные сорбентом с мелкими, пылевыми частицами, требуют приложения высоких давлений при прокачке через них элюента и обладают низкой эффективностью. Синтез ХНФ на основе селектора А проводили с использованием аминопропилсиликагеля Silasorb SPH Amin.
Поэтому перед заполнением хроматографической колонки провели фракционирование ХНФ 1 для получения более однородного по размеру частиц материала. Разделение частиц по размеру осуществляли с помощью седиментации сорбента в вязких жидкостях: смеси воды с пропанолом-2. Многократное повторение процесса седиментации (более 20 циклов) позволило достичь требуемого фракционного состава. Контроль осуществляли с помощью визуального наблюдения частиц сорбента под микроскопом. Фотографии исходного и конечного сорбента, полученные на сканирующем электронном микроскопе приведены на Рис. 54. Как видно, седиментация позволила «убрать» мелкие пылевые и особо крупные частицы. Сорбент стал более однородным по составу и уже, на наш взгляд, соответствовал предъявляемым к сорбентам для ВЭЖХ требованиям. К сожалению, количество ХНФ 2 было слишком малым, и колонку заполнили без каких-либо стадий седиментации. ХНФ 3 и 4 получали на основе силикагелевой матрицы Kromasil ЮО-5-sil. Как видно из Рис. 53 фракционный состав сорбента однороден, что позволило заполнять колонки без предварительной стадии седиментации. Положительным моментом является не только более экспрессная (каждая стадия седиментации занимает порядка 3 часов) схема получения высокоэффективных колонок для хиральной жидкостной хроматографии, но и отсутствие потерь сорбента в процессе фракционирования. При этом значительно сокращается расход исходных материалов: силикагелевой матрицы и хиральных селекторов. Если при синтезе ХНФ 1 для заполнения хроматографической колонки размером 250 4,6 мм исходили из навески аминопропилсиликагеля 6 г, то для синтеза ХНФ 4 для того же размера колонки потребовалось лишь 3,0 г силикагеля. Увеличение снимков ХНФ 1 и ХНФ 4, полученных методом электронной микроскопии, привело к достаточно неожиданному результату. На частицах ХНФ 1, синтезируемой с использованием в качестве матрицы аминопропилсиликагеля Silasorb SPH Amin, наблюдаются сколы (Рис. 55). Практически нет ни одной целой сферической частицы.
Фракционирование ХНФ 1 позволило убрать мельчайшие отколотые частицы, из-за чего они не попали в кадр. Частицы ХНФ 4 сохранили свою целостность и ничем визуально не отличаются от исходных частиц силикагеля Kromasil 1 OO-5-sil. Для всех полученных ХНФ в ходе синтеза использовали интенсивное перемешивание, необходимое для получения однородного по химическому составу сорбента. Концентрация частиц сорбента составляла от 3 до 20% по массе в реакционной смеси. При перемешивании происходят соударения частиц. Одним из требований, предъявляемым к матрице сорбента является механическая прочность. Таким образом, данные электронной сканирующей спектроскопии позволяют не только оценивать и контролировать фракционный состав, но и следить за механической прочностью частиц изучаемых сорбентов. К важнейшим характеристикам сорбентов относятся величина удельной поверхности, диаметр и объем внутренних пор. В нашей работе эти характеристики получали независимо от данных производителя методом БЭТ. Данные по удельной площади и размеру пор приведены в табл. 5. Из приведенных зависимостей следует, что распределение пор по размерам более однородно для сорбента Kromasil 100-5-sil. Скорость диффузии молекул зависит от диаметра пор, в которых они находятся. В условиях синтеза сорбентов используются значительные избытки реагентов и достаточно продолжительные времена синтеза для получения однородного по плотности пришивки органического слоя хиральных молекул. В ходе же хроматографического разделения разница в размерах пор приводит к дополнительному размыванию пиков, что ухудшает эффективность разделения. Несмотря на более широкое распределение пор по размерам, наблюдаемое для сорбента Silasorb SPH Amin, левые части кривых распределения (для размеров меньше 80 А0) достаточно близки, что показывает отсутствие узких пор, наиболее сильно влияющих на размывание хроматографических пиков. Подробное изучение характеристик сорбента позволяет объективно выбрать наилучшую матрицу и сформировать требования, предъявляемые к используемой матрице сорбента на основе численных данных. Такой контроль исходного материала не менее важен, чем контроль чистоты молекул селектора. 3.4. Изучение хроматографических свойств силикагеля, модифицированного хитозаном и его производными На поверхности сорбентов полученных на основе силикагелевой матрицы присутствуют полярные силанольные группы, а в случае аминопропилсиликагелевой матрицы также и аминогруппы. Вклад этих групп в удерживание сорбатов, обладающих оптической изомерией, носит неэнантиоселективный характер. Мешающее влияние матрицы устраняют, как правило, проводя реакции «эндкепирования» (получением алкоксипроизводных силанольных групп).
