Введение к работе
Лкіу.-иміость проблемы. Соединения, содержащие аминные функционал эчые группы, представляют собой важнейшие классы органических веществ, широко распространены а живой природе и находят разностороннее применение в химической технологии, медицине, технике. Многие из аминосоедннений являются оысокотоксичнымм и их содержание требует контроля как в технологических смесях, так и в промышленных экосистемах.
Ряд факторов объективно усложняют аналитические процедуры разделения и определения аминосоедннений с различных объектах. К ним можно отнести высокую полярность молекул, что приводит к ухудшению элюационных, экстракционных характеристик определяемых веществ. Сильная изменчивость свойств аминосоедннений » іавнопмсети от степени замещения аминогруппы также затрудняет использование традиционных методов органического анализа. Кроме того, большая часть аминосоедннений как биогенного, так и экзогенного происхождения имеет неудовлетворительные аналитические характеристики из-за слабо выраженных хромофорных, электрофорных или флуорофорньгх свойств. В связи с этим при аналитических определениях этих веществ реакция лериватизации становится необходимой, а в некоторых случаях безальтернативной стадией пробоподготовки образца к анализу. Недостатком используемых для этих целей реагентов является невозможность получения производных N-замещенных, малоосновных аминосоедннений, низкая селективность в присутствии других классов органических веществ (например, фенолов), а также нензбирательность отклика аналитического сигнала на присутствие в анализируемом образце аминосоедннений различных классов. Эта факторы ограничивают возможности, а при анализе матриц сложного состава зачастую делают невозможным использование в органическом анализе таких систем, как проточно-икжекцнонный анализ, тест-методы
В то же время потребность в использовании экономичных и производительных аналитических методов для определении аминосоедннений в технологических средах, промышленных экосистемах вызывает необходимость изыскания таких реакций дериватизаиии, которые обеспечивают избирательность и чувствительность детектирования аналита.
Целью работы является изучение возможностей применения
хлордннитрозамещенных бенз-2,1,3-оксадиазола и их N-оксидов для избирательного и чувствительного определения аминосоедннений а ПрОТОЧНО'ИНжеКЦИОННОМ, спекгрофотометрическом и хроматографических методах анализа, тест-методами, установление общих закономерностей влияния среды, химической природы модифицирующего реагента и аминососдинеиия на аналитические свойства образующихся производных динитрозамещенных бенз-2,1,3-оксадназола, обоснование условий проведения реакций дериватизаиии определяемы веществ.
В рамках поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- изучить снекіральние, про политические, электрохимические свойства производных аминосоедннений различных классов установить сосіав продуктов аналитических реакций,
- установить связь между аналитическими характеристиками производных
аминосоеднненнй и составом используемых растворителей, изучить влияние компонентов
анализируемой матрицы на регистрируемый сигнал при проведении определений в
равновесных и неравновесных условиях;
-выявить условия использования и хранения рабочих растворов реагентов при аналитических определениях;
- изучить реакционную способность реагентов как фактора, обеспечивающего
чувствительность и избирательность детектирования аминосоеднненнй;
- обосновать принципы повышения избирательности и чувствительности
определения аминосоеднненнй в виде их производных в равновесных и неравновесных
условиях;
- изучить возможности применения реакций дериватнзации аминосоеднненнй в
спектрофотометрическом, хроматографнческом, проточно-инжекцнонном анализе, тест-
методах;
- выявить возможности применения реакций дериватнзации для изучения
генетически детерминированных процессов биотрансформацин аминосодержащих
лекарственных веществ в организме человека.
Работа выполнена в рамках планов Государственной стандартизации (N 1SS от 21.03.80 N 11-35-46, АН СССР, код 2.9.2.1, N гос. регистрации 80022487 от 23.03.80). ИТП Гособразования СССР "Создание новых высокоэффективных методов и приборов анализа веществ и материалов" (задание 9.1S), НТП Гособразования СССР "Тонкий органический синтез" (задание 5.7), РНТП "Экологически безопзеные процессы химии и химической технологии" (тема 109), программы "Новые высокоэффективные методы анализа вещесгв и материалов" РНТП "Университеты России" (1992-1995 гг.). заказ-нарядам 53-34 (19S9-1994 гг ) Госкомитета по высшей школе РФ, Фонда ISTC (Grant No 498, 1997 г.).
Научная новизна:
Для химической модификации определяемых алкил- и аршіамннов, гетероароматическнх аминов, гидразинов и лщразидов кислот впервые предложены хлординитрозамещенные бе>в-2,1,3-оксадиазола и их N-оксиды;
систематическое исследование реакций дернватизацни позволило выявить характер влияния степени замещения аминогруппы и заместителей в модифицируемом соединении на спектральные н'протолитические свойства производных аминосоеднненнй;
комплексом физико-химических методов изучены спектральные, кислотно-основные и другие характеристики синтетически выделенных динитробензофуразановых и днннтробензофуроксановых производных аминосоеднненнй различных классов, установлен их состав, определены количественные характеристики спектральных и протолитнческих свойств производных;
- в результате систематического изучения влияния состава среды на аналитические
свойства производных (NH- и ОН-кислот) показано, что равновесные процессы ионизации
поногеы и последующего разъединения ионных пар до свободных ионов приводят к
непостоянству их спектральных характеристик в неводиых средах и появлению артефактов
при элюировашш в условиях нормально-фазной ВЭЖХ. Количественно охарактеризованы
константы равновесии ионизации и диссоциации соединений;
на оснопс исследования влияния свойств растворителя, компонентов аналнміруемьгч сред нл спектральные (УФ-, видимая и инфракрасные области), >.>">пром!-,(ические свойства производных сформулированы критерии достни.тдшя и \Гпі|У.ие."л.чосгп и чувствительности лстсктнропаннн аналитическою сигнала в равновесных и неравновесных условиях,
в результати изучения кинвіякя реакции м-хлор-ЗЛ-динитробснзофуразапа п 7-хлор-Л.б-дтнппробензофуроксана с рядом амипосоедтгені'н в средах разного состава показана иозмолдшеп. использования приема чтшетнчоской "дискриминации" для лостнікенмя избирательности детектирования определяемых веществ в смесях сложного состава, обоснованы условия использования реагентов при аналитических определениях, вьіраОоїаиь: ьрімерин их выбора дли лернватнззшш аминосоединений различных классов;
показана возможность использоьшшл реакций дернолтімаппп длл разработки іесг-..ат-ппон. нрііі однії" ,""ч определения токсичных соединений в водной и воздушных средах,
показан* р<т«можиоо'іи нсп«"ьЗД!'яний реакций деркяатояашш аминосодержащих лекарственных веществ для изучения фенотшшчееклч "оиійнносісЛ б:!отрянс|и)і>мации ксенобиотиков в организме человека.
Практическая значимость работы. На основании результатов систематического изучения реакций дериватнзации аминосоединений хлордишгтрозамещеннымн бенз-2,1,3-оксадиазола и их N-оксидами в смешанных растворителях сформулированы основные-закономерности проведения аналитических определений с учетом состава растворителя, компонентов англизируемой матрицы, реакционной способности реагента, природы определяемого вещества.
Выявлены основные факторы, ' предеяягоипге избирательность и чувствительность детектирования ан.тлитов в виде пронзв' тных в равновесных и неравновесных условия.-;
ПредлО/кепы методики избирательного и чуьтвительного спектрофотометрнческого,
чроматографнческого и проточно-пнжекционного определения аминосоединений в
промышленных и модельных смесях, сточных водах, биологических субстратах,
содержащих близкие по химической природе и свойствам компоненты. Разработаны тест-
методы для избирательного и чувствительного детектирования токсичных
аминосоединений в воздушной и водной средах.
Разработан метод определения генетически детерминированного процесса бнотрансформацпи ксенобиотиков по типу ацетнлирования в организме человека, пригодный для оптимизации безопасной дозировки лекарственных веществ.
На защиту ныносяген:
- результаты изучения продуктов реакций дернвапиашш гидразинов, гидразидов
кислот, алкнл- и ариламинов, гетероциклических аминов хлордимнтрозамещеннымн бенз-
2,1,3-оксаднмола и их N-оксидами методами спектрального анализа и масс-спектромеїрии,
диэлектрической спектроскопии, хроматографии, потенциометрии, кондуктометрии,
вольтамперомсірии.
