Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1 Особенности получения КТ с высоким квантовым выходом 12
1.2 Способы перевода КТ из органического растворителя в водные среды 13
1.2.1 Метод замены лигандов 14
1.2.2 Метод инкапсуляции с использованием амфифильных молекул 20
1.2.3 Покрытие диоксидом кремния 22
1.3 Использование дендримеров для модификации КТ 22
Глава 2. Экспериментальная часть 29
2.1 Используемые реактивы 29
Конъюгирование и иммунохимический анализ 29
2.2 Используемое оборудование 31
2.3. Синтез КТ 31
2.4 Спектроскопические характеристики образцов 34
2.5 Модификация КТ с помощью полиамидоаминого дендримера 36
2.6 Модификация КТ с помощью амфифильного браш-полимера 36
2.7 Приготовление носителей для иммуноанализа 38
2.8 Пробоподготовка образцов кукурузы 40
2.9 Расчёт аналитических характеристик методик иммунохимического определения 40
Глава 3. Характеристики квантовых точек различной структуры 46
3.1 КТ на основе CdSe 48
3.2 КТ на основе CuInS2 55 Выводы по главе 3 61
Глава 4. Гидрофилизация квантовых точек 63
4.1 Получение комплексов КТ-ПАМАМ 65
4.2 Влияние добавления тетраметиламмония на результат реакции обмена лигандов 66
4.3 Оптические свойства комплексов КТ-ПАМАМ 67
4.4 Гидродинамические свойства комплексов КТ-ПАМАМ 74
4.5 Перевод в водную фазу КТ структуры CdSe/ZnS и CuInS2/ZnS с помощью дендримеров 76
4.6 Сравнительная характеристика КТ, переведенных в водную фазу с помощью дендримеров и амфифильного полимера 78
4.7 Исследование стабильности полученных КТ с дендримерными лигандами 82
Выводы по главе 4 91
Глава 5. Применение гидрофилизированных квантовых точек в качестве люминесцентных меток в иммуноанализе 93
5.1 Конъюгация комплексов КТ-ПАМАМ с антителами 94
5.2 Конъюгация гидрофилизированных с помощью амфифильных полимеров КТ с антигеном 100
5.3 Качественное и количественное определение дезоксиниваленола 103
Выводы по главе 5 110
Выводы 112
Список литературы 115
- Метод инкапсуляции с использованием амфифильных молекул
- Спектроскопические характеристики образцов
- Оптические свойства комплексов КТ-ПАМАМ
- Конъюгация гидрофилизированных с помощью амфифильных полимеров КТ с антигеном
Введение к работе
Актуальность работы. Квантовые точки (КТ) – люминесцентные нанокристаллы полупроводников – широко применяются в различных областях анализа в качестве источников люминесцентного сигнала. Востребованность КТ определяется уникальным набором их оптических характеристик, включающим узкий и симметричный пик люминесценции, зависимость длины волны излучаемого света от структурных и размерных характеристик нанокристалла, а также широкую полосу поглощения и высокую фотостабильность в сравнении с органическими флуорофорами.
На сегодняшний день одним из наиболее используемых материалов для синтеза КТ является селенид кадмия (CdSe), преимуществом которого является находящийся в видимой области спектра и при этом узкий пик люминесценции КТ на его основе. Возможно, самым важным недостатком частиц на основе селенида кадмия является токсичность этого металла. Несмотря на то, что в аналитических приложениях токсичность используемых материалов не имеет решающего значения, существует интерес в альтернативных материалах. Так, известны квантовые точки на основе CuInS2, максимум пика люминесценции которых обычно находится в красной области спектра. Для повышения квантового выхода люминесценции полученных нанокристаллов их покрывают слоями более широкозонных полупроводников.
Несмотря на имеющиеся разработки в области синтеза КТ в водных средах, коллоидные КТ с высоким квантовым выходом традиционно получают методом высокотемпературного синтеза в органических растворителях. Это приводит к невозможности прямого использования таких КТ в водных средах, в которых обеспечение стабильности КТ остаётся проблемой. Кроме того, использование КТ в биологических исследованиях и таких областях, как иммунохимический анализ, требует возможности связывания люминесцентной метки на основе нанокристалла с биомолекулами. Таким
образом, актуальным является получение люминесцентных полупроводниковых КТ, поверхность которых модифицирована с целью достижения их коллоидной стабильности в водных средах, для применения в иммунохимических методах анализа.
