Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Интегральные показатели при определении фенольных соединений в водах и пищевых продуктах 12
1.1. Общая характеристика фенольных соединений как аналитов 12
1.2. Определение фенольных токсикантов в водах 14
1.2.1. Фенольные соединения в водах 14
1.2.2. Извлечение фенольных токсикантов из водной фазы 16
1.2.3. Гравиметрические и титриметрические методы определения фенолов 18
1.2.4. Спектрофотометрические методы определения фенольных токсикантов 19
1.2.5. Флуориметрические методы определения фенольных токсикантов 27
1.2.6. Другие методы 29
1.3. Методы определения фенольных антиоксидантов 30
1.3.1. Общая характеристика антиоксидантов и методов их определения 30
1.3.2. Определение суммарного содержания фенольных антиоксидантов 32
1.3.3. Показатели антиоксидантной активности 34
1.3.4. Оценка антиоксидантной активности по методу FRAP 39
1.4. Заключение по главе 1 42
Глава 2. Оценка сумммарного содержания фенольных токсикантов с применением диазотированной сульфаниловой кислоты 44
2.1. Объекты и методы исследования 44
2.1.1. Уточнение состава и характеристика группы «фенольные токсиканты» 44
2.1.2. Модельные соединения и их смеси 47
2.1.3. Методы исследования 48
2.2. Выбор реагента. Формирование сигналов индивидуальных фенольных токсикантов 51
2.2.1. Спектры поглощения азокрасителей 51
2.2.2. Градуировочные зависимости и выбор условий анализа 54
2.3. Определение суммарного содержания фенольных токсикантов в их модельных смесях в отсутствие посторонних веществ 57
2.3.1. Результаты и погрешности анализа модельных смесей 57
2.3.2. Причины возникновения систематических погрешностей 59
2.4. Влияние посторонних веществ 62
2.4.1. Обоснование выбора посторонних веществ 62
2.4.2. Результаты проверки влияния посторонних веществ 63
2.4.3. Отгонка с водяным паром как способ устранения мешающего влияния ароматических аминов 66
2.5. Заключение по главе 2 67
Глава 3. Определение суммарного содержания фенольных антиоксидантов 70
3.1. Объекты и методы исследования 70
3.1.1. Уточнение состава группы фенольных антиоксидантов 70
3.1.2. Выбор реагентов 72
3.1.3 Модельные соединения и оборудование 74
3.1.4. Методики выполнения измерений 76
3.2. Формирование сигналов индивидуальных фенольных антиоксидантов 78
3.2.1. Спектры поглощения продуктов реакции 78
3.2.2. Выбор условий анализа 80
3.2.3. Динамика формирования аналитических сигналов 81
3.2.4. Градуировочные зависимости 83
3.3. Определение суммарного содержания фенольных антиоксидантов в модельных смесях 85
3.3.1. Результаты и погрешности анализа 85
3.3.2. Причины возникновения систематических погрешностей 87
3.4. Влияние посторонних веществ 93
3.4.1. Селективность определения индивидуальных полифенолов 93
3.4.2. Результаты определения суммарного содержания фенольных антиок-сидантов в модельных смесях в присутствии посторонних веществ 97
3.5. Заключение к главе 3 99
Глава 4. Результаты определения суммарного содержания фенольных соединений в водах и пищевых продуктах 101
4.1. Интервальные оценки суммарного содержания фенольных соединений 101
4.1.1. Постановка проблемы и выбор модели 101
4.1.2. Вывод расчетных формул 103
4.1.3. Интервальные оценки в анализе модельных смесей 106
4.2. Результаты определения фенольных токсикантов в сточных водах 109
4.2.1. Объекты и методики анализа 109
4.2.2. Результаты анализа сточных вод 110
0 4.3. Результаты определения суммы фенольных антиоксидантов в пище вых продуктах 113
4.3.1. Объекты и методики анализа 113
4.3.2. Результаты анализа пищевых продуктов 115
4.4. Заключение по главе 4 120
Заключение 121
Выводы 123
Благодарности 124
Список литературы 125
- Спектрофотометрические методы определения фенольных токсикантов
- Градуировочные зависимости и выбор условий анализа
- Причины возникновения систематических погрешностей
- Результаты анализа пищевых продуктов
Введение к работе
Актуальность работы. Суммарное содержание (с) структурно-однотипных органических соединений часто определяют спектрофотометрическим методом без их разделения. Результатом анализа являются интегральные показатели состава (ИП), выраженные в единицах концентрации стандартного вещества (Хст). Так, суммарное содержание токсичных фенолов в водах оценивают с помощью ИП «фенольный индекс» (ФИ) в пересчете на простейший фенол С6Н5ОН. О суммарном содержании антиоксидантов (АО) в пищевых продуктах судят с помощью ИП «антиоксидантная активность» (АОА) в пересчете на тролокс или аскорбиновую кислоту. В обоих случаях используют групповые реагенты. Найденное значение ИП (с*) считают приблизительно равным суммарному содержанию аналитов искомой группы (с* с). К сожалению, простые и быстрые методики измерения ИП часто приводят к хорошо воспроизводимым, но неправильным оценкам с. Найденные по стандартным методикам значения ФИ намного ниже суммарного содержания фенолов в анализируемых смесях и сточных водах (А.Т.Магасумова, Л.В.Тропынина, Т.В.Антонова, E.Brown, D.F.Goerlitz). Это ведет к опасной недооценке фенольного загрязнения водоемов и ошибочным природоохранным решениям. Неточное определение суммарного содержания фенольных АО в пищевых продуктах по методу FRAP (ferric reducing antioxidant power) или по методу Фолина-Чиокальтеу приводит к неверным медицинским и технологическим рекомендациям. Таким образом, проблема точной оценки суммарного содержания фенолов весьма актуальна.