- обоснование роли растворителя, компонентов анализируемой матрицы а
формировании аналитического сигнала при определениях аминосоединешш и виде их
про вводных в равновесных и неравновесных условиях;
обоснование выбора условий избирательного и чувствительного детектирования амниосоедшіений в виде бензоксадиазольиых производных с учетом свойств определяемого вещестпа, состава реакционной среды, электрофнльных свойств используемого реагента,
метод определения фенотипа биотрансформации амнносодержащих лекарственных веществ по типу ацетилирования и результаты его клинического использования;
методики спсктрофотометрнчсского, хроматографического. проточно-пнжекциоиного определения гидразинов, гндразидов кислот, арил- и длкиламшю», гетероциклических аминов в промышленных и модельных смесях, СТОЧНЫХ 1ІОДЗЧ II воздушной среде;
- тест-методы колористического, спектрофотометрического и хроматогрофического
определения токсичных пмшюсоединеннй в воздушных її водных средах.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на VI Менделеевской дискуссии (Харьков, I9S3), 3 Всесоюзном совещании "Комплексы с переносом заряда и ион-радикальные соли" (Черноголовка, 1984), 3 всесоюзном совещании "Проблемы сольватации и комплексообразования п неводных средах* (Иваново, 19S4), конференциях по ЭМА (Томск, 19S5, Москва, 1994), ! Всесоюзной конференции "Химия и применение неводных растворов" (Иваново, 1986), Vtl Всесоюзном совещании "Применение вычислительной техники в химических исследованиях п спектроскопии молекул" (Рига, 1986), Всесоюзной конференции "Кислотно-основные равновесия и сольватация в неводных средах" (Харьков. 1987), семинаре "Экология и аналитическая химия" (Ленинград, 1991), VI Всесоюзной конференции по аналитической химии органических веществ (Москва, 1991), Всесоюзной конференции " Аналитическая химия объектов окружающей среды" (Сочи, 1991), семинарах "Технология ключевых соединении, используемых в синтезе биологически активных веществ" (Пенза, 1991), "Современные методы анализа промышленных материалов и природных объектов" (Санкт-Петербург, 1992), симпозиуме "Екология-92" (Бургас, Болгария, 1992), XV Менделеевском съезде (Минск, 1993), симпозиуме по проточному анализу (Москва, 1994), H-1V Национальных конгрессах "Человек и лекарство' (Москва, 1995-97 гг.), 1 съезде Российского научного общества фармакологов (Волгоград, 1995), международных симпозиумах "Kinetic in Analytical Chemistry" (Москва, 1995), Chromatography and spectroscopy in Environmental analysis and toxicology" (Санкт-Петербург, 1996), "Neurochemistry and Pharmacology of Drug Addiction and Alcoholism" (Санкт-Петербург, 1996), Всероссийских конференциях "Экоаналитнка-9б" (Краснодар, 1996), "Мутагены н канцерогены окружающей среды. Проблемы антимутагенеза" (Казань, 1996), Казанском и Московском семинарах по аналитической химик (199), 1993), научном семинаре ЦХЛС-ВНИХФИ (Москва, 1990), научных семинарах кафедры аналитической химии МГУ им. М.В.Ломоносова (1992, 1996), научном семинаре КГТУ (1992), іггоговьіх конференциях КГТУ (1982-і 996).
Личный вл'лад автора в разработку проблемы выразился в обосновании и постановке исследований, разработке методик эксперимента и руководстве его проведением.
s>u;nvi4i4ii'.n экспериментальных исследований и систематизации полученных данных.
Осі:*>.чні»ііг выводы и положения диссертации сформулированы автором.
.-і
ІІ.м'.інкіїціш. Основное содержание-диссертации изложено в 115 работах в виде екпей. ієїнсоп доклад ов, ачіореміх свидетельств и патентов РФ, Рекомендуемых Справочных Данных ГССД, методических указаний
С грую ура и ooi.es! лиесеришми Диссертационная работа состоит из введения, 5 г.".:;к. заключении, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена нп 239 страницах манннюппено: о текста, сотерлит 60 рисунков. 34 таблицы и библиографию 419 наименований В приложен;;» >; диссертации представлены акти использования методик аналитических определении амяноес.динений
П^рла- гля»я посвящена обзору работ по использованию приема дсршіапізаннн анализе как- ?ффемивноі u С7.с~~Ь?. улучшения, их. гна.-чгн'ческих свойств при чх определениях хроматографическимя, оптическими и гест-ме^олями, и лри:о'гц">-чч*ткиии<шоь: адзд.г?" сформулированы основные задачи исследования.
Главы со второй по пятую посвящены изложению и обсуждению полученных результатов. Во второй главе обсужден экспериментальный материал по изучению реакций хлор-динитрозамещенных бензофуразана и бензофуроксана с гидразином и его замещенными, гндразидами кислот, алкил-, арил- и гетероароматическнми аминами. Обсуждению влияние растворителя и компонентов среды на аналитические свойства бензофуразановых и бензо-фуроксановых производных аминосоединений посвящена глава-3. В 4 главе рассмотрена реакционная способность хлординитробензофуразанов и их N-оксидов, обсуждено влияние растворителя и компонентов реакакши пГі среды на кинетику реакций деривахшацик в рав-ні іссньїх условиях и н системе проте :о-имжекшшн.чого анализа. Нозмо/кности применения реакций дернватизации аналнтои для повышения чузсівительпости и избирательности определений в с.чектрсфотометрическом, хроматографнческом, проточно-инжекционмом анализе, а также и тест-методах рассмотрены в главе 5. Здесь же обсуждены приложения этих реакций для изучения генетически детерминированных процессов биотрасформаци.. лекарственных ьещесгв.
РЕАКЦИИ ДИНИТРОЗАМЕЩЕННЫХ БЕНЗОФУРАЗАНА И ИХ N-ОКСИДОВ С ЛМИМОСОЕДІШЕНИЯМИ
В рамках исследования впервые изучены а качестве реагентов дня дернватоташш аминосоединений различных классов (алкил-, арнл- и гетере троматические амины, гидразин и его замешенные, гидразнды кислот, аминокислоты) при их спектрофотометрических, хроматографических и проточно-инжекшюнньгх определениях 4-хлор-5,7-
динитробензофуразан (БФЗ) "* , 7-хлор-4,б-динитробензофуроксан
(БфО) , а также их структурные аналоги 5-хлор-
Реакции гидразина а его замещенных. Взаимодействие гидразина и его солей с БФЗ и БФО приводит к образованию окрашенных бне-производных с двумя кислотными NH-группами, однако при условии избытка нуклеофпла возможно образование монозамещенного продукта реакции.
NjK| * 2 І ІЯ —Г* гМ~Л /-NH-Nt+4 /-NCj
Из-за стадийности взаимодействия аналитическая реакция протекает во времени (за 15-20 мин). Бензофуразановое произаодное підразшіг имеет высокую интенсивность поглощения (3,9.104 л/моль.см). Бепзофуроксаноаые производные пщразиаа и его замещенных оказались неустойчивым!!. По-видимому, это связано с повышенными окислительными свойствами гетероциклического фрагмента реагента из-за наличия в нем N-оксндного атома кислорода, которые приводят к внутримолекулярным редокс превращениям производных нуклеофшюв, в свою очередь обладающих восстановительными свойствами.
В определенных условиях для бепзофуразанового производного гидразина в растворах наблюдаются радикальные изменения его спектральных свойств, не связанные с процессами распада растворенного вещества (рис.1). Они выражаются в уменьшении интенсивности* полосы поглощения с Хт=63б им, имеющей аналитическое значение, и появлении новой полосы поглощения с Х„= 520 нм по мере уменьшения концентрации растворенного вещества в полярных средах (ДМСО, спирты, дибутилфталат и др.) или при постоянном содержании производного в неводних растворителях по мере увеличения концентрации в них таких соединении различной природы, как вода, алииламины, уксусная кислота и др. Результаты хроматографнческого. электрохимического, масс-спектрального
исследования вещества показывают, что они связаны с процессом установления равновесия
между двумя формами существования вещес~ва и носят полностью' обратимый характер. Э..> находи г подгверждение при изучении спектральных свойств производного гидразина в ходе проведенії» циклов разбавление. концентрирование, а также при исследовании влияния содержания малополярных компонентов в бинарных срезах (кривые 4 и 5), Повышение доли СИСЬ в растворах производного ДМСО ведет к полному восстановлению спектральных характеристик растворенного вещества. Аналогичные зависимости фпкеприогся в других бинарных смесях растворителей, содерлоцднх малополярные компонешы. Повышение кислотности среды также способствует сохранению свойегв д'ні.чповолноноіі полосы поглощения, причем характер изменения спектров поглощения для соединения при этом противоположен по вызываемому эффекту влиянию рН на электронные сіїскгри upon (водных ..ервичных ариламинок СЇКС\' является единственным растворителем с относительно высокими полярными свойствами, а котором спектральные "«ним во йссм пнгерз.зле содержаний растворенного веществ?