Целью настоящего исследования является сравнительное изучение влияния состава ядра, способов нанесения оболочек более широкозонных полупроводников, а также способов перевода в водную фазу на свойства гидрофилизированных полупроводниковых квантовых точек для применения в качестве люминесцентных меток в синтезе иммунореагентов для качественного и количественного иммуноанализа.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
получить квантовые точки ядро-оболочка различного строения с высоким квантовым выходом и провести сравнительный анализ их оптических характеристик;
разработать методику получения стабильных водных коллоидов на основе КТ методом замены лигандов с использованием полиамидоаминных дендримеров (ПАМАМ);
провести сравнительный анализ свойств КТ, стабилизированных в водной среде методом замены лигандов с использованием дендримеров ПАМАМ и инкапсуляцией с помощью амфифильного полимера ПМАО-Джеффамин с точки зрения ключевых характеристик: квантового выхода люминесценции, стабильности в водной среде, размера - для использования в качестве люминесцентных меток в синтезе иммунореагентов для качественного и количественного иммуноанализа;
разработать методики конкурентного иммуноанализа с люминесцентным детектированием при использовании полученных квантовых точек в качестве меток.
Методы исследования. Для решения поставленных в работе задач применяли комплекс физических методов исследования (люминесцентная спектроскопия, электронная абсорбционная спектроскопия в УФ и видимой областях, электронная микроскопия, динамическое рассеяние света) и иммунохимических методов анализа (инструментальный метод на основе микропланшетов и иммунохимические тест-колонки).
Научная новизна состоит в следующем:
проведено сравнительное изучение влияния состава ядра, строения и способа нанесения оболочки (оболочек) более широкозонных полупроводников на оптические свойства полупроводниковых квантовых точек на основе CdSe и CuInS2;
разработана методика перевода КТ CdSe/CdS/ZnS и CdSe/CdS/CdZnS/ZnS из органического растворителя в водные растворы с сохранением оптических свойств методом замены лигандов с использованием полиамидоамина 4-го и 5-го поколения;
изучено влияние поколения дендримера на оптические и гидродинамические свойства получаемых частиц; получена сравнительная характеристика этого способа гидрофилизации в сравнении с инкапсуляцией амфифильным полимером ПМАО-Джеффамин;
показана возможность применения полученных КТ в качестве люминесцентных меток при синтезе иммунореагентов.
Практическая значимость работы: В результате проведённых исследований разработаны методики получения стабильных в водных средах КТ структуры CdSe/ZnS,CdSe/CdS/ZnS и CdSe/CdS/CdZnS/ZnS, а также CuInS2/ZnS, обладающих высоким квантовым выходом люминесценции и долговременной стабильностью, способных связываться с биологическими молекулами. Проведено систематическое сравнение свойств водных коллоидов КТ, полученных с помощью дендримеров и путём инкапсуляции с
помощью амфифильного полимера. Разработаны методики качественного и количественного определения дезоксиниваленола (ДОН) в образцах кукурузы с использованием полученных люминесцентных меток.
На защиту автор выносит:
Методику получения стабильных в водной среде люминесцентных меток на основе КТ, стабилизированных дендримерными лигандами.
Результаты сравнительного исследования зависимости характеристик КТ от структуры полупроводниковых оболочек и способа гидрофилизации.
Методики качественного и количественного конкурентного иммунохимического анализа с люминесцентным детектированием с использованием полученных меток в качестве источников сигнала.
Личный вклад соискателя заключается в постановке задач
исследования, выборе методов модификации КТ, непосредственном
проведении экспериментов, обобщении полученных результатов,
формулировании выводов.
Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (5 глав), выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 106 ссылок. Работа изложена на 126 страницах, содержит 47 рисунков и 15 таблиц.
Публикации:
По теме настоящего исследования опубликовано 9 печатных работ: 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК, 5 статей и тезисов докладов в трудах конференций.
Апробация работы:
