Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Аналитические возможности современных методов определения экранированных фенолов 11
1.1. Основные свойства пространственно-затрудненных фенолов 11
1.2. Современное состояние физико-химических методов аналитического контроля экранированных фенолов 18
Экспериментальная часть
Глава 2. Объект исследования, методы и аппаратура проведения эксперимента 24
2.1. Характеристика объекта исследования и вспомогательных веществ 24
2.2. Методы и приборы 31
Глава 3. Идентификация медиборола в лекарственных формах методом тонкослойной хроматографии 35
3.1. Исследование реакции окисления медиборола со щелочным раствором калия гексацианоферрата (III) 35
3.2. Определение специфичности проявителя - щелочного раствора калия гексацианоферрата (III) 43
3.3. Оценка предела обнаружения медиборола щелочным раствором калия гексацианоферрата (III) 45
3.4. Методика качественного анализа медиборола в лекарственных формах методом тонкослойной хроматографии 47
Глава 4. Разработка методик количественного определения медиборола в лекарственных формах 50
4.1. Спектрофотометрическое определение медиборола в масляных растворах 50
4.2. Валидация методики определения содержания медиборола методом УФ-спектрофотометрии 59
4.3. Разработка и валидация методики количественного определения медиборола в масляном растворе методом ВЭЖХ 66
4.4. Разработка и валидация методики количественного определения медиборола в ректальной лекарственной форме 76
Выводы 83
Благодарности 85
Приложение 86
Приложение 1. Обоснование технологии таблеток медиборола 87
1.1. Технологические свойства субстанции медиборола 87
1.2. Разработка технологии таблеток медиборола 92 Приложение 2. Выбор оптимального состава и оценка качества ректальной формы медиборола 97
2.1. Разработка состава и технологии суппозиториев с медиборолом 97
2.2. Оценка качества суппозиториев с медиборолом 102
Приложение 3. Проект ФСП «Раствор медиборола в масле 2 % для инъекций» 106 Приложение 4. Проект ФСП «Свечи с медиборолом 0,05 г» 116
Список литературы 123
- Современное состояние физико-химических методов аналитического контроля экранированных фенолов
- Исследование реакции окисления медиборола со щелочным раствором калия гексацианоферрата (III)
- Методика качественного анализа медиборола в лекарственных формах методом тонкослойной хроматографии
- Разработка и валидация методики количественного определения медиборола в ректальной лекарственной форме
Введение к работе
Актуальность темы. Проблема лечения и профилактики нарушений мозгового кровообращения имеет не только медицинское, но и важнейшее социальное значение во всем мире. В России заболеваемость инсультом неуклонно растет, а смертность от него устойчиво занимает второе место в структуре общей смертности населения, уступая только коронарной патологии и опережая опухоли всех локализаций.
Значительный рост частоты ишемического инсульта, приводящий к потере трудоспособности и частым летальным исходам, обусловливает актуальность создания и применения новых лекарственных препаратов для его лечения. В современном лечении нарушений мозгового кровообращения важное место занимают нейропротекторные средства, обеспечивающие метаболическую защиту головного мозга. Одним из основных направлений нейропротекторной терапии является применение антиокси-дантов для уменьшения интенсивности свободно-радикального и пере-кисного окисления липидов. Таким свойством обладают соединения группы пространственно-затрудненных фенолов, в частности 2,6-диизоборнил-4-метилфенол, или медиборол. Данное соединение проявляет антирадикальную, антитромбогенную, гемореологическую, нейропро-текторную, умеренную антигипоксическую активность в сочетании с низкой токсичностью.
Необходимым этапом на пути проведения клинических испытаний и дальнейшего внедрения в медицину медиборола является разработка методик анализа медиборола в лекарственных формах, обеспечивающих их качество, эффективность и безопасность. Кроме того, целесообразно оценить пригодность разрабатываемых аналитических методик для их применения. Одним из этапов исследования была разработка лекарственных форм медиборола, результаты которых приведены в Приложениях.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключается в изучении поведения медиборола при спектрофотометрии и жидкостной хроматографии и в разработке на их основе методик его определения в лекарственных препаратах.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1. Исследовать реакцию окисления медиборола с целью ее примене
ния для идентификации медиборола в лекарственных препаратах.