Изучение энантиоселективных свойств сорбентов, модифицированных N-(0)-пропил-1Ч-(8)-(1-фенилэтил)-тиооксамидом
Разделение оптических изомеров для других рассматриваемых веществ в этих условиях не наблюдалось. В случае 8 по удерживанию оптически чистых изомеров был определен порядок выхода изомеров, (-)-изомер 8 элюируется первым для обеих ХНФ. К сожалению, из-за отсутствия индивидуальных энантиомеров 5, порядок выхода изомеров этого соединения не был установлен. В одинаковых условиях хроматографирования (состав и скорость подвижной фазы) наблюдалось значительно большее удерживание 8 по сравнению с 5 даже при больших концентрациях полярной добавки пропанола-2. Удерживание полярных молекул сорбата на синтезированных ХНФ определяется присутствием в молекулах хирального селектора полярных групп. Тиооксамидная группа, как и амидная, способна проявлять взаимодействия по нескольким механизмам. Среди них диполь-дипольные взаимодействия, образование водородных связей как по кислотному, так и по основному механизму. По-видимому, молекулы селектора склонны к акцептированию протонов в большей мере, чем к их донированию. Соединение 8 содержит гидрокси-группы и обладает довольно сильными кислотными свойствами (рКа=8,3). Основание Трёгера напротив, обладает основными свойствами (рКа сопряженной кислоты 3,0). Роль донорно-акцепторных водородных связей в удерживании на ХНФ 1 и 2 подтверждается эффектом присутствия свободных аминогрупп на поверхности силикагеля. При уменьшении плотности пришивки молекул хирального селектора, и, следовательно, -увеличении свободных основных аминогрупп в ХНФ 2, удерживание 8 возрастает, а 5 -уменьшается. Соединение 8 не элюируется подвижной фазой с полярной добавкой этилацетата. Следовательно, оценить энантиоселективные свойства неподвижной фазы представляется невозможным. При разделении энантиомеров соединения 5 значительно увеличивается коэффициент селективности а. Эффективность разделения уменьшается в три раза, но, тем не менее, наблюдаемое увеличение селективности приводит к улучшению разрешения пиков. Соединение 5 содержит третичные аминогруппы. Присутствие основных аминогрупп как в молекуле сорбата, так и на поверхности сорбента уменьшает силу взаимодействия сорбат-сорбент, что приводит к достаточно слабому удерживанию, не достаточному для проявления энантиоселективных свойств системы при использовании подвижной фазы А. Изменение природы полярной добавки при переходе к фазе Г вызвало существенное изменение свойств хроматографической системы. Высокое сродство карбонильного фрагмента сложноэфирной группы по отношению к аминам приводит к конкуренции между молекулами сорбата и этилацетата при взаимодействии со свободными (непрореагировавшими) остаточными аминогруппами, находящимися на поверхности силикагеля.