Значения пересчетных ИП зависят не только от с, но и от состава смеси аналитов в пробе, от выбора реагента и стандартного вещества, а также от способа измерения обобщенного аналитического сигнала (M.Valcarsel, А.А.Кленкин, В.И.Вершинин). В каждом случае важно выявить причины возникновения систематических погрешностей и найти способы их исключения или учета. Недавно оптимизированы способы определения суммы углеводородов в водах (М.А.Федорова, Р.Р.Шагидуллин и др.) и суммы белков в биологических жидкостях (Е.С.Ларичева, П.В.Анисимович, D.A.Zaia). Определение суммы фенолов - более трудная задача, так как совместно определять надо не все, а лишь некоторые фенолы (например, высокотоксичные), причем на низком концентрационном уровне. Для фенолов характерно разнообразие свойств и высокая реакционная способность. Способы определения суммарного содержания фенольных соединений в виде ИП недостаточно изучены, в этой области необходимы новые исследования. Основная проблема - возможность неправильной оценки суммарного содержания однотипных веществ в пересчете на стандартное вещество. Для решения этой проблемы требуются новые способы оценки суммарных содержаний, что важно не только при определении фенолов, но и в других случаях.
Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (проект 2436 в рамках государственного задания № 2014/147), а также при поддержке РФФИ и Администрации Омской области (проект 16-03-5500479).
Цель и задачи. Цель исследования – повысить правильность спектрофотометриче-ского определения суммарного содержания однотипных фенолов в неразделенных смесях.
Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Уточнить индивидуальный состав двух групп фенольных соединений, а именно:
а) фенольных токсикантов, присутствующих в природных и сточных водах, б) фенольных
антиоксидантов-восстановителей в пищевых продуктах.
-
Выявить основные источники систематических погрешностей при определении суммарных содержаний фенолов каждой группы в пересчете на стандартное вещество. Предложить способы снижения или учета соответствующих погрешностей.
-
Сопоставить известные методики спектрофотометрического определения суммы фенольных токсикантов в водах и разработать методику, обеспечивающую большую точность результатов, чем известные, а затем апробировать ее в анализе сточных вод.
-
Оптимизировать методику спектрофотометрического определения суммы феноль-ных антиоксидантов (метод FRAP) и апробировать ее в анализе пищевых продуктов.
-
Разработать алгоритм интервальной оценки суммарного содержания однотипных соединений с учетом внутригрупповой селективности сигналов и проверить правильность получаемых интервальных оценок применительно к вышеуказанным группам фенолов.
Научная новизна. Предложены критерии включения индивидуальных веществ в группы совместно определяемых фенолов. Впервые изучена динамика формирования аналитических сигналов при взаимодействии фенолов с выбранными групповыми реагентами; оптимизированы условия проведения реакций, проверена аддитивность аналитических сигналов, изучено влияние посторонних веществ и выявлены ранее неизвестные источники систематических погрешностей.
Показано, что основным источником систематической погрешности при спектрометрическом определении суммарного содержания однотипных фенолов является внутригруп-повая селективность сигналов, возникающая из-за разной скорости и разной стехиометрии взаимодействия фенолов с групповым реагентом, а также из-за специфики спектров поглощения фотометрируемых соединений. Другие, менее важные источники погрешности - неаддитивность сигналов и влияние посторонних веществ. Впервые установлено, что определение фенольных АО по методу FRAP дает заниженные результаты в присутствии комплек-сантов, исследован механизм этого явления. Предложены новые способы снижения погрешностей при определении суммарного содержания однотипных фенолов (подбор вспомогательного реагента, оптимизация времени экспозиции, применение метода добавок).
Разработан способ интервальной оценки с, учитывающий внутригрупповую селективность сигналов. Независимость ширины интервала от выбора Хст подтверждена в анализе модельных смесей и реальных объектов. Впервые получены интервальные оценки содержания фенольных токсикантов в водах и фенольных антиоксидантов в пищевых продуктах.