-
Изучить спектральные характеристики медиборола в растворах растительных масел с использованием метода УФ-спектроскопии и разработать спектрофотометрическую методику определения содержания медиборола в масляных растворах.
-
Осуществить выбор условий и разработка методики хроматогра-фического определения медиборола в растворах в масле для инъекций в
варианте обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) со спектрофотометрическим детектированием.
4. Разработать методику количественного определения медиборола в
суппозиториях.
5. Оценить метрологические характеристики методик количествен
ного определения медиборола в лекарственных формах.
Поставленные задачи решались путем обобщения и критического рассмотрения имеющейся литературы и результатов собственных экспериментальных исследований.
Научная новизна. Впервые исследована реакция окисления медибо-рола со щелочным раствором гексацианоферрата (III) калия. С помощью физико-химических методов установлена структура конечного продукта реакции. Предложен способ идентификации медиборола в лекарственных препаратах на основе данной реакции с использованием метода тонкослойной хроматографии (ТСХ). Изучены спектральные характеристики медиборола в растворах оливкового и персикового масел с использованием метода УФ-спектроскопии. Установлены три аналитические длины волны для определения концентрации медиборола в каждом растворе на основе метода Фирордта. Подобраны рабочие хроматографические условия, позволяющие разделять медиборол и компоненты масел. Разработаны методики количественного определения медиборола в различных лекарственных формах с использованием методов УФ-спектрофотометрии и ВЭЖХ. Данные методики позволяют получать результаты с малой погрешностью.
Практическая значимость. Предложены доступные и простые методики определения нового биологически активного соединения – меди-борола в лекарственных формах (раствор в масле для инъекций и суппозитории) для лечения инсульта. Данные методики не требуют дорогостоящих реактивов и позволяют получать результаты с требуемой точностью, что очень важно для практического массового применения в медицине. На основе проведенных исследований разработаны проекты фармакопейных статей предприятия (ФСП) на раствор медиборола в масле для инъекций и суппозиториев с медиборолом.
Связь задач исследования с планами научных работ. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармацевтической химии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России и комплексной целевой программой СО АМН Российской Федерации «Здоровье человека в Сибири» (номер государственной регистрации 01200602064).
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Результаты исследования реакции окисления медиборола со щелочным раствором гексацианоферрата (III) калия и методика качествен-4
ного определения медиборола в лекарственных формах на основе данной реакции.
2. Результаты изучения УФ-спектров поглощения медиборола в
оливковом и персиковом маслах и методика количественного определе
ния медиборола в растворах растительных масел на основе метода Фи-
рордта.
-
Выбор рабочих условий и методика хроматографического определения медиборола в масляном растворе для инъекций с использованием изократического и градиентного элюирования.
-
Методика количественного определения медиборола в ректальной лекарственной форме.
-
Результаты валидации методик количественного определения ме-диборола в лекарственных формах.
Апробация и публикация результатов исследований. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на 67-й региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2012); на VI Всероссийской конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием «Менделеев-2012» (Санкт-Петербург, 2012); на II Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2012); на 68-й научной конференции по фармации, фармакологии и подготовке провизоров «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2013); на научных семинарах кафедры фармацевтической химии СибГМУ (Томск, 2011–2013).
По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 7 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Экспериментальные исследования по теме диссертации выполнялись на кафедрах фармацевтической химии и фармацевтической технологии с курсом биотехнологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России (г. Томск), а также в сотрудничестве с коллективами других научных организаций: ООО «Сибтест» Национального исследовательского Томского политехнического университета (г. Томск) и Пятигорского медико-фармацевтического института — филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России (г. Пятигорск).
Личный вклад автора. Основные экспериментальные результаты, приведенные в диссертации, получены самим автором или при его непосредственном участии. Автором выполнены исследования по установлению строения продукта реакции медиборола со щелочным раствором гек-сацианоферрата (III) калия, данная реакция предложена для идентификации медиборола в лекарственных формах, разработаны методики количественного определения медиборола в растворе для инъекций и в
суппозиториях методами ВЭЖХ и УФ-спектрофотометрии, составлены проекты ФСП на лекарственные формы медиборола. Автор проводил обработку, обобщение всех полученных результатов и формулировал основные выводы.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, трех глав экспериментальных исследований, выводов, приложений и списка цитируемой литературы. Материал изложен на 141 странице, включает 20 таблиц и 28 рисунков. Библиографический указатель – 169 наименований, из которых 68 зарубежных.