О-
Рис. 1. Спектры поглощения 4,4'-гшіразобис-5,7-динитробеіізофуразана в ДМСО (1-3) и смеси ДМСО - СИСЬ (4,5)-при концентрациях (моль/л): 1 - 2,7.10'*; 2 -2,7.10^3-2,7.10^4,5-5,3.10-. Состав смеси ДМСО-СНСЬ (объемн.): 4 - 64:36; 5 - 40:60; 1 = 0,2-1 см
60О
7со
Л, ЧУ:
В то же время в присутствии веществ с выраженными электроноакцепторними свойствами (пикриновая кислота, БФЗ, пшроксипроизводное БФЗ) происходит необратимое смешение спектральных характеристик производного гидразина в сторону образования аналитической формы с л,„= 636 им независимо от состава растворителя и компонентов среды Влияние этих соединений противоположно по вызываемому эффекту роли веществ с элсктронодокорнымк свойствами (алкидашшы, гидразин к др.). Эти результаты указывают на проявление, наряду с протолитическимн; донорно-акцепторных взаимодействий и растворах
Кроме изменения значений молярных коэффициентов поглощения аналитических форм производного гидразина по мере повышения концентрации происходит изменение дтольного момента растворенного вещества, а также его электрохимических свойств (рис.2, кривые 1 и 2). Фурье-ИК спектры производного в ДМСО и его смеси с тетрахлоридом углерода характеризуются сильными изменениями соотношений ннтенсивиостей поглощения Vis7u/vis4u см'1 (валентные ассимметрипные колебания МОг-
группы) и vuj.vVia» (колебания -C=C-C=N- группы) по мере изменения содержания растворенного вещества или малополярной среды н бинарной смеси растворителей. При это-- соотношение интенсивностей для Уи^імо возрастает при уменьшении концентрации и падает при увеличении доли СО* в смеси. Для отношения интенсивностей Vi^n/viaM аналогичные зависимости имеют противоположную направленность.
1'ис.2. Зависимость дипольного момента
(ц,отн.ед.,1), приведенного предельного
тока (і/с.10'!, мкА.л/моль, Е, 2=-1.72 В, 2),
молярных коэффициентов поглощения
при Х=520 (3) и 635 им (4) в ДМСО от
концентрации 4,4'-гидразобие-5,7-
{fCr*j/asoE?3
динитробензофуразана.
Экспериментальные данные указывают на существование в растворах производного гидразина подвижного равновесия между двумя формами вещества. По-видимому, роль компонентов среды для рассматриваемого равновесия заключается во влиянии на степень сопряжения в молекуле бис-производного за счет изменения электронной проводимости межъядерных аминогрупп, которая определяется рл-рл-отталкиванием НЭП атомов азота.
Свойство бис-производного пиразина сохранять неизменными свои спектральные характеристики (^„=636 им) в присутствии избытка реагента или его шдролизованной формы использовано для избирательных и чувствительных определений аналита со спектрофотометрическнм детектированием в различных методах анализа.
Рассматриваемый пример влияния состава реакционной среды на свойства соединения является частным случаем проявления роли сольватационных эффектов на аналитические характеристики бензофуроксановых (бензофуразановых ) производных амнносоединешш. Этот фактор определил необходимость систематического изучения роли среды для производных амнносоединешш различных классов.
Для замещенных гидразина (фенилгндразнн, ^Н-дифеншіпідразіш и др.), гидразидов кислот образование бне-производных не фиксируется и подобные спектральные равновесия не наблюдаются. В отличие от гидразина, взаимодействие БФЗ с ними приводит к образованию окрашенных производных практически при сливании растворов реагирующих веществ. Предпочтительными средами для проведения реакций дериватизацнн являются спирты и их водные смеси. В отдельных случаях, например при дериватизацнн гидразндов нзоникстииовой н других кислот, из-за ограниченной растворимости производных в водно-спиртовых средах использованы водно-диметилсульфоксидные смеси. Образование окрашенных производных, пригодных для проведения <* избирательных спектрофотометрическнх определений, протекает при взаимодействии БФЗ с
семикарбазндом, фенилгндратонами. Продукты аналитических реакций характеризуются высокой интенсивностью поглощения в области 510-550 им, коэффициенты молярного поношения достигают 2,7. !04 л/моль см. Это является предпосылкой чувствнтелі?юго деіектироваїшя анализов в пило их производных.
Усыновлено, чао реакции образование производных протекают лаже в сияьнокислих средах Оптимальные условия проведения определении реализуются при рН 5,5-7,2.
Реакции с ЯЛКМЛ-, арпллмннами с различной степенью замещения аминогруппы.
Реакции лериватизаиии, приводящие к введению поляризующих заместителей и карбоциклнческое колыю реагента с сильно выраженным хшюпдным характером, могуі приводить к изменению поляризации молекулярного диполя, влияя тем самым как на положение полос поглощения, так ч их интенсивность. Это проявляется в электронных спектрах производных соединений с первичными, вторичными и третичными нуклеофильиыми аминогруппами (рисЗ).
Рис 3 Спектры поглощения 5,7-длнитробензофуразановых (1-3,5-8) и 4,6-дшштробензофуроксановых (4) производных: I - метиламина; 2 - а-амино-р-индолилпропановой кислоты (триптофан); 3,4 - анилина; 5 - индола; 6 - N,N,-диметиланиліша; 7 - 2,3-диметнлиндола; 8 - 2,2,4-трішетил-І,2-дигидрохшкшша, 8 -4-хлор5,7-динитробензофуразан, 9 - 7-хлор~.,6-динитробензофуроксан в ацетонитриле, L= 1 см.
Для производных как ал кил-, так и арияамииов характерна зависимость максимумов полос поглощения от степени замещения аминогруппы.Для производных анилина и N,N-днметиланилина величина Д>.,„ лостигает 180 нм. При наличии в аминосоелиненин электронодонор.ных заместителей для производных характерен батохромний сдвиг ^, в то время как электроноакцепторные заместители приводят, как это видно на примере индола и
его замещенных, к гнпсохромному сдвигу Хм. Аналогичные зависимости наблюдаются и для непредельных алифатических аминосоедннеиий.
Образующиеся в результате реакции производные имеют высокую интенсивность полос поглощения (значения є для большинства из них составляют 1,7 - 3,9.104 л/моль.см). Это позволяет проводить чувствительные определения веществ. Характерная для производных соединений с различной степенью замещения аминогруппы зависимость спектральных свойств (спектральная селективность) положена в основу избирательного детектирования аналитов спектрофотометрипеским методом н в системе ПИЛ.
Несмотря на высокую контрастность спектров поглощения бензофуразаиовых производных первичных алкил- и ариламинов, определения этих веществ осложнены наложением полосы поглощения гидроксипронзводного реагента. В связи с этим для дериватизацин соединений с первичной аминогруппой предпочтительнее использование БФО (кривые 3 и 4).
Длинноволновые полосы поглощения производных имеют сложную природу. Так, для 4-(4'-шітроаішлішо)-5,7-дішіітробензофуразана после Гауссового разложения длинноволновой полосы обнаруживается 5 индивидуальных полос, которые можно отнести к о- и п-составляющпм внутримолекулярного переноса заряда от донора к акцептору. Это определяет сложный характер влияния природы растворителя на аналитические свойства изученных производных
Результаты исследования производных свыше 60 первичных аминосоедннеиий (элементный анализ, ИК- и масс-спектрометрия, потенцнометрия, кондуктометрия) указывают на то, что они являются продуктами взаимодействия со связью углерод-азот. Электроноакцепторные нитро- м фуразановые (фуроксановые) группы определяют высокую NH-кислотность производных. Гидролязованпые формы реагентов проявляют ОН-кислотиость. Для изученных соединений наблюдается зависимость кислотности производных от положения акцепторных заместителей в реагенте и поляризующего действия заместителей в нуклеофиле. Так, зависимость рК, от о-констант заместителей в арнламине для 4-(Я-феннлам1шо)-5,7-динитробешофуразанов записывается как
рК. = 2,64а -і- 5,48 (г = 0,982, п-13) вДМФА и
рк\ = 2,4ба -» 1,3 (г « 0,987, п= 13) в ДМСО. Более высокие значения констант реакции р по сравнению с замещенными фенолов (р = 2,01), бензойных кислот (р =1,00) свидетельствуют о сильном изменении электронной плотности в реакционном центре (межьядерном атоме азота) при диссоциации соединений. Это определяет повышенную чувствительность аналитических свойств растворенных веществ к природе растворителя.
На примере реакций БФЗ и БФО с индолом и его замещенными (триптофан, 2,3-диметшншдол ,и др.) показано, что взаимодейсгвне соединений со вторичными аминогруппами приводит к образованию продуктов со связью углерод-азот. При взаимодействии БФЗ с триптофаном, имеющем первичную аминокислотную и вторичную аминогруппы, образуется продукт со связью углерод-азот с участием аминогруппы гетероциклического кольца нуклеофила. Это, по-видимому, связано с цвиттер-нонной природой реагирующего соединения, которая приводит к уменьшению нуклеофнльных 'войств первичной аминогруппы.
Реакции ТіФ'і и БФО с ариламинами, содержащими третичные аминогруппы, в случае обраіонания продуктов со связью углерод-азот должны приводить к появлению четвертичных аммониевых солей. На примере М.М-диметиланилина показано, что эти продукт 1.1 реакции не являются солями (не содєржаї хлорид-ионы). Их состав отвечает лро-idiw.imwy со связью уыерод-углерод. '>гат результат согласуется с литературными ланными об амбидентных свойствах аминосоединешш в реакциях с соединениями с высокой ыск'фофнлыюстыо, которые вызывают образование устойчивых производных со спя )ыо углерод-углерод.
Установлено, что оптимальными условиями при проведении реакций дериватнз-тции аминосоединенпй являются слабокислые и нейтральные среды (рН 5,5 - 7,4).