Неселективный вклад полярных аминопропильных групп в процесс энантиораспознавания уменьшается, что находит отражение в увеличении коэффициента селективности разделения двух оптических изомеров соединения 5. Использование подвижных фаз, содержащих и пропанол-2 и этилацетат (фаза Б), позволило оценить влияние этилацетата на энантиоселективные свойства системы по отношению к соединению 8. Коэффициенты селективности разделения энантиомеров этого соединения незначительно увеличиваются при заметном уменьшении времен выхода. При этом наблюдается многократное увеличение эффективности разделения, что позволяет получить разделение пиков с коэффициентами разрешения 0,26 (Рис. 70). Добавка этилацетата в подвижной фазе является «вспомогательным» компонентом, уменьшающем размывание хроматографических пиков. Частичное экранирование аминогрупп за счет молекул этилацетата приводит как к снижению времен удерживания 8, так и обуславливает, хоть и слабое, но статистически-значимое улучшение коэффициента селективности разделения пары оптических изомеров. Энантиоселективиость разделения оптических изомеров соединения 5 при использовании подвижной фазы Б оказывается аналогичной для фазы, содержащей только пропанола-2 (5%) в качестве полярной добавки. Фактор удерживания значительно возрастает благодаря присутствию этилацетата в составе подвижной фазы. Таким образом, показано, что присутствие непрореагировавших первичных аминогрупп на поверхности силикагеля значительно ухудшает энантиоселективные свойства сорбентов. Для достижения более полного «экранирования» этих поверхностных групп в состав подвижной фазы была введена добавка ТФУК. Обладая ярко выраженными кислотными свойствами, ТФУК проявляет высокое сродство к компонентам, содержащим основные группы. Наиболее сильным основанием в составе сорбента являются первичные аминогруппы. Поэтому при установлении равновесия в системе сорбат-элюент, аминогруппы будут в значительной мере «дезактивированы» с образованием ассоциатов с молекулами ТФУК. Устранение неселективных взаимодействий между полярными группами сорбата и аминогруппами сорбента при использовании подвижной фазы В привело к значительному улучшению селективности хирального разделения рацематов 5 и 8 (Рис. 71). Все описанные закономерности были получены для колонки, заполненной ХНФ 1. На колонке с ХНФ 2 наблюдалось единственное разделение энантиомеров при составе подвижной фазы гексан - пропанол-2 (10%).
В остальных случаях низкая эффективность колонки не позволила оценить различие энантиоселективных свойств в зависимости от состава подвижной фазы. Конечно, не стоит забывать, что сорбенты различаются между собой по составу поверхностных групп и «истории синтеза». Заполнение хроматографических колонок -сложный процесс, в котором природа и количество поверхностных групп оказывает значительное влияние. При строгом подходе к стадии заполнения колонок для каждого нового сорбента требуется отдельное изучение влияния условий заполнения и выработка, в результате, уникальной методики, гарантирующей наилучший результат. В нашем случае колонки заполнялись в одинаковых условиях из смеси вода - пропанол-2 в соотношении 1 : 1. В обоих случаях использовали одну и ту же систему для заполнения, состоящую из насоса высоких давлений «Knauer» К 1900, и специально сконструированный предколоночный резервуар. Требование высокой эффективности полученных хроматографических колонок для хирального разделения более строгое, чем для разделения соединений, различающихся по составу групп (соединений-гомологов, и пр.). В хиральной хроматографии изучение влияния природы и концентрации полярной добавки на энантиоселективные свойства сильно затруднено из-за относительно малого вклада в удерживание «полезных» хиральных взаимодействий. Так, в наших исследованиях показано, что рассмотренных восьми подвижных фаз достаточно для получения полного разделения любого тестового соединения с остальными. В то же время, изменение природы полярной добавки не привело к полному разделению пиков оптических изомеров. Поэтому, для улучшения разрешения пиков провели дополнительное изучение влияния условий хроматографического эксперимента на эффективность и селективность разделения энантиомеров 5 и 8. Несколько неожиданным оказалось влияние структуры используемого в качестве полярной добавки спирта на эффективность разделения. Так, при переходе от пропанола-2 к 2-метилпропанолу-2 эффективность разделения оптических изомеров 8 увеличилась при незначительном увеличении энантиоселективности.