Современное состояние физико-химических методов аналитического контроля экранированных фенолов
Для анализа ПЗФ используют различные физико-химические методы вследствие их особенностей строения и химического поведения. Данные методы рассмотрены ниже: 1. Хроматография. Наиболее простым и доступным методом разделения и идентификации ПЗФ и их функциональных производных является адсорбционная хроматография, которую проводят либо на колонках, либо в тонком слое адсорбента. Система растворителей для тонкослойной хроматографии (ТСХ) подбирается индивидуально в зависимости от анализируемого фенола. Наиболее распространены следующие смеси: бензол – метанол, бензол - гексан, октан – диэтиловый эфир, диэтиловый эфир диэтиленгликоля – петролейный эфир. В качестве реактивов для проявления пятен для ТСХ используют растворы фосфорномолибденовой кислоты, хлорида сурьмы (V), калия перманганата, пары йода, аммиака, ванилинсерный реактив с последующим нагреванием или без него. Следует отметить, что на величину Rf влияют не только строение заместителей, но и их положение в феноле. Так, наименьшую величину Rf имеет незамещенный фенол. Наличие заместителя в мета- и пара-положениях приводит лишь к небольшому снижению адсорбции фенола и, следовательно, к незначительному увеличению Rf. Наличие же заместителя в орто-положении к гидроксилу резко снижает адсорбцию фенола [27, 92, 93]. Более чувствительным к изменениям структуры ПЗФ является метод газо-жидкостной хроматографии, который позволяет разделять структурно близкие соединения и гомологи. Хотя ПЗФ относятся к практически не летучим соединениям, но низкое удерживание их на неподвижной фазе делает возможным непосредственный анализ. В противном случае, для получения летучих производных ПЗФ, используют метод дериватизации или триметилсилилирования [27, 130]. Наиболее часто для определения фенолов используют высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ). Это объясняется следующими достоинствами метода: высокой селективностью сорбентов, чувствительностью и селективностью диодно-матричного, ультрафиолетового, флуоресцентного, масс-спектрометрического детекторов и мягкими температурными условиями анализа, при которых анализируемые вещества не разлагаются [38, 55]. Например, для анализа ионола в маслах (трансформаторном и растительных), перцовом пластыре и растворе ретинола пальмитата используют метод ВЭЖХ на обращенно-фазовых колонках с бинарными системами растворителей и УФ-детектором [56, 57, 75, 76].
. УФ-спектроскопия. Большая часть ПЗФ имеет две полосы поглощения в УФ-области спектра: 210-220 нм (В-полоса с большим коэффициентом экстинкции) и 260-280 нм (С-полоса с малым коэффициентом экстинкции). Величина алкильного радикала и растворитель мало сказываются на параметрах УФ-спектра. Наиболее резко форма и положение максимумов поглощения изменяются при увеличении рН среды. Так, при подщелачивании спиртовых растворов фенолов происходит смещение обеих полос в длинноволновую область спектра и одновременное увеличение коэффициента экстинкции. Предполагается, что это связано с возрастанием доли хиноидной структуры в основном состоянии ионизированной формы фенола. Кроме того, на параметры УФ-спектра влияют заместители в пара-положении ПЗФ: наличие в этом положении электроноакцепторных заместителей вызывает смещение В- и С-полос в длинноволновую область, причем сдвиг возрастает с увеличением электроотрицательности пара-заместителя [27, 63, 64, 108, 111].
. ИК-спектроскопия. Исследование ИК-спектров ПЗФ и различных продуктов их превращений дает ценную информацию о строении этих продуктов. Для спектральной области 3000-3100 см-1, характерной для валентных колебаний ароматических СН-связей у алкилфенолов, существенное значение имеет локализация частот, распределение интенсивностей между полосами, если их число больше одной, или же соотношение интенсивностей полосы СН ароматического кольца и СН алкильного радикала. Ценную информацию о молекулярной структуре алкилфенолов предоставляет область частот 1450-1600 см-1, соответствующая колебаниям ароматического кольца Sар. Разделение полос и соотношение интенсивностей отдельных компонентов в этой области зависит от разветвления и объема орто-радикала: с увеличением объема орто-радикала уменьшается интенсивность полосы 1600 см-1. Характерным признаком ПЗФ является отсутствие в ИК-спектре интенсивной полосы ароматического кольца в области 1500-1510 см-1.