ВЛИЯНИЕ ПРИРОДЫ РАСТВОРИТЕЛЯ И КОМПОНЕНТОВ СРЕДЫ ИЛ АНАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕГООФУРАЗАНОВЫХ И БЕНЗОФУРОКСАНОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ
В отличие от производных аммиака, алкиламинов, для которых характерно незначительное влияние природы используемого растворителя на аналитические свойства (?.т, б) растворенного вещества, в случае дннитробензофуразановых и дпннтробензофуроксановых производных ароматических аминов наблюдаете* разнообразное проявление роли растворителя на детектируемый аналитический сигнал. Так, при постоянных концентрациях для производных ариламинов фиксируется характерная зависимость положения максимумов длинноволновых полос поглощения от основности ((З) используемого апротонного растворителя. Величина ДХ в ряду бензол - ДМСО достигает 60 нм В то же время в амфипротонпых срелах (спирты, вода, смешанные растворители) эта зависимость практически исчезает, значения /^, и s производных в этих средах меняются незначительно. Эти данные указывают на сольватацию растворенных веществ, проявляющих NH-кііслотиость , с участием кислотных аминогрупп. В протонных средах наряду с этим процессом происходит сольватация с участием ацн-форм нитрогрупп карбоциклнческого кольца. Антибатный характер влияния указанных процессов на спектральные свойства приводит к постоянству аналитических свойств производных и амфипротонпых средах. В свою очередь для гидрокенпроизводных бензофуразанов (гндролизованных форм реагентов) при постоянной концентрации ионогена наблюдается удовлетворительная корреляция Х«, (vm) с сольватохромным параметром полярности (поляризуемости) среды я*. Для полосы поглощения Шд"л 4-гидрокси-5,7-динитробензофуразана, например, уравнение регрессии записывается ksk'v„» 27033 - 4534Я* (Г » 0,989) и введение и корреляцию параметра () при многофакторном корреляционном анализе не приводит к улучшение значения г. Это свидетельствует о сохранении внутримолекулярной водородной связи в соединении в средах разного состава. Отличия в поведении ОН- и NH-производных, очевиді , обусловлены более высокой электроотрицательностыо атома кислорода в реакциогтом центре для первых.
На потенциальное влияние растворителя на аналитический сигнал указывают и зависимости Стоксовских радиусов (г,) анионов соответствующих производных, а также
значений la K„w от обратной величины диэлектрической проницаемости (1/е) используемых растворителей. Для первых из них характерна чрезвычайно высокая чувствительность г," к природе растворителя по сравнению с несольоатирусмымн или малосольватнруемыми нонами. Для зависимостей lg К,а - І/є; в свою очередь, наблюдаются многочисленные отклонения от линейности, свидетельствующие о проявлении аффектов специфической сольватации изученных производных^
Для производных первичных ариламиноо и гидролизоваииых форм реагентов непостоянство спектральных свойств по мере изменения их концентрации в протонных и апротонных средах связано с проявлением равновесных процессов ионизации растворенного вещества и последовательного разъединения ионных пар до сольватированных ионов
(НХ). о (Н*Х"). о (НІІХ), <=> Н\ + XV - В таких растворителях, как галогенуглеводороды, алканы, в интервале содержаний 10"! - 10'2 моль/л наблюдается постоянство значений экстинции для растворенного вещества (рис. 4, А). Указанны- растворители из-за отсутствия донорных 'войств (ДЬІ) не способны ионизировать растворенное соединение и око находится в растворе в молекулярной форме. Такие же спектральные характеристики ионогенов наблюдаются в шпрометане, имеющем достаточно высокое значение диэлектрической проницаемости (є), но не обладающем донорными свойствами. Батохромний сдвиг полосы поглощения при введении в раствор алкиламина связан с образованием ионных пар (кривая 9).
Рнс.4. Спектры поглощения 4-гидроксн-5,7-дишгтробензофураэзна (1-5,8,9) и его калиевой соли (6,7) в хлороформе (А), 1,4-диоксане (Б), смеси 1,4-диоксан-вода (82:18, объемных, Б; кривая 8), метаноле (В) и ацетонитрнле (Г) при концентрациях (моль/л): 1 - Ю'5; 2 - 2,4.10'5; 3 - 10"4; 4 -10*э; 5 - 10"2; б - 10"*; 7 - I0"J в присутствии дибснзо-18-краун-6; 8 - 10"2; 9 - 10'3 в присутствии тригсксиламина.
В свою очередь в 1,4-диоксане (рие.4. Б), обладающем' достаточно высокими донорнь ми свойствами, наблюдается концентрационная зависимость спектров поглощения, связанная с равновесием между молекулярной формой ионогена и ионными парами. Однако из-за низкого значения є растворителя диссоциация ионных пар не прс&сходит. В водно-
лноксаиовоії смеси наблюдается батохромное смещение полосы поглощения ионогена и в растворе фиксируйся наличие ионов.
П метаноле, имеющем меньшее, чем у нитрометана, значение а при высоком'ДМ, наблюдается ионизация растворенного вещества и последующая диссоциация ионных пар на сольватироканные номы Процесс диссоиі:ацин, однако, происходит неполностью и в растворе наблюдается равновесие между различными формами существования вещества." Постоянстьо спектров поглощения ионогена и его калиевой соли, а также раствора соли в присутствии краун-эфира (кривые б и 7) во всем интервале их содержаний указывает па тождественность спекірадьньїх характеристик ионных пар к сольватнрованного нона.
В аиетоширпле при более высоком, чем у ыетааола значении к, но менее выраженных дшюрнич свойствах снова наблюдаются концентрационные зависимое?» спектров поглощения, свидетельству-інше о проявлении равновесных процессов ионизации попитана и дмесоииации ионных пар. Об этом же свидетельствуют результаты расчета ранга матриц свеїоііоілощститг гичрокся- и амннопронзводных беизофуразанов (тзбл.1). Ранг матрицы соответствует числу гнгтач поглощающн?; тзетни и укашзпет нч равновесное сушестиованне молекулярной формы ионогена, ионных пар и содьгатироьаиии.х попов я растворе. Спектральные равновесия, наблюдаемые для изученных веществ, определяются, таким образом, совокупностью ионизирующих (ДЫ) и диссоциирующих (с) свойств растворителя.
Таблица 1 Число поглощающих компонентов в растворах ОН- и NH-кислот по результатам расчета ранга матрицы светопоглощения
Подобные равновесия в растворах зафиксированы для аминопроизводных шгтропиридпнов, фураздкогшридинов и фуроксанопиркдиков, изученных в качестве потенциальных реагентов для дериватнзации аминосоединений. Следует отметить, что эти
ионные равновесия носят полностью обратимый характер, что подтверждается проведением циклов разбавление - концентрирование ионогенов.
Для ряда соединении на основании спектрофотометрііческнх и электрохимических измерений (кондуктометрію, потенцномстрия) определены значения кажущихся консгант равновесий ионизации И диссоциации. Результаты расчета показывают, что величины кажущихся констант диссоциации, определенных из спектрофогомстрпчсскнх и кондуктол.етричесхих измерений, различаются на несколько порядком при более ншкнх численных значениях для последних. Это связано с тем, что спектрофогометрическнй меюд, не различая свободные ионы и ионные пары, фиксирует их сумму, в то время как в кондуктомстрнн детектируются только свободные ионы. Результаты определения К.цш, рассчитанных безиндикаториым методом и с использованием индикаторного способа но Кольтгофу, коррелируют в соответствии с уравнением
№„» = -0,58 + 0,35lgK1M,,",M (г = 0,985), указывая иа одинаковую природу описываемых равновесий. В целом численные значення Киои н Кд«. характеризуя степень протекания равновесных ппоцессов, определяются N11-(ОН)-кислотностью соединений, величинам!! и ДЫ использованных растворителей. Так, значения Киои ДЛЯ 4-гндроксн-5,7-дтштробензофуразаиа) 2,4,6-трннитрофснола, 4,6-дигндроксн-7-иитробензофуразана и 5-аніілиііо-4,б-дішнтробензофуразаиа в метаноле равны, соответственно, 7,6; 2,1; 1,9 и 0,42.
Наблюдаемые равновесия вследствие влияния иа спектральные характеристики веществ могут вызывать ошибки при снектрофотометрнческнх определениях амннососдииений в неводных средах, а также проявляются в виде артефактов в нормально-фазном (НФ) варианте ВЭЖХ. Последние фиксируются в виде двух хроматографнческих пиков при элюнровашш химически чистых производных типичными для НФ-ВЭЖХ системами элюентов. Так, для 4-гидроксн-5,7-дшштробешофуразана при элюнровашш смесью CHjCIj - МеОИ переменного состава наблюдается линейная зависимость интенсивности пика, соответствующего нонам (V, - 650 мкл), от содержания полярного компонента в злюенте. В свою очередь концентрационный профиль, соответствующий ионным парам (Vr = 550 мкл), антнбатен по интенсивности содержанию метанола. В чистом метиленхлориде фиксируется только один пик (V, = 20S0 мкл), соответствующий, по-видимому, молекулярной форме ионогена. Отнесение хроматографнческих пиков проведено с использованием калиевых солен ионогенов, к которых» для смещения равновесных процессов добавляли макроциклические лиганды. Указанные равновесные процессы устанавливаются достаточно медленно и соотношение различных форм ионогена в значительной степени определяется природой используемых для приготовления рабочих растворов растворителей. В обращенно-фазном (ОФ) варианте ВЭЖХ, в котором используются растворители с высокой ионизирующей и днесощшрующей способностью, такие равновесные процессы не влияют на параметры элюаровання производных и результаты их спектрофотометрического детектирования.