Практическая значимость. Разработаны новые способы определения суммарного содержания фенолов, более точные, чем известные. При определении фенольных токсикантов по реакции с диазотированной сульфаниловой кислотой (ДСК) погрешность не превышает 30 % отн., что в 2-3 раза меньше, чем при определении ФИ по реакции с 4-амино-антипирином (4-АА). При определении фенольных антиоксидантов методом FRAP в присут-4
ствии 2,2-дипиридила погрешность не превышает 20 % отн.; анализ дает достаточно точные результаты, даже если проба содержит комплексанты (тартраты, фосфаты и др.). Разработанные методики апробированы в анализе сточных вод и пищевых продуктов (вина, чай и др.). Правильность результатов подтверждена с использованием способа «введено-найдено», а также с помощью референтных методик. Применение системы интервальных оценок позволяет сопоставлять данные, полученные с применением разных стандартов, наглядно и объективно характеризовать неопределенность результатов анализа, а также упростить разработку методик за счет отказа от трудоемкого подбора оптимального стандартного вещества.
На защиту выносятся:
1. Критерии отнесения фенольных соединений к группам совместно определяемых
фенольных токсикантов в водах и фенольных антиоксидантов в пищевых продуктах.
2. Возможность и целесообразность использования ДСК как группового реагента при
определении фенольных токсикантов в сточных водах, вместо ныне применяемого 4-АА.
3. Целесообразность применения 2,2-дипиридила в качестве вспомогательного реа
гента при определении суммы фенольных антиоксидантов по методу FRAP.
4. Гипотеза о внутригрупповой селективности аналитических сигналов индивидуаль
ных фенолов как основном источнике систематических погрешностей при спектрометриче
ской оценке суммарного содержания однотипных фенолов.
-
Гипотеза о разной скорости взаимодействия однотипных фенолов с групповым реагентом как одном из источников внутригрупповой селективности при спектрофотометриче-ском определении их суммарного содержания. Новый способ нивелирования аналитических сигналов фенолов (оптимизация времени экспозиции).
-
Алгоритм интервальной оценки суммарного содержания однотипных соединений (в частности, фенолов) с учетом внутригрупповой селективности сигналов. Независимость ширины соответствующего интервала от выбора стандартного вещества.
Личный вклад автора. Автор принимал участие в планировании и постановке исследований, самостоятельно проводил эксперимент, участвовал в обсуждении полученных результатов и подготовке публикаций. Результаты, изложенные в главе 2, получены с участием М.В.Бахаревой, в главе 3 – Т.Г.Цюпко, в главе 4 – Н.А.Исаченко.
Апробация работы. Результаты представлены на следующих конференциях: II Международная Российско-Казахстанская конференция по химии и химической технологии (Караганда, 2012); V Всероссийская научная молодежная школа-конференция «Химия под знаком Сигма. Исследования, инновации, технологии» (Омск, 2016); X Всероссийская конференция по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-2016» (Углич, 2016); X Всероссийская конференция (с международным участием) «Аналитика Сибири и Дальнего Востока» (Барнаул, 2016); V региональная конференция аспирантов и молодых ученых по физике, математике и химии (Омск, 2017); Третий съезд аналитиков России (Москва, 2017).
Публикации. Результаты диссертационного исследования изложены в 14 публикациях, в том числе в 6 статьях в журналах из списка ВАК и 2 статьях в других журналах или
сборниках; 4 статьи включены в международные базы данных Scopus и/или Web of Science.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения и списка литературы, включающего 118 библиографических ссылок. Общий объем диссертации составляет 137 страниц и содержит 11 рисунков и 47 таблиц. Во введении обоснована актуальность работы, сформулированы ее цель и задачи. В главе 1 (литобзор) обсуждаются способы оценки суммарного содержания фенолов в водах и пищевых продуктах, основанные на измерении ИП. В главе 2 описан способ спектрометрического определения суммарного содержания фенольных токсикантов в виде азокрасителей и приведены результаты эксперимента, направленного на оптимизацию соответствующей методики. В главе 3 рассмотрены методические аспекты спектрометрического определения суммы фенольных антиоксидантов-восстановителей по методу FRAP с применением 2,2-дипиридила; описана методика и приведены результаты анализа модельных смесей. Глава 4 посвящена оценке суммарного содержания однотипных веществ в интервальном виде, с учетом внутригруппо-вой селективности сигналов. Разработанный алгоритм проверен при определении однотипных фенолов в модельных смесях и применен в анализе сточных вод и пищевых продуктов. В «Заключении» обсуждается соответствие результатов проведенной работы ранее поставленным задачам, намечены перспективы дальнейших исследований.
Спектрофотометрические методы определения фенольных токсикантов
Спектрофотометрические методики определения суммарного содержания фе-нольных токсикантов применяют наиболее часто. В случае раздельного определения индивидуальных фенолов сходство их спектров поглощения (или сходство спектров их однотипных производных) является серьезным недостатком. Однако это сходство способствует правильной оценке суммарного содержания фенолов, в том числе в водах, что является более важной задачей.
Низкие молярные коэффициенты светопоглощения в видимой и УФ-области не позволяют определять фенолы в водах по их собственному светопоглощению. Еще меньше коэффициенты поглощения фенолов в ИК-области. Поэтому все спектрометрические методики определения фенолов в водах основаны на переводе фенолов в окрашенные соединения с органическими фотометрическими реагентами. Возможность выбора полос поглощения, сравнительная легкость и высокая точность измерений (при использовании современной аппаратуры) обеспечивают широкое применение спектрофотометрии для определения суммы фенольных токсикантов. Такие методики широко применяют для мониторинга окружающей среды [23].