Идентификация алкильных радикалов линейного строения основана на наблюдаемом соотношении интенсивностей полос 2867 см-1 (s СН2), 2872 см-1 (s СН3), 2930 см-1 (as СН2) и 2960 см-1 (as СН3): D2930 D2867 D2960 D2872 [27, 64, 109, 110, 128, 157].
Область частот 3350-3650 см-1 в ИК-спектре алкилфенолов соответствует валентным колебаниям ОН-групп. Данная спектральная область представляет большой интерес для структурного анализа фенолов. Так как для ПЗФ характерно наличие «орто-эффекта», состоящего в том, что при локализации в ди-орто-положениях к гидроксилу больших заместителей создаются стерические препятствия для образования межмолекулярной водородной связи (МВС). Таким образом, при «орто-эффекте» широкая полоса ассоциированных ОН-групп в области частот ниже 3600 см-1 отсутствует. Заместители в мета- и пара-положениях не влияют на образование МВС [64, 110]. Внутримолекулярные водородные связи (ВВС) в молекулах экранированных фенолов образуются при условии, что в орто-положении находятся заместители с электроотрицательными атомами, такими, как Br или О. Образование в молекуле ВВС проявляется в ИК-спектрах наличием полосы поглощения в области ниже 3600см-1, обусловленной колебаниями связанных гидроксильных групп [34]. Кроме того, в ИК-спектрах экранированных фенолов и их функциональных производных можно выделить ряд частот, характерных для колебаний отдельных связей и групп атомов [27]. 4. Спектроскопия ЭПР. Данный метод можно применять для установления строения ПЗФ, поскольку они способны образовывать соответствующие радикалы [27]. Кроме того, спектры ЭПР являются источником информации об электронном строении, конформации, внутримолекулярных движениях феноксильных радикалов, а также играют решающую роль при изучении механизма и кинетики их химического превращения [74].
. ЯМР-спектроскопия является основным структурным методом современной химии и в настоящее время повсеместно используется для определения строения, исследования реакционной способности и механизмов реакций органических молекул [10]. Одним из важнейшим параметров спектров ЯМР алкилфенолов является ОН. Для стерически экранированных алкилфенолов наблюдается отсутствие концентрационной зависимости ОН. Эта закономерность в спектрах ЯМР составляет аналитическую основу однозначной идентификации экранированных 2,6-ди- и 2,4,6-триалкилфенольных структур. Кроме того, значение ОН ПЗФ свидетельствует о существенном влиянии заместителей на электронное облако связи О-Н. Например, значения ОН для 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенола и 2,6-ди-трет-бутилфенола составляют 4,81 и 5,02 м.д., соответственно, что объясняется влиянием индуктивного эффекта пара-метильной группы, приводящей к увеличению электронной плотности у протона гидроксила и смещению сигнала ОН 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенола в сторону более сильного поля [27, 63, 126, 159, 164, 169].
Исследование реакции окисления медиборола со щелочным раствором калия гексацианоферрата (III)
Согласно исследованиям [49, 65], обнаружение медиборола классическими химическими реакциями (образование азокрасителя и с раствором железа (III) хлорида) не представляется возможным вследствие термодинамических причин. Но по рассмотренным выше литературным данным [115, 117, 118], замещенные фенолы реагируют со щелочным раствором калия гексацианоферрата (III) с образованием окрашенных продуктов. Данная реакция интересна для идентификации медиборола в лекарственных формах.