Элсктргчюакценторный характер гетероциклических фрагментов используемых для дериватпзацпн реагентов, высокая поляризуемость связи C=N- приводит в ряде случаев к неожиданным эффектам при аналитических определениях амниосоединений в виде их производных в матрицах сложного состава. Например, при определениях ряда
лекарственных пешеств и депротеишпнрованных биосубстратах человека (моча, крий-, эикудит, слюна) п виде 5,7-дшштробепзофуразановых производных при физиологических уровнях значений рН в спектрах поглощения фиксируется чрезвычайно интенсклюе поглощение в области 400-700 км и спектрофо"-ометрические определения становятся невозможными. В то же время специальные исследования показали, что потенциально иніерферируюіцне компоненты этих биосубстратов (мочевина, мочевая кислота, креатин, креатиннн, уробилин и др.) не образуют производных с реагентом, поглощающих в указанной области спектра, либо их содержание в анализируемой матрице столь мало, что они не могут быть ответственными за столь интенсивное поглощение раствора. При изменении пробоподготовки анализируемых сред, которое заключается в предварительном подкисленпи раствора трихлоруксусной кислотой, после чего проводится реакция дериватизации определяемых веществ и рН субстрата возвращается до исходного, физиологического значения, приводит к полному исчезновению мешающего влияния биогенных компонентов образца при спектрофотометрнческом определении. Наблюдаемые спектральные зависимости, по-видимому, связаны с эффектом коопераційних взаимодействий биогенных компонентов биосубстрата с реагентом, который устраняется в кистой среде за счет солеобразования гетероциклических азотистых оснований. В ОФ-ВЭЖХ проявление указанного эффекта, напротив, оказалось удобным при проведении рутинных определений лекарственных веществ и их метаболитов а биосубстратах, поскольку при этом происходит упрощение хроматограмм. В то же время дериватизаши аналитов бензофуразанами позволяет повысить пределы их обнаружения по сравнению с детектированием по «бензольной» полосе.
В целом результаты изучения влияния природы используемых растворителей, компонентов анализируемых сред на іетектируемьій сигнал указывают на определяющую роль этого фактора при повышении избирательности и чувствительности определений аминосоединений.
РЕАКЦИОННАЯ СПОСОБНОСТЬ ДИНИТРОЗАГ^ЕЩЕННЫХ БЕНЗОФУР АЗАНА И ИХ N-ОКСИДОВ
Для выработки критериев выбора реагентов при определениях аминосоединений различных классов и оптимизации условий их проведения изучена кинетика реакций 4-хлор-5,7-динитробензофуразана и 7-хлор-4,6-днннтробензофуроксана с рядом ароматических, гетероароматических аминов, пиразином а водой.
Результаты кинетических исследований свидетельствуют о высокой реакционной способности БФО и БФЗ. Так, константы скорости реакции тих злектрофилов с анилином в бензоле равны, соответственно, 138 и 39,3 л/моль см, превосходя аналогичные значения констает скорости для 2,4,6-тринитрохлорбенэолаи 2.6-динитрохлорбензола на три и пять порядков. БФО за счет влияния М-о;хидного кислорода имеет более высокую реакционную способность по сравнению с БФЗ в реакциях с веществами, имеющими первичные и вторичные аминогруппы Однако в реакциях с соединениями, содержащими заместители и положения 2 к аминогруппе (например, 2,2,4-триметнл-І,2-дигилрохнно,іиноч) или с такими ариламннами, как дифеннл- и трифениламнн, происходит обращение реакционной
способности БФО относительно БФЗ. Этот эффект, по-видимому, обусловлен стернческнми затруднениями из-за влияния N-оксидіюго кислорода гетероциклического кольца м использован для избирательных аналитических определении компонентов смесей, содержащих соединения с различной степенью замещения аминогруппы.
Влияние м- и п-заместителей в ароматическом кольце иуклеофнла {-Н, -СНэ, -ОН, -Br, -CI, -NOz) на константы скорости взаимодействия с БФЗ и БФО описывается корреляционными уравнениями с использованием обычных с-констант
k = (1,78 ± 0.09) - {3,4 ± 0,3) о, (п = 8, г = 0,985. БФЗ) и
к = {2.38 і 0,07) - {3.3 ± О.З) Ox (n = S, г = 0,984, БФО).
Величины констант реакции {р) для БФО и БФЗ, как видно, значительно ниже аналогичных значении р для реакций первичных » вторичных арнламшюв с бензоил-, лихриягзяэгешшами, гало>ід-2,б-динитробсшолзми (4-5 «д.), что свидетельствует об изменение чувствительности к влиянию заместителей в ядре иуклеофнла по мерс возрастания электрофильиостп реагентов.
В ислом результаты изучения кнютики реакций БФО н БФЗ с аминососдинатимй указывают иа возможность дсриватнзашш даже таких малоосновных нуклеофипов, как трнфениламнн, а также служат предпосылкой для использования приема кинетически «дискриминированных» реакций дериватизации в соответствия с основностью определяемых веществ к за счет вариации электрофильиыми свойствами используемых peareirroe.
Учитывая высокую реакционную способность, проявляемую БФО и БФЗ при взаимодействии с амннососдинениями, была также шучепа их устойчивость к потеициалыюму воздействию химических процессов, являющихся конкурентными по отношению к основной реакции (гидролитические и редокс превращения). Оказалось, что в спиртах, ДМСО, ДМФА и других полярных неводных растворителях даже после их обезвоживания реагенты быстро претерпевают підролітічсские превращения с образованием пщроксипрошводных за счет взаимодействия с остаточными количествами воды. Так, константа скорости псевдопервого порядка гидролиза БФЗ в метанол-водной смеси {9В:2, объемных) составляет 3,7.10 мин"' в полная инактивация реагента происходит за 1 час. Аналогичные результаты получены для N-оксидов бензофуразана. В то же время реакции гидролитического превращения бензофуразанов и бешофуроксанав в вцетожггрил-водных смесях протекают не до конца и устанавливается равновесное соотношение гндролизованной и иепщролизованной форм реагента. При этом гидролитический процесс в данной систем» растворителей носит аномальный характер, поскольку константы скорости псевдопервого порядка (7.10"4 мкн' для смеси CHjCN:H20 для соотношений их объемов от 98:2 до 99,8:0,2) не зависят от содержания иуклеофнла в реакционной среде. Подобное поведение реагентов, по-видимому, связано с процессами избирательной сольватации компонентов реакционной смеси микрогетсрогенными фазами различной природы, которая характерна для смесей ацетошггрил-вода согласно литературным данным. Это свойство ацетошггрила позволило оптимизировать процедуры приготовления, хранения рабочих растворов реакционноспособных реагентов при их использовании для определений в спектрофотомстрическом, хроматографическом и проточно-янжекцконпом методах. В ходе
аналитических определений аминосоеданений; в, їмиизшшх..средах конкурентные реакции гидролитических превращений реагентов практически не влияли на степень завершения основної! реактш за счет оптимизации условий; их проведения, а также использования рл>личий в нуклеофильнмх свойствах аналитва а растворителя.
Компоненты реакционмьл сред, обладающих редокс свойствами, могуг также приводить к инлктипашш свойств, реагентов. Так, при определениях соединений я смесях, содержащих компоненты с восстановительными свойствами, оказалось необходимым проведение предвари реакций лсриваїитацки для устранен!)* мешающего влияния последних. Выбор резгенток для определений амшгосоединешш проводился и с учетом редокс свойств аналптов. Дяк- дернватнзациі* соединений, содержащих гидразиновые фрагменті.), можно использовать только бензоф>разан, так как соответствующие беизофуроксаповыг производные ан-шитов неустойчивы из-зп внутримолекулярных редокс превращенийу связанных с наличием;8.реагенте М-оксиішаїа кі'.слорода.