Определение фенольного индекса по реакции с 4-аминоантипирином. В российских контрольно-аналитических лабораториях природоохранного профиля ФИ определяют по стандартным методикам ПНД Ф 14.1:2.105-97 [6] и ПНД Ф 14.1:2.104-97 [24]. Величину ФИ определяют спектрофотометрическим методом в диапазоне концентраций от 2 до 30 мкг/дм3, продолжительность анализа около 2 часов. Пробы, сильно загрязненные фенолами, предварительно разбавляют. Групповой реагент – 4-аминоантипирин (4-АА). Фенолы реагируют с ним при рН 10 в присутствии гекса-цианоферрата(III) калия. Важно поддержание рН на требуемом уровне, т.к. при более высоких и низких значениях рН с реагентом реагируют компоненты пробы, не относящиеся к группе фенольных токсикантов. Кроме того, при рН 10,2 окраска хино-ниминовых красителей нестабильна.
Расчет результатов анализа в пересчете на простейший фенол ведут по градуи-ровочному графику. Для увеличения чувствительности определения образовавшийся краситель экстрагируют хлороформом с последующим измерением оптической плотности экстракта в видимой области спектра. Метрологические характеристики определения суммы фенолов по методике [6], приведенные в соответствующем нормативном документе, представлены в таблице 2.
Примерно такие же метрологические характеристики повторяемости и воспроизводимости указаны в зарубежных нормативных документах, например, ASTM D 1783 [25]. Однако американские исследователи подчеркивают, что величина ФИ всегда ниже, чем суммарное содержание фенолов [26]. К тем же выводам пришли российские аналитики [15]. По некоторым данным, величина ФИ в среднем вдвое меньше, чем действительная концентрация фенолов в модельных многокомпонентных растворах [8]. Результаты анализа отдельных сточных вод с применением 4-АА могут приводить к значениям ФИ, на порядок меньшим, чем результаты, полученные с применением хроматографического анализа [9]. Таким образом, стандартные методики определения ФИ дают гораздо большие погрешности (по модулю), чем указанные в табл.2.
Получение заниженных значений ФИ может быть следствием: а) потерь фенолов в ходе их отгонки; б) инертности части фенолов при образовании хинонимино-вых красителей; в) различной чувствительности определения индивидуальных фенолов с 4-АА; г) отклонений от аддитивности светопоглощения смеси продуктов реакции 4-АА с фенолами. Рассмотрим эти факторы более подробно.
Отгонка фенолов. В ходе определения ФИ влияние матрицы устраняют, отгоняя летучие фенолы. Дистиллят используют для получения окрашенных продуктов с 4-АА. Проверка показала, что с водяным паром отгоняются все хлорированные фенолы. Алкилзамещенные фенолы, за исключением 2-гидроксиметилфенола, также отгоняются с водяным паром, однако потери о-крезола, о-этилфенола и 2-21 изопропилфенола в ходе их отгонки составляют от 15 до 50% [10]. Спектрофотомет-рическое определение фенола с 4-АА в сточных водах с предварительной отгонкой можно проводить, используя микроволновую обработку пробы [27]. Применение микроволновой обработки существенно сокращает длительность анализа (в 8 – 20 раз) и уменьшает потери фенолов, однако эта методика требует дорогостоящего и сложного оборудования, а предел обнаружения фенолов повышается до 10 мкг/дм3.
Пассивность некоторых фенолов в реакции с 4-АА. Многие фенольные токсиканты не реагируют с 4-АА. Из 16 проверенных Л.В. Тропыниной фенольных соединений достоверный вклад в формировании обобщенного сигнала дали лишь 5 соединений, в частности простейший фенол, о-ксилол и м-ксилол [10]. Вклад разных фе-нольных соединений в величину ФИ более детально изучен группой аналитиков из Уфы [8]. Так как гидроксильная группа в щелочной среде является орто- и пара-ориентантом, 2-метилфенол и 2,6-диметилфенол легко вступают в реакцию электро-фильного замещения с 4-АА. Соединения, у которых пара-положение занято, например, 4-метилфенол и 2,4- диметилфенол, не реагируют с 4-ААП. В случае 2,6-диметилфенола выход продукта реакции меньше, чем в случае 2-метилфенола, по-видимому, из-за стерических препятствий [8]. Те же факторы препятствуют протеканию реакции в случае с 2,6-ди-трет-бутил-фенолом. Свой вклад в величину ФИ вносят и некоторые производные фенолов. Все хлорированные фенолы, кроме пента-хлорфенола, образуют окрашенные соединения с 4-АА. Наибольшее светопоглоще-ние характерно для 2-хлорфенола. Метоксифенолы, как и хлорированные фенолы, образуют окрашенные соединения с 4-АА при любом положении заместителя. Из аминофенолов с 4-АА реагирует только 2-аминофенол. Из многоатомных фенолов в реакцию с 4-ААП вступают 1,2-дигидроксибензол и 1,3-дигидроксибензол, окрашенные производные которых характеризуются малоинтенсивным поглощением с макс = 469 и 507 нм соответственно.