Получение продукта реакции окисления медиборола осуществляли по следующей методике: 0,5 г медиборола растворяли в 50 мл гексана. 2,5 г калия гидроксида и 7,5 г калия гексацианоферрата (III) растворяли в 50 мл воды в конической колбе вместимостью 250 мл. Раствор медиборола добавляли по каплям к щелочному раствору калия гексацианоферрата (III) в течение 4-х часов при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. В случае образования феноксильных радикалов появляется синее окрашивание, которое не наблюдалось. Гексановый слой постепенно окрашивался в ярко-оранжевый цвет. Полученный раствор переливали в делительную воронку и отделяли нижний водный слой. Затем гексановый раствор промывали водой до нейтральной реакции и отрицательной реакции образования «турнбулевой сини» с железа сульфатом (II) (FeSO4 2H2O) в промывных водах. После этого гексановый раствор концентрировали досуха под вакуумом при температуре 30 оС. Для отделения медиборола от полученного продукта в колбу постепенно добавляли 95 % этанол до объема 100 мл. При этом колбу нагревали на водяной бане с обратным холодильником при температуре 80-85 оС. Поскольку продукт реакции значительно хуже растворялся в этаноле, чем медиборол, горячий раствор фильтровали через стеклянный фильтр ВФ-2–16-ПОР и остаток на фильтре высушивали в эксикаторе. Отсутствие медиборола подтверждали методом ТСХ в системе гексан-этилацетат 95:5.
В результате был получен однородный порошок ярко оранжевого цвета. Выход продукта взаимодействия медиборола со щелочным раствором калия гексацианоферрата (III) составил 0,3102 г или 61,9 % по отношению к массе медиборола.
Растворы исследуемого вещества в гексане в зависимости от концентрации имеют цвет от желтого до оранжевого. Поэтому данные растворы в видимой области поглощают максимально свет в синей зоне спектра (400-500 нм) и, соответственно, в УФ-спектре наблюдаются два максимума поглощения: слабо выраженный при 302±2 и высокоинтенсивный 465±2 нм, а также плечо в области 434 нм (рис. 5).
Согласно рассмотренным выше литературным данным, продукт реакции окисления медиборола должен иметь пероксидное строение (рис. 6).
ИК-спектр исследуемого вещества в области от 4000 до 400 см-1 в дисках с калия бромидом (1 мг/300 мг KBr) представлен на рисунке 7. Для спектра характерно наличие интенсивных полос поглощения в области 2800-3000 см-1, отвечающим валентным колебаниям С-Н-связей в -СН2- и СН3-группах. В диапазоне 1340-1480 см-1 полосы поглощения соответствуют деформационным колебаниям С-Н-связи в этих группах. Полоса поглощения 1605 см-1 свидетельствует о наличие в структуре исследуемого вещества карбонильной группы (С=О), 1572 см-1 - о сопряженных двойных связей (С=С). Обертон валентных колебаний карбонильной группы лежит в области 3550-3200 см-1.
Согласно спектрам ЯМР 1H и 13С (рис. 8, 9, 10) исследуемого вещества, снятым в CDCl3, его строение отличается от предполагаемой структуры, представленной на рисунке 6.
В данном соединении отсутствует пероксидная группа, что подтверждается качественной реакцией на данную группу с 2 % раствором калия иодида, подкисленным разбавленной хлористоводородной кислотой. Так как не наблюдалось окрашивание хлороформного слоя в фиолетовый цвет за счет выделения свободного йода, и не появлялось синее окрашивание при добавлении раствора крахмала.
Кроме того, полученные значения элементного анализа исследуемого вещества, %: С 85,60, Н 9,72, О 4,38 соответствовали брутто-формуле С54Н74O2 (вычисленные соотношения, %: С 85,89, Н 9,88, О 4,23).
Методика качественного анализа медиборола в лекарственных формах методом тонкослойной хроматографии
В результате проведенных исследований созданы методики качественного определения медиборола в лекарственных препаратах. Идентификацию медиборола в масляном растворе осуществляют по следующей методике: навеску пробы 2 % раствора медиборола в масле массой от 0,20 г до 0,30 г, взятой с точностью до 0,001 г, помещают в коническую колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 10 мл хлороформа, взбалтывают в течение 2-3 мин до полного растворения. Из полученного раствора берут аликвоту объемом 0,004 мл и наносят на линию старта пластинки «Сорбфил ПТСХ-АФ-УФ» размером 510 см. При этом содержание лекарственного вещества в исследуемой пробе составляет в среднем 2 мкг в зависимости от плотности масляного раствора. Использование большей навески масляного раствора медиборола может привести к тому, что компоненты масла будут препятствовать разделению веществ на пластинке, и в результате будет наблюдаться меньшее значение Rf медиборола в испытуемом растворе, по сравнению с Rf свидетеля. Рядом наносят 0,002 мл 0,1 % раствора свидетеля в хлороформе, что соответствует содержанию медиборола в данном объеме 2 мкг. Для подтверждения наличия медиборола в суппозиториях: одну свечу с медиборолом помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 50 мл, прибавляют 25 мл хлороформа, взбалтывают до полного растворения. Аликвоту полученного раствора объемом 0,002 мл наносят на линию старта пластинки «Сорбфил ПТСХ-АФ-УФ» размером 510 см. При этом содержание лекарственного вещества в исследуемой пробе составляет в среднем 4 мкг в зависимости от массы суппозитория. Рядом в качестве свидетеля наносят 0,004 мл 0,1 % раствора образца медиборола в хлороформе, что соответствует содержанию лекарственного вещества в данном объеме 4 мкг. Для проведения идентификации исследуемые растворы медиборола и раствор свидетеля наносятся на пластинку в близких количествах по содержанию медиборолу, чтобы на пластинках пятна медиборола исследуемых растворов и раствора свидетеля не отличались по форме и размерам.
Пластинки с нанесенными пробами хроматографируют в системе растворителей гексан-этилацетат в объемном соотношении 95:5. Затем, после прохождения фронтом растворителя около 8,5 см пластинки вынимают из камеры, высушивают на воздухе в течение 5 мин, пропускают через раствор 1 % калия гексацианоферрата и 1 % калия гидроксида в соотношениях 4:1 и нагревают в сушильном шкафу при температуре 80 С в течение 5 мин. После проявления на хроматограммах должны наблюдаться оранжевые пятна медиборола, находящиеся на уровне пятна стандартного образца.
Таким образом, разработанная методика идентификации обладает высокой чувствительностью и селективностью, что позволит контролировать качество выпускаемых препаратов медиборола в контрольно-аналитических лабораториях, а также выявлять фальсифицированные лекарственные средства. Данная методика не требует много времени для проведения анализа, что свидетельствует об ее экспрессности. Кроме того, она обладает такими достоинствами, как простота определения медиборола в лекарственных препаратах и доступность реактивов, что также важно для практического применения. Глава 4. Разработка методик количественного определения медиборола в лекарственных формах 4.1. Спектрофотометрическое определение медиборола в масляных растворах
В анализе многокомпонентных смесей органических соединений спектрофотометрия прочно занимает второе место после хроматографии. Спектрофотометрические методики хорошо обоснованы в теоретическом отношении и широко применяются на практике, обеспечивая достаточно высокие показатели точности и чувствительности [15].
В УФ-области спектра медиборола в 95 % спирте этиловом присутствует максимум поглощения при длине волны 282±2 нм, при этом в диапазоне концентраций вещества 0,0005-0,016 % наблюдается подчинение закону Бугера-Ламберта-Бера. Удельный показатель поглощения медиборола в указанных концентрациях составляет 72,2±0,9 [49], что позволяет использовать спектрофотометрию в УФ-области спектра для анализа медиборола в лекарственных формах.
Для спектрофотометрического определения медиборола в масляном растворе проводили следующую пробоподговку.
Методика приготовления испытуемого раствора: навеску пробы 2 % раствора медиборола в масле массой от 0,140 г до 0,160 г, взятой с точностью до 0,0001 г, помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 50 мл, прибавляют 5 мл 95 % спирта этилового и нагревают с обратным холодильником на водяной бане при температуре 80-85 oC в течение 15 мин при постоянном встряхивании. После охлаждения раствора до комнатной температуры раствор профильтровывают в мерную колбу вместимостью 50 мл через бумажный фильтр «синяя лента», предварительно смоченный спиртом этиловым. Коническую колбу промывают 2 раза по 10 мл 95 % спирта этитового, этанольные растворы также профильтровывают в мерную колбу и доводят до метки тем же растворителем (раствор А). Навеска масляного раствора подобрали таким образом, чтобы она полностью растворялась в заданном объеме спирта этилового при нагревании, а при охлаждении до комнатной температуры компоненты масла осаждались, при этом медиборол оставался в растворе.
Методика приготовления раствора РСО медиборола: навеску образца субстанции медиборола массой от 0,020 г до 0,040 г, взятой с точностью до 0,0001 г, помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и растворяют при встряхивании в 40 мл 95 % спирта этилового. Затем содержимое колбы доводят до метки 95 % спиртом этиловым (раствор Б). Из полученного раствора Б берут аликвоту объемом 5 мл, переносят ее в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят до метки 95 % спиртом этиловым (раствор В).