Ікшаина прироям. ряешоралещ гг :.v>vn/mt»»tou. реакшгенгияй ереаїл на реакционную, способность. Природа растворителяк влияя на скорость, аналитических реакций, играет, очень важную роль при- достижении, избирательности н чувствительности определений' аминосоедннений а- смесях сложного, состава как в равновесных, так и в неравновесных условиях, в. системе ПИЛ, При этом характер влияния свойств растворителя на реакционную, способность, использованных реагентов оказался, отличным от влияния среды на спектральные свойства, производных . Определяющий характер на скорость аналитических реакций вносят полярность » основносте среды, оцениваемые эмпирическими,сольватохромнымм параметрами E,N п ($, соответственно. Тазе, при изучении кинетики взаимодействия ВФЧ с пшрззигом установлено, что образование бис-проіізводного происходит стадийно, включая быстрое образование мотготамщеянога производного, которое затем во времени реагирует с БФЗ с образованием бне-продукта. Изучение влияния состава реакционной среды на скорость этой реакции в CHjCN, спиртах (МеОН, ElOH, 2-НгОН), а также в их водных смесях показало, что наиболее высокие численные значения констант скорости псевдопервого порядка (kj) фиксируются в этанол-водных средах (8,1,10' 2 мин'1). При этом величини kj в данной смеси практически не зависят от соотношения содержаний растворителей в смеси, а » 2-РгОН возрастают от 3,9.10'' до 9,1.Iff* мин'1 при переходе от безводного растворителя к смеси 2-PrOH-UjO (80:20). D .МеОН и его водных смесях также сохраняется постоянство значений kt независимо от их состава (5.8.IO'2 мин*1), в то время как в CHjCN величины констант скорости возрастают от 0.37.10'2 мин"1 (безводный растворитель) до 1Д.1СГ* мин"' для сиесн CHjCN-HjO (5:95).
Значения констант скорости реакции БФЗ с гидразином, полученные в равновесных условиях, хорошо согласуются с интенсивностью сигнала при ПИЛ определениях гидразина в виде 5,7-динитробсшофуразанового производного с использованием в качестве потока носителя Н20, MeOH,EtOH,2-PrOH,C7 ljCN, ДМСО н их водных шесей (рис. 5 ).
іИ, мм
ио МАХ
Рис.5. Влияния содержания воды (%) в бинарной смеси потока носителя на интенсивность сигнала при проточно* !шжекцно!шых определениях гидранта (6.10'6 моль/л) в растворителях: 1 - этанол; 2 - пропанол-2; 3 - метанол; 4 -ацетонитрил; 5 - ДМСО.
В условиях неравновесных химической реакции и гидродинамических процессов в реакционной спирали интенсивность сигнала (Н) представляет собой степень завершення аналитической реакции, выступая как кинетическая характеристика процесса. Как видно, несмотря на различия в физических свойствах используемых растворителей, лучшие условия детектирования аналнта реализуются в смеси HjO-ЕЮН и дальнейшее изменение Н согласуется с основностью используемых сред. В более полярных с точки зрею» диэлектрических свойств и дипольного момента растворителях (Н20, CH3CN, ДМСО) наблюдается более низкая интенсивность сигнала. Аналогичный характер влияния состава потока носителя ііа значення Н фиксируется при ПИА определения замешенных гидразина (1,1-диметилгндразшіа н др.), гетероциклических аминов (2,2,4-трішетнл-1,2-дигидрохннояіш н др.). Особенно наглядно роль свойств растворителя иа реакционную способность реагентов в условиях неравновесной химической реакции проявляется при сопоставлении значений Н в средах разного состава для различающихся по основным свойствам аналитов. Так, при ПИА определениях анилина интенсивность сигнала возрастает в ряду CH3CN < МеОН < EtOH < РгОН-2 в соответствии с изменениями основности (Р) этих растворителей. Напротив, для более кислого м-нйтроаннлина порядок изменения значений Н соответствует возрастанию полярности растворителя E-N в ряду CHjCN < РгОН-2 < ЕЮН < МеОН. Для гидразндов ароматических кислот, отличающихся пониженной основностью по сравнению с гидразином и его замешенными, предпочтительными с точки зрения интенсивности регистрируемого сигнала оказались более Полярные смеси ДМСО -НгО. Совокупность этих экспериментальных данных можно трактовать с учетом механизма активированного ароматического нуклеофильного замещения как возможность того, что при взаимодействии реагентов с основными ашшосоедшіеннями скоростьопределяюшей стадией аналитической реакции является распад анионного а-комплехса и элиминирование уходящей группы (НС1), который облегчается в основных средах за счет проявления основного катализа растворителем, В свою очередь, для аналитов с пониженной основностью скоростьопределяющей стадией реакции может служить обратимое образование промежуточного полярного о-комплекса, стабилизируемого полярными свойствами реакционной среды. Экспериментальные данные, кроме того, определяют критерии выбора состава реакционной среды как в равновесных, так и в неравновесных условиях для повышения избирательности за счет создания эффекта кинетически
«дискриминированных» реакций дернватнзащш, а также чувствительности аналитических" определений.
Результаты игучення влияния среды на скорость взаимодействия амнносоеднненнй разлпчіїоіі природы с реаге; гамн в неравновесных условиях кроме того, указывают на меньшую значимость гидродинамических процессов по сравнению с фактором, связанным с химической реакцией, положенной в основу детектнроваїшя аналитического сигнала.
Свое влияние на реакционную способность используемых геагентоп могут оказывать нте компоненты реакционной среды, которые сопутстауют аналіггу в анализируемых образцах. Так, при П! 1А определениях гидразина в присутствии соединений основного характера (алкиламннм, аммиак, 1.1-диметилгидразии) наблюдается резкое возрастание (в 4-5 раз) интенсивности детектируемого сигнала. При высоких содержаниях аминов в потоке носителя происходит уже уменьшение : .ітенснвностн регистрируемого сигнала за счет влияния конкурентной реакции интерферирующего компонента с реагентом. Только в случае (СНз)зИ и других третичных алклламинов, не образующих с реагентом производных, после первоначального возрастания интснешшостп сигяаля наблюдается сто постоянство вплоть до отношения содержаний амин/гидразин - 100:1. В то же время при раздельных ПИЛ определениях указанных амнносоединепий они не детектируются в тех условиях, при которых происходит регистрация сигнала производного гидразина (Х=ч>35-б40 им). Более того, при замене алки-ламннов и .-лкнлпшразинов на нх арилзамещенные аналога, имеющие пониженную основность аминогруппы (анилин, фенилгпдразнн и др.), влияние постороншгх соединений на результаты ПИА определений гидразина не наблюдается. Эти экспериментальные данные явно указывают на проявление основного катализа детектируемой аналитической реакции основными компонеіггами анализируемой смеси. Используя свойство (СНз)зК проявлять каталитический эффект на неравновесную реакцию гидразина с БФЗ в системе ПИА, удается уст ранять мешающее влияние алкішамннов, алкіїлгндразіпгов, аммиака. При этом одновременно достигается повышение чувствительности определений и предел обнаружения гидразина достигает 12 нг/мл. Необходимо отметить, что ускорение аналитической реакции гидразина с БФЗ в присутствии алкпламшюв происходит и в равновесных условиях. Однако при этом, как и следовало ожидать, не происходит возрастание интенсивности регистрируемого сигнала после завершення реакции.
При изучении влияния природы буферных растворов на скорость аналитических реакций оказалось, что лучшие условия для проведения дериватнзашш определяемых веществ в равновесных н неравновесных условиях при равных значениях рН обеспечивают фосфатные и боратные буферы.
ПРИМЕНЕНИЕ РЕАКЦИЙ ДЕРИВАТИЗАЦИИ ДЛЯ ВИЗУАЛЬНОГО, СПЕКТРО-
ФОТОМЕТРИЧЕСКОГО, ХРиМАТОГРАФИЧЕСКОГО И '
ПРОТОЧНО-ШСгСЕКЦИОІШОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИНОСОЕДИНГЧИЙ
Возможности регулирования избирательности чугггвительности аналитичес^сих определений связаны с нспользоваїшем спектральных характеристик образующихся в результате реакций проіпводньгх амнносоединепий различной природы; применением приема ки-
нстической «дискриминации» реакций дериватнзашш по основности аналитов; подбором растворителей и компонентов реакционной среды с определенным сочетанием их полярных и основных свойств для целенаправленного изменения свойств аналита и интенсивности детектируемого сигнала; вариацией элсктрофильныма свойствами аналитических реагентов. Сочетание этих факторов было использовано для разработки методик спектрофотометриче-ского, проточно-инжекционного, хроматографичесхого определения амниосоединеннй, а также в тест-методах. Эффективность используемого приема, предусматривающего изменение в благоприятную сторону аналитических свойств аналита, проверена на примерах определений амниосоединеннй в наиболее характерных для них объектах аналша (биосубстраты человека, лекарственные формы, промышленные продукты, производственные воды). * также в искусственных смесях, моделирующих промышленные водные и воздушные среды.
Основными преимуществами хлординитрозамещеккых бензофуразана и бензофурок-сана, которые выявлены при определениях амниосоединеннй различных классов по сравнению с традиционными реагентами (альдегиды, сульфохлориды, изоцианаты, мононнтрога-'логенбензофуразаны, диазотирующие реагенты и др.), являются возможность визуальной оценки природы определяемых веществ по характерной окраске производных; избирательность реакций дериватнзашш амниосоединеннй в присутствии органических веществ других классов; способность образовывать про.аводные малоосновяых (ди-, тркфениламин и др.) соединений; спектральная селективность производных врилашнов по сравнению с производными алкиламинов; высокая скорость реакций дериватнзашш и мягкие условна их проведения.