Влияние структурных факторов. Как показано Т.В.Антоновой, появление систематических погрешностей при определении ФИ с 4-АА может быть обусловлено разной чувствительностью определения индивидуальных фенолов при фиксированной длине волны [15,28]. Сопоставление спектров поглощения продуктов взаимодействия разных фенольных соединений с 4-ААП показывает, что максимумы поглощения хинониминовых красителей на основе замещенных фенолов (за исключением 4 хлорфенола) батохромно смещены относительно красителя, полученного из незамещенного фенола. В условиях определения ФИ градуировочные графики однотипных фенольных соединений образуют широкий веер. При этом чувствительность спектрометрического определения стандартного вещества (С6Н5ОН) в 5-6 раз выше, чем чувствительность определения замещенных и бициклических фенолов [28], что противоречит рекомендациям по выбору стандартного вещества. С увеличением количества метоксигрупп и с изменением положения метоксигруппы в ароматическом ядре наблюдается снижение чувствительности определения в ряду 2-метоксифенол 3-метоксифенол 4-метоксифенол 2,6-диметоксифенол [8].
Известно, что разная чувствительность определения однотипных компонентов смеси (внутригрупповая селективность) приводит к неточной оценке их суммарного содержания в пересчете на стандартное вещество (Хст). Знак и абсолютную величину систематической погрешности с в таких случаях можно прогнозировать по довольно простым алгоритмам [29]. Если коэффициенты чувствительности компонентов смеси различаются в несколько раз (как при определении ФИ), относительная погрешность оценки с по величине с может составлять десятки, а иногда и сотни процентов, в зависимости от выбора стандарта и состава смеси. Это было подтверждено в экспериментах со смесями фенолов [28]. Использование простейшего фенола в качестве Хст приводило к заниженным оценкам суммарного содержания фенолов в модельных смесях известного состава. Для всех исследованных смесей систематическая погрешность с оказалась значимой. Ее абсолютная величина составляла от 15 до 90 %, в полном соответствии с теоретическими прогнозами. Вводить поправочные коэффициенты для компенсации погрешности нельзя, т.к. с зависит от соотношения концентраций разных фенолов, а оно обычно сильно меняется от пробы к пробе.
Градуировочные зависимости и выбор условий анализа
Градуировочные зависимости строили для всех ФТ при 360, 380 и 410 нм по результатам измерения 5 – 7 растворов с разной концентрацией. Графики, полученные при этих АДВ для всех индивидуальных ФТ в диапазоне от 1 до 20 мкМ, прямолинейны (r 0,99) и проходят через начало координат. Примером могут быть графики, полученные при 380 нм (рис.5).
Пределы обнаружения индивидуальных ФТ по этим графикам, вычисленные с учетом сходимости измерений, не превышают 0,5 мкМ. Нижние границы определяемых содержаний близки к 2 мкМ. Коэффициенты чувствительности при определении разных ФТ в одних и тех же условиях достоверно различаются. Безразмерный параметр Т (отношение максимального и минимального коэффициентов чувствительности для аналитов данной группы при их определении по данной методике) зависит от рН раствора, длины волны и времени экспозиции. При увеличении t до 90 мин. параметр Т, характеризующий внутригрупповую селективность сигналов десяти ФТ, снижается с 9,2 до 3,0, так как медленно реагирующие фенолы (в частности, п-крезол) успевают превратиться в азокрасители. Отметим, что при определении суммы фенолов с 4-АА параметр Т подсчитать нельзя, так как многие фенолы не взаимодействуют с 4-АА.
При использовании ДСК минимальные значения Т наблюдаются при 380 нм. Отметим, что наши предшественники рекомендовали измерять обобщенный сигнал фенольных токсикантов при 360 нм [33]. Однако это отличие не имеет принципиального характера, оно связано с тем, что мы использовали более обширную выборку модельных веществ. При 360 нм веер градуировок шире, чем при 380 нм только из-за одного соединения, а в его отсутствие различие между результатами применения этих АДВ снимается. В дальнейшем обобщенные сигналы измеряли как при 360, так и при 380 нм. Измерять сигналы при 410 нм не рекомендуется как из-за более высокой внутригрупповой селективности, так и ввиду низкой чувствительности определения стандартного вещества (простейшего фенола).
Для оценки влияния рН на чувствительность определения фенолов получали растворы азокрасителей при разных значениях рН, при прочих постоянных условиях. Необходимое значение рН получали, добавляя по каплям разбавленные растворы соляной кислоты или гидроксида натрия (потенциометрический контроль). Для всех исследуемых фенолов оптимальной областью измерений оказался интервал 7,2 – 7,6 единиц рН. В более кислых и более щелочных растворах сигналы достоверно снижались (табл. 10).