Оптические плотности растворов А и В измеряют на спектрофотометре в кюветах с толщиной слоя 1 см, используя в качестве раствора сравнения 95% спирт этиловый.
Разработка и валидация методики количественного определения медиборола в ректальной лекарственной форме
Робастность представляет собой способность аналитической методики не подвергаться влиянию малых, задаваемых аналитиком изменений в условиях выполнения методики, которые реально возможны на практике [99, 125, 135]. Оценку устойчивости аналитической системы проводили при небольшом изменении температуры и скорости потока.
С этой целью проводили по 3 определения на 2,0 % масляном растворе при стандартных условиях (температура колонки – 40,0 оC, скорость подачи – 100,0 мкл/мин) и при изменении условий анализа (температура колонки – 40,0 оC, скорость подачи – 90,0 мкл/мин; температура колонки – 35,0 оC, скорость подачи – 100,0 мкл/мин). Влияние параметров оценивали с помощью следующих характеристик: время удерживания, разрешение, фактор асимметрии, коэффициент емкости, число теоретических тарелок, площадь пика и полученное значение содержания основного вещества в масляном растворе (табл. 13).
Как видно из таблицы 13, снижение температуры и скорости потока незначительно влияют на параметры хроматографической системы, что указывает на надежность методики при е использовании в указанных условиях.
Таким образом, предложенная методика позволяет определить содержание медиборола в масляных растворах с малой погрешностью (0,81 – 0,94 %). Другими достоинствами методики является простота и возможность определения медиборола без предварительного отделения компонентов масла.Для количественного определения медиборола в ректальной лекарственной форме предложен метод УФ-спектрофотометрии, поскольку данный метод обладает рядом достоинств, таких как простота эксперимента, специфичность и другие.
При растворении суппозиториев с медибролом в изопропиловом спирте в области максимума поглощения анализируемого вещества поглощают и компоненты основы лекарственной формы, поэтому была выбрана пробоподготовка, основанная на экстракции медиборола из суппозиториев 95 % спиртом этиловым.
Приготовление испытуемого раствора: одну свечу помещают в коническую колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляют 80 мл спирта этилового 95 %, нагревают на водяной бане (температура бани 80-85 оС) с обратным холодильником в течение 15 мин при периодическом встряхивании (до полного растворения свечи). Затем содержимое колбы охлаждают на льду, чтобы максимально отделить компоненты основы свечей от раствора, и последний помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл; коническую колбу промывают 3 раза по 5 мл спирта этилового 95 %, этанольные растворы переливают в мерную колбу и доводят до метки тем же растворителем при комнатной температуре. Раствор перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр «синяя лента», отбрасывая первую порцию фильтрата. Из полученного фильтрата берут аликвоту объемом 5 мл, переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объм до метки спиртом этиловым 95 % и перемешивают.
Приготовление раствора РСО медиборола. Навеску образца субстанции медиборола массой от 0,040 г до 0,060 г, взятой с точностью до 0,0001 г, помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл спирта этилового 95 %, перемешивают до полного растворения и доводят спиртом этиловым 95 % до метки. Из полученного раствора берут аликвоту объемом 5 мл, переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят спиртом этиловым 95 % до метки и тщательно перемешивают.
Измеряют оптическую плотность полученного раствора на
спектрофотометре при длине волны 282±2 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Параллельно, аналогичным образом, измеряют оптическую плотность раствора РСО медиборола.
В качестве раствора сравнения применяют спирт этиловый 95 %. Содержание медиборола в одной свече в граммах (Х) вычисляют по формуле:
Валидационную оценку разработанной методики осуществляли согласно официальным рекомендациям [20, 135, 136] по следующим параметрам: специфичность, прецизионность и правильность.
Предложенная методика обладает специфичностью, так как позволяет определять анализируемое вещество в присутствии других компонентов лекарственной формы при аналитической длине волны 282±2 нм, которая соответствует максимуму поглощения этанольного раствора медиборола [49].
На рисунке 22 представлены спектры поглощения раствора медиборола и раствора основы суппозиторий. Анализ спектров поглощения показывает, что компоненты основы свечей не оказывают влияния на поглощение медиборола при заданной длине волны.