Реакции дерішатшаціш о спектрофотоиетрнческом аналше. Избирательность спектрофотометрнчееких определений гидразина и его замещенных, гиаразидов кислот, арил- и гетероароматнческнх аминов оказалось возможным регулировать за счет использования спектральных свойств производных, а также создания условий для протекания кинетически контролируемых реакций интерферирующих компонентов анализируемого образца с реагентом. Последнее достигается при вариации используемых растворителей и реагентов.
Примеры избирательных спектрофотомэтрических определений гидразина и гидрази-дов кислот в смесях приведены в табл. 2. Благодаря спектральным свойствам возможны определения гидразина в присутствии большого (500-кратішй и выше) избытка типичных компонентов промышленных смесей, в том числе при синтезе лекарственных веществ (ветразин, изониаэнд, фосфабензид, апрессин і др 1. Это позволяет проводить определения чистоты лекарственных веществ, а также контролировать образование токсиканта при хранении лекарственных форм как продукта распада основного вещества.
В свою очередь гндразиды кислот (лекарственны? вещества) можно определять в присутствии гидразина благодаря тому, что производное пиразина имеет незначительное поглощение в той области спектра, для которого фиксируются максимумы поглощения производных гидразидов кислот.
Избирательность слектрофотометричесхих определений замещенных гидразина в присутствии первичных ариламинов можно регулировать проведением двух последовательных реакций дериватнзашш. Так, при определении фенилпідразіша в кислой сточной воде, в которую попадают в большом количестве анилин и гидросульфит-ионы, вначале можно провести дернватизацию компонентов анализируемой смеси ароматическими альдегидами
{аші(.ч>ш4м, саллиилоъмм)- При этом устраняется мешающее олиянне гкдросульфит-иоиа и анилина. Последующая реакция дериватнзации 4-хлор-5,7-дншггробензофуразаном приводит к образованию мтетесмйЖ) окрашенного производного (X—52Q им) фснилгидразона соответствующего альдегида. Определениям фепнлгидразина при \.'Л 1 о виде такого продукта аналитической реакции не мешают более чем 1000-кратный избыток гидросульфит ного производного « 10-краттай избыток производного анилина.
Таблица 2 Результати Сгїехтрофотометрического определения гидразина и гидразидов кислот в виде 5.7-динитробензофуразановых производных в смесях fa*6. P*=0,9S, V 10 мл)
Дернватизация определяемых вещестп динитрозамещениыми бензофуразана и бензе-фуроксана позволяет пролодить раздельные спсктрофотомстрическле определения соединений, содержащих иуклеофндьиие аминогруппы с различной стеленмо замещения (тибл.З). Избирательность детектирования производных вторичных н третичных аминосоедкнепий . присутствии веществ с первичными аминогруппами основывается на различии в их спектральных характеристиках. В cdoio очередь первичные ариламины определяются л присутствии вторичных и третичных амнносоедшшшй за счет проведения кинетически контролируемого процесса дериватизащш компонентов смеси путем вариации состава среды и используемого для эт!й целей реагента. Сочетание этих приемов позволяет проводить сценку качества промышленных продуктоб сложного состава с использованием сравнительно простого аналитического метода. Спектрофотометріічесюі* определения, при анализе таких продуктов промышленного синтеза, гак антиоксидант ацетоианил, нМсгот определенное преимущество перса Хроматографическими методами (ВЭЖХ, ГІ1СХ), поскольку для по-
следних наблюдается быстрое снижение эффективности колонки за счет процессов хемо-сорбцни на ней смолообразующих компонентов матрицы.
Таблица 3 Результаты спектрофотометрического определения ароматических, гетероароматнче-
скнх аминов, аминокислот в смесях (n=5, Р=0,95)
Создание условий для кинетической «дискриминации» реакций образования производных по основности определяемых веществ дает возможность проводить, например, избирательные слекгрофотомегрические определения анилина и м-нитроанилина в присутствии избытка изомерных нитроанилинов. Различие в спектральных характеристиках бензо-фуроксановых производных аминокислот позволяет проводить прямые спектрофотометри-
чсскне определения таких гетероциклических аминокислот, как пролий и триптофан в куль-гуральныч жидкостях и процессе их регуляторного синтеза.
Па примере определения 2-амипофепола в присутствии фенола проявляется важное нрепмчтцес. во лишчрочамен. иных бгпчофуразана и бензофур( <сана как реагентов для дериват из.шин а.мпносоедппепий по сравнению с сульфохлорпдами, изоцнанатамн,диазотм-рукчнпмн и друшми ранеными. Оно заключается в избирагельности реакций дсрнвагиза-цни определяемых аминосоеднненпП п присутствии органически., веществ других классов (фенолов, сипріо'і п др )
Благодаря высокой интенсивности полос поглощения производных пределы обнаружении при снеирофоіоме-іри'іесміх определениях большинства амнносоеднпеднн достига-юі 2 10'" мо.ті.'.і При фоюмеїрнчесміх определениях гидразина в производственных водах 'ГЭС с использованием кюиег . длиной поглощающего слон 5 см предел обнаружения акали га состанпл 2 10'' моль/л.
і'есі-меїоділ для определении алшпососдиненнй в иоздушных и водных средах. Высокая реакционная способность хлордпннтрозямешенных Сеизофуразяна и ошиофуроь-сана, возможность дерпвагнзацнн соединений с первичными, вторичными и тр :пгш:.тг.ш аминогруппами, достигаемая при этом визуализация аналитического сигнала оказались привлекательными для использования реагентов в тест-методах, реализованных в виде тест-полосок, индикаторных трубок и хемосорбаиоиных пробоотборников ия их основе, непрерывного газового анализа на основе газосигнализатора ГСП-11, а также капельных реакций на пластинках ТСХ. При изучении реакций амнносоединений в гетерофазмых условиях (на енлпкагеле, окиси алюминия, цеолитах, а пленках эфиров целлюлозы), а также в условиях ТСХ обнаружилось, что дернватизация даже таких малоосновных арнламинов, как дифениламин и трнфеннламнн, завершаете за 2-3 минуты. Для анилина и его замещенных, гидра-зидов кислот развитие окраски происходит в течение нескольких сек-, ид после взаимодействии анялита с реагентом селективного слоя. Сопоставление резуль.ятоа, полученных при изучении кинетики реакций тех же вешеств с БФЗ и БФО в растворе и в условиях гетерогенного взаимодействия показывает относительное возрастание скорости дериватпзашт шо-ричных и третичных ариламинов на твердом носителе. Это можно объяснить известной способностью силикагеля, окиси алюминия и других фаз к образованию к-комгыексов с ароматическими соединениями, что должно вызывать повышение основности и, в свою очередь, нуклеофпльностп определяемых веществ.
Гетерофазные реакции определяемых веществ с реагентами, выбор которых ос> шест-влялся в соответствии с закономерностями, описанными выше, приводят к образованию окрашенных производных-. Характер окраски при этом зависит от природы аналита (степени замещения аминогруппы, заместителей, их положения) Для производных первичных арнламинов, замещенных гидразина, гпдразндов кислот характерна окраска оранжевого, красного цвета. Для производных гидразина, вторичных.н третичных ароматических и «ле-роароматических аминов происходит развитие окраски до "зеленого, синего цвета. Такая характеристичность спектральных свойств производных удобна для использования <а тест-методах, капельном варианте проведения аналитических реакций, а также в ТСХ, поскольку позволяет визуально оценивать потенциальный состав анализируемой матрицы, проводить скрининг реакционных смесей с участием амнносоединений. Благодаря высокой тпенсии-
пости поглощения при этом достигается высокая чувствительность определений. Так, пре дел визуального обнаружения гидразина на пластинках ТСХ достигает 0,05 мкг, для другн? амнносоедішеїшй он составляет 0,1-1 мкг. Образующиеся в результате гетсрофазаых реак цин окрашенные производные аминосоединешш имеют высокую устойчивость при храпе ний в обычных условиях, что важна для документирования результатов аналитических on ределений.
Лучшими аналитическими характеристиками в качестве носителя при изготовленш индикаторных трубок м хсмосорбшюнном варианте их использования об.'.лдает силикагелі ШСМ с фракцией 0,1-0,3 мм. Для изготопл^ння тест-пленок предпочтительнее использова нне нитроцеллюлозы как пленкообразующей основы. Иммобилизация реагентов проводилась пропиткой (индикаторные трубки), совместным отливам (тест-полоскн) при выдержи-вапии массы реагента и носителя в системах растворителей, исключающих гидролнтическук инактивацию хромогенных реагентов. В непрерывном газовом анализе п качестве растворителя реагента использован дибутнлфталат, обеспечивающий устойчивость используемы* реагентов в дозирующем узле, однородное смачивание рабочей зоны индикаторной ленты і высокую чувствительность детектироваинд токсикантов при генерировании через рабочук зону анализируемого воздуха.