Влияние рН на сигналы фенолов нельзя объяснить ионизацией: в исследуемой области рН все ФТ находятся в одной и той же (неионизированной) форме. С учетом литературных данных [31] можно предположить, что снижение сигналов всех фенолов при рН 7,2 объясняется уменьшением скорости образования азокрасителей (в кислой среде они вообще не образуются). Снижение сигналов при рН 7,8 можно объяснить ускоренным разрушением азокрасителей [32]. Варьирование избыточной концентрации ДСК в интервале 25-150 мкМ достоверного влияния на сигналы фенолов не оказывает, что объясняет хорошую воспроизводимость сигналов, получаемых с использованием этого малоустойчивого реагента. Таблица 11. Сходимость аналитических сигналов разных фенолов при разных АДВ
Прецизионность измерений аналитических сигналов всех ФТ достаточно высокая (табл.11). Коэффициенты вариации при повторном приготовлении растворов не превышают 3 %. Сопоставление дисперсий, полученных для разных ФT по критерию Кохрена, не выявило достоверных различий между этими соединениями. Найденные значения Gрасч для полученных выборок равны 0,173 (=360нм), 0,329 (=380нм), 0,331 (=410нм). Табличное значение этого критерия для N=6, df=2, =0,05 составляет Gтабл=0,616.
Приведенные в разделе 2.2 экспериментальные данные в основном подтвердили правильность рекомендаций наших предшественников в отношении выбора и концентрации реагента, а также величины рН. Были уточнены рекомендации по выбору АДВ и времени экспозиции. Впервые получены данные по динамике образования разных азокрасителей. Различная чувствительность определения ФТ (внутригруппо-вая селективность) связана как с различиями спектров поглощения образующихся азокрасителей, так и с разной скоростью их образования.
Причины возникновения систематических погрешностей
Проверка аддитивности сигналов. Причиной систематических погрешностей при определении суммарного содержания ФА в модельных смесях могла быть неаддитивность аналитических сигналов. Обычно при оценке АОА по методу FRAP отклонения от аддитивности статистически незначимы, кроме феррицианидной системы [69-70].
При недостаточном избытке окислителя неаддитивность аналитических сигналов ФА была выявлена и в присутствии о-фенантролина [42], отклонения от аддитивности были отрицательны, могли доходить до -36%, но легко устранялись при увеличении начальной концентрации железа(III). В присутствии 2,2 -дипиридила све-топоглощение продуктов взаимодействия ФА с окислителем при 10-минутной экспозиции оказалось аддитивным (табл.30).
Увеличение времени экспозиции до 60 минут и переход к определению суммы ФА на более высоком концентрационном уровне также не привели к появлению значимых отклонений от аддитивности. Единственным исключением были смеси, одновременно содержащие галловую кислоту и катехол. Для них наблюдались значимые положительные отклонения от аддитивности светопоглощения. Выявленный эффект пока не нашел объяснения и требует дополнительного исследования. В дальнейших опытах эти смеси не использовались.
Очевидно, неаддитивность аналитических сигналов не является источником систематических погрешностей, затрудняющих определение суммарного содержания фенольных ФА в модельных смесях по методу FRAP. Систематические погрешности возникают в ходе анализа любых полифенольных смесей, а значимые отклонения от аддитивности – лишь в единичных случаях.
Внутригрупповая селективность сигналов. Наиболее вероятной причиной появления систематических погрешностей при определении суммарного содержания ФА в пересчете на стандартные вещества являются различия коэффициентов чувствительности при определении индивидуальных ФА. Для доказательства этой гипотезы мы, как и в случае определения ФТ, мы проверяли совпадение реально наблюдаемых погрешностей Сэксп с их прогнозируемыми значениями Сэксп. Результаты анализа выражали в пересчете на АК. Для прогнозов использовали формулу (6), которая основана на предположении о внутригрупповой селективности как единственном источнике систематических погрешностей группового анализа. В ходе расчетов значения коэффициентов чувствительности Кi получали при 60-минутной экспозиции. Прогнозируемые и реальные значения погрешностей для множества смесей совпадают (табл.28). Несовпадение прогнозов с экспериментом было выявлено только для смесей ГК – КТ, которые имеют неаддитивное светопоглощение. Данные табл.31 показывают, что приблизительное совпадение Сэксп и Срасч для некоторой смеси ФА наблюдается независимо от природы используемого стандартного вещества.
Такие же совпадения наблюдались и при 10-минутной экспозиции, а также при использовании другой индикаторной системы, то есть о-фенантролина [77]. Небольшие расхождения прогнозов и эксперимента связаны с влиянием случайных погрешностей измерения оптических плотностей и объемов, а также с погрешностями округления промежуточных данных. Правильность прогнозов не зависит от того, входит ли Хст в состав смеси или является внешним стандартом.
Очевидно, совпадение Сэксп и Срасч. для всех аддитивных смесей ФА подтверждают гипотезу об основном источнике систематической погрешности. Им является внутригрупповая селективность сигналов. Так как во всех случаях образуется один и тот же окрашенный комплекс железа(II), различная чувствительность определения индивидуальных полифенолов может быть вызвана разной стехиометрией взаимодействия индивидуальных полифенолов с окислителем – ионами железа(III). Известно, что молекула кверцетина отдает больше электронов (по разным данным - от 5 до 8), чем другие антиоксиданты полифенольного типа. Следовательно, кверцетин восстанавливает больше ионов железа(III) и формирует (при прочих равных условиях) более интенсивный аналитический сигнал, чем другие ФА.
Нивелирование аналитических сигналов фенольных антиоксидантов. При определении обобщенной антиоксидантной активности пищевых продуктов результат анализа нередко выражают в мкмоль-экв/л [97] или в так называемых тролокс-эквивалентах [42, 94, 98]. Это снижает влияние «стехиометрического фактора». Аналогичный прием целесообразно использовать и в случае определения суммы феноль-ных антиоксидантов, отдающих в ходе реакции разное число электронов. Чтобы экспериментально проверить эту возможность, необходимо было уточнить стехиометрию взаимодействия разных ФА с железом(III) в присутствии 2,2 -дипиридила. С этой целью мы проводили окислительно-восстановительное титрование индивидуальных ФА c потенциометрическим контролем точки эквивалентности, как описано в разделе 3.1.4. Растворы индивидуальных ФА и растворы соли железа(III) были приготовлены по точным навескам, молярные концентрации этих растворов были известны. Отметим, что стехиометрию взаимодействия исследуемых ФА с комплексным реагентом приходилось проверять при несколько более высоких концентрациях, чем при определении антиоксидантной активности. Во всех случаях титрант вводили очень медленно, дожидаясь приблизительного постоянства потенциала Pt-электрода. Титрант добавляли вплоть до 5 или 10-кратного избытка соответствующего реагента. Положение т.экв. во всех случаях определяли по положению максимума первой производной (дифференциальный метод). Затем рассчитывали нормальную концентрацию раствора ФА. Зная молярную и нормальную концентрации ФА, рассчитывали стехиометрическое соотношение реагентов, а также число электронов, отдаваемых одной молекулой ФАО в ходе титрования. Так, при титровании галловой кислоты было установлено, что одна молекула ГК в присутствии 2,2 -дипиридила реагирует с тремя ионами железа(III), то есть отдает три электрона. Это соответствует литературным данным по химизму окисления галловой кислоты [98, 99]. Результаты, полученные при титровании других полифенолов, также соответствуют литературным данным, полученным другими методами и в присутствии других железосвязывающих веществ (табл. 32).
Надежно определить число электронов, отдаваемых одной молекулой полифенола, удалось не для всех ФА. Для ФК максимум на дифференциальной кривой титрования был слабо выражены, а положение максимума на кривой несколько варьировало при повторении опытов. Для КВ положение т.экв. установить не удалось. Для АК, ГК и КТ наши данные совпадают с литературными, по РТ– отличаются от них.
Полученные данные были использованы для того, чтобы получить градуиро-вочные зависимости в новых координатах, как зависимости сигнала от нормальной концентрации соответствующего ФА.
Если при использовании молярных концентраций величина С доходила до 70 %, то при использовании нормальных концентраций она снизилась до 50 %. Те же эффекты наблюдали и при 10-минутных экспозициях (табл.33). Для выборки из 7 ФА параметр Т снижается с 3,0 до 2,07, а максимальная погрешность - с 45 до 20-25 % отн.
Как видно из рис. 10, использование нормальных концентраций ФА устраняет внутригрупповую селективность не полностью. Систематические погрешности также устраняются не полностью. Очевидно, внутригрупповая селективность сигналов вызывается не только различной стехиометрией окисления ФА, но и другими факторами. Известно, что коэффициенты чувствительности разных ФА зависят от скорости их окисления, а она не одинакова даже на первом этапе процесса. Не исключено и влияние побочных реакций, в частности влияния комплексообразования некоторых ФА с ионами железа. Полное устранение систематических погрешностей требует дополнительных исследований.
Приведенные в разделе 3.3. результаты эксперимента позволяют дать следующие практические рекомендации:
1. При определении суммарного содержания ФА по методу FRAP применять 10-минутные экспозиции, что позволяет получать более правильные результаты.
2. В качестве стандартного вещества использовать аскорбиновую кислоту.
3. Результат анализа выражать в мкмоль-экв/дм3. Одновременное использование этих рекомендаций позволяет снизить систематические погрешности анализа аддитивных модельных смесей ФА до 20-25 % отн.
Результаты анализа пищевых продуктов
Разработанные методики анализа вин, соков, чая и других пищевых продуктов приводят к результатам, которые по порядку величины близки к приведенным в литературе значениям обобщенной антиоксидантной активности (АОА) аналогичных продуктов (Т.Г. Цюпко, М. Сarlsen, D. Gozzolino и др.). Примером могут быть результаты анализа ряда образцов черного чая (табл.44), одновременно и независимо проанализированных в 2018 г. в ОмГУ и в КубГУ. Полученные по соответствующим методикам результаты достоверно закоррелированы (r = 0,96). Расхождения между результатами, выраженными в мкмоль Хст в 1 грамме чая, по модулю не превышают 30 % отн., несмотря на то, что в качестве стандарта в ОмГУ использовали аскорбиновую кислоту, а в КубГУ – галловую кислоту. Кроме того, в этих методиках применяли разные железосвязывающие реагенты (2,2 -дипиридил и о-фенантролин) и разные времена экспозиции (10 и 60 минут). Результаты, полученные по этим методикам, сближаются, если содержания антиоксидантов выражают в мкмоль-экв/г.