Индикаторные тест-полоскн на основе иммобилизованных в нитроцеллюлозу реагентов были использованы для определении ероматических, гетероароматических аминов и гидразинов в водной среде. После выдерживания тест-полосок в потоке анализируемого раствора в течение 2-3 минут (для разбавленных (10"* моль/л и ниже) растворов токснкантоЕ - в течение 15 минут) тест-полоски окрашивались в красный (анилин, фенилгндразнн, 1,1-диметилгидразнн ч др.) или сине-зеленый цвет (Ы.К'-диметнланилин, ЗЛ^-триметпл-ІД-дипщрохннолнн). При этом визуально отслеживается зависимость интенсивности окраски тест-полоски от концентрации токсиканта в воде, позволяя проводить колористическую оценку его содержания. Благодаря своей прозрачности тест-полоскн оказались пригодными для спектрофотометрических определений аналитов в водных средах. Фотометрирование тест-полосок при аналитических длинах волн, соответствующих природе определяемого вещества, показывает удовлетворительную корреляцию между свстопоглощением пленки и содержанием токсиканта (мг/л) в воде
А = 3.37 С» -г 0.03 (г = 0.992, X = 510 нм) для анилина, А = 0.49 С, - 0.01 (г = 0.990, X - 510 ..я) гчя фенилгвдразина, А = 0.14 С, - 0.01 (г = 0.987, X « 640 нм) для К.Н-диметилашшша. Определениям аминосоединешш тест-полосками не мешают фенолы, карбоновые кислоты, алкиламины, аммиак, неорганические вещества. Также возможны избирательные определения третичных (М,М-диметиланилин) в присутствии первичных (анилин) аридамшюв.
При определениях амнносоедннений различной природы в воздушных средах с помощью индикаторных трубок, как и в случае ігь t-полосок, на носителе наблюдается образование окрашенных производных. При скорости аспирации воздушной среды 1-2 л/мин обнаруживается хорошо выраженная зависимость между толщиной окрашенной зоны и содержанием токсичных ариламинов. Сочетание характерной окраски производных и линей-но-колористнческая зависимость толщины окрашенного слоя носителя позволяют визуально оценивать как природу определяемых веществ, так и их концентрацию в анализируемой
мі-.:рине. Пролеты визуальною оондру'лсешп лрмламшюь (0,05 мг/м' н выше) в большинстве с.т.ччаев значніедьно ниже нормируемых показателей токсичных веществ. Так, о-хлоранилин н N.N-днмегнланилим обнаруживаются при их содержании в воздухе, соответствующем 0,25 ! ІДК,,., п-юлмшт - яри ко г. ей грации 0,05 ПДК,;,. Определениям ариламинов при этом не аешаюг іаміе комнопенш воздушной среды, sax аммиак, алкнламииы, растворители и другие органические вешествн различной природы.
Іі.таї'олари высокий реакционной способности испольэуемь..; реагентов индикаторные
грубки оказались пригодными для селективного группового хемосорбционного извлечения
химически неустойчивых ариламинов яз воздушной среды. Эффективность хсмосорбинон-
пого npoooouvpa для анилина и м-хлоранилнва при скорости аспирации воздуха 0,5 - 2,5
л/мин составляла ЭэЧЬ Последующая десорбция 4,6-дкнитробепзофуроксановых пронзьод-
ных, протекающая количестве .но в ацетсиитрнле м метаноле, позволяет проводить опреде
лении арнламннеч» методом ОФ-ВЭЖХ. Пределы обнаружения токсикантов в этом варианте
использования индикаторных трубок состяидяюг 0,1 мг.'м3, . '
Спектральная селективность нронзьочних ариламинов относительно проіпволнму ілкнламинов, аммиака, избирательность взаимодействия использованных реагагов с сріа-шческими соединениями различных классов позволили адаптировать гетерофазные реакции териватітации определяемых ариламинов к системе фотометрического детектирования по-гуавтоматн'еского газосигнализатора боевых отравляющих веществ ГСП-П. После изменений электронной схемы прибора, позволяющих увеличить продолжительность рабочего шкла прибора, срабатывание звуковой и цветовой сигнализации газосигнализатора при іревьшіешш допустимых уровней содержания анилина, л- и м-толуидшюв, хлораннлинов, і-гтизндт<а в воздухе происходит при продолжительности аспирации воздуха 3-8 минут. Определению содержания токсика.'г'он не мешаю г титлипые компоненты, воздушной средь, тоизводственных помещений, такие как аммиак, алкнламииы, оргагические раствори!ели
Реакции лершкгпптнши и иргпчічпо-нпжекшіоіших определениях ішиішсоєли-ісішГі. Благодаря реакционной способности реагентов и спектральным характеристикам роизводных хлординитрозамещенные бензофуразаиа и бензофуроксана оказались эф'{нч,-нвнымн при избирательных определениях амииосоединенкн в неравновесных условиях пстемы ПИА. Аналитические характеристики ПИА определении некоторых соединений рпведены а табл.4
Главными факторами достижения высокой избирательности и чувствителы'.осчч сп-еделеннй в системе ПИА при анализе смеси гмнносоедннешш оказались вариации coca а.,а яст воритслей, используемых в потоке носителя в сочетании с выбором дериватизирующего гагеита с подходящими электрофнльны.ми свойствами. Достигаемый при тпм эффект ки-гтической «дискриминации» позволяет проводить избирательное спекгрофоточсгрическос ^тестирование в системе ПИА исходных или конечных продуктов пром.ь.<"".енных рск-ій, оценивать чистоту лекарственных веществ (табл. 5)/ В ряда случаев избирательность тределений достигается благодаря спектральным свойствам образующихся в потока прошеных. Понижения предела обнаружения, в случае гадразіша'достигающего 12 нг/мл, мож-) достичь за счет использования каталитического влияния основных компонентов анплп-іруемой матрицы.
Таблица 4
Аналитические характеристики проточно-инжекцнонных определений аминосоединений
Реакции дсрии.тптации при изучении генетически детерминированных процессов Спограиеформацш! лекарственных веществ. Возможность избирательных определений лекарственных аещеста (шониззнд, фосфабензид и др.) в биологических субстратах человека положена в основу метода определения генетически детерминированного процесса биотрансформашш ксенобиотиков {лекарственные вещества изониазнд, апрессин, амфетамины, пеницилламнны и др., промышленные токсиканты) по типу ацетилирования, который определяется активностью ферментаМ-ацети..;раи-,феразы в цитозоле печени
N-ацетіштраксфераза
RNH2 + CHj -C(0)-S-KoA >R-NH-C(0)-CH}
Характерное для этого процесса генетически детерминированное распределение пс
скорости метаболических превращении приводит к эффекту передозировки лекарственны>
веществ (побочным эффектам) для медленных ацетнляторов или незфі} хтианости лекарст
венной терапии для быстрых инаетиваторов. Определение фенотипа о< овано на изученш
фармакокинетических параметров выведения свобода о изошшнш
(фармакогенетнческого маркёра) с мочой пациента хроматографическі- <н (ВЭЖХ, ТСХ) і спектрофотометрнческим методами. Результаты, полученные при itcnoj. ювании различны; аналитических методов, хорошо согласуются между собой. Это позвол: т использовать дл.' определения фенотипа наиболее адаптированные к клиническим услові м методы спектро
'!;>!емеірг,!і и ї'СХ Деривлпшшія аналитов в биосубстрате 4-хлор-5,7-ді:пн;роі">е>ііоф\рйЗі:ном приводит к повышению чувствительности определения в ВЭЖХ, ТСХ, а в спеклрофотомегрическом .методе повышает нзбирзтельность детектирования.
- - - Таблица 5
І'еіуліл.ііі.і ііріжі'іііо-ніькекціїонш.і*; определений амнносоедішсннґі в размчпых
п'гьсстаг /п-6, РЮ.УЗ)
0.04
В таблице 6 приведены фар.макокшіетические параметры выведения нзонназнла ;мя выборки из 26 паииеіггов, показывающие значительные различия а периоде полувыведежш. количеству выводимой дозы лекарственного вещества быстрыми и медленными ацетнлято-рами. Менее выраженной бнмодальчостыо характеризуется бжпрансформацич лекарственного препарата фосфабензид.
Предложенный метод прошел клиническую апрорацию и показана ио-подноси, ен> использования для оптимальной дозировки лехарствеинь'вс средств о учетом феил»ппиче-CKiix особенностей пациента. На основании результатов изучения кинетики выпед!-,. л изо-ниазпда из орілнпзма пациентов в присутствии некоторых известных индукторов N-ацетилтрансфераэы (паїпотеїіат кальция, пнридоксииа гидрохлорнд). а также иопого пекчр-стнеиного препарата-иммуномодулятора ксимелон, показана возможность і.рпмічн:,:<* у,г
тода при подоорс лекарственных веществ для целенаправленной регуляции (модификации) скорости генетически детерминированных процессов биотрансформации ксенобиотиков. Это важно для повышения эффективности лекарственной терапии и устранения (уменьшения) побочных эффектов от их применения с учетом фенотиш'ческих особенностей пациентов.
Таблица 6 Фармакокинетические параметры выведения кзоииазида по данным исследования мочи после однократного перорального приема 450 мг препоата
(26 пациентов)