По нашим данным, разные образцы черного чая различаются не только по значению интегрального показателя АОА, но и по интервальным оценкам суммарного содержания фенольных антиоксидантов, учитывающим реальный уровень неопределенности результатов группового анализа с использованием нормальных концентраций. Следует отметить, что в вычисленные границы интервалов попадают не только данные ОмГУ, но и результаты анализов, проведенных в КубГУ, хотя они были выражены в пересчете на другое стандартное вещество (ГК). Анализ одних и тех же образцов черного чая с применением о-фенантролина приводит к более высоким значениям с, чем анализ с применением 2,2 -дипиридила. Этого и следовало ожидать, поскольку система Fe(III) - о-фенантролин является более сильным окислителем (E0 = 1,19 В), чем система Fe(III) - 2,2 -дипиридил (0,97 В). По литературным данным, в присутствии о-фенантролина могут окисляться некоторые восстановители (в том числе не являющиеся фенольными антиоксидантами), в присутствии 2,2 -дипиридила они не определяются. Однако во всех случаях найденные в присутствии о-фенантролина значения суммарного содержания фенольных антиоксидантов попадали в границы интервала, рассчитанного нами по формуле (18).
Методом ВЭЖХ в тех же чайных настоях определяли некоторые индивидуальные антиоксиданты (катехины) [118]. В частности, галловую кислоту (ГК), катехол (Кт), эпикатехин (ЭКт) и др. Однако по полученным в КубГУ данным, суммарное содержание катехинов не превышает 20 % от общего содержания ФА в чайных настоях. Достоверная корреляция между найденными значениями С и содержаниями индивидуальных катехинов в исследованных образцах не выявлена.
Анализ пищевых продуктов по разработанным в ОмГУ методикам с использованием разных Хст приводил к разным значениям с и, соответственно, разным значениям АОА. Однако получаемые при этом интервальные оценки с совпадали (табл.45). Таким образом, применение интервальных оценок позволяет исключить проблему выбора оптимального стандартного вещества. Объективный характер интервальных оценок, малочувствительных к индивидуальному составу смесей ФА в исследуемых пищевых продуктах, позволяет сравнивать результаты анализа разных продуктов (например, вина и сока), хотя в этих напитках содержатся совершенно разные по своему составу смеси фенольных антиоксидантов.
Результаты анализа пищевых продуктов, приведенные в табл.45, были получены с использованием градуировочных графиков, построенных по чистым растворам АК или КВ, в отсутствие мешающих веществ. Однако в пищевых продуктах, в частности, в винах, содержатся не только антиоксиданты, но и комплексанты, в частности винная кислота [95]. В ходе анализа винная кислота и ее анионы (тартраты) не восстанавливают железо(III), но связывают его в довольно прочный комплекс. Некоторые компоненты пищевых продуктов (танины, салицилаты) могут выступать и в качестве антиоксидантов, и в качестве комплексантов. Очевидно, присутствие комплек-сантов в пищевых продуктах должно приводить к заниженным результатам определения АОА по градуировочному графику. Как и в случае анализа модельных смесей, это влияние может быть уменьшено, если использовать способ добавок. Данное предположение было подтверждено в эксперименте (табл.46).
. При прочих равных условиях способ добавок приводил к более высоким значе ниям АОА исследованных продуктов, чем анализ по градуировочному графику. Различия средних статистически достоверны, за исключением данных по настоям черного чая. По-видимому, содержание комплексантов в черном чае очень мало, и влияние комплексантов не приводит к достоверно заниженным результатам анализа чайных настоев по градуировочному графику (расхождения не превышают 5% отн.). Поэтому анализ образцов чая мы рекомендуем проводить, используя менее трудоемкий способ – по градуировочному графику. Это согласуется с рекомендациями других авторов [63]. Напротив, вина и другие пищевые продукты мы рекомендуем анализировать, используя метод добавок, используя градуировочные графики лишь для полуколичественных анализов. Этот подход должен предотвратить возникновение дополнительных погрешностей, возникающих в присутствии комплексантов и не учитываемых нашими предшественниками. Переход к методу добавок несколько усложняет методики анализа, но не ухудшает сходимость измерений и не меняет величину НГОС по сравнению с определением суммы ФА по градуировочному графику.
Правильность результатов анализа разных пищевых продуктов по разработанным методикам была подтверждена с использованием способа «введено-найдено». Объектами анализа служили чайные настои и разные вина (табл.47). Анализ чайных настоев с добавками и без них проводили по градуировочному графику и методом добавок; анализ вин – методом добавок. Вводили добавки аскорбиновой кислоты, галловой кислоты и кверцетина. Независимо от вида продукта и состава добавки, получали приблизительно правильные результаты анализа пищевых продуктов, выявленные погрешности не превышали 20 % отн. по модулю. Эти погрешности, вероятно, связаны с потерями ФА в ходе анализа.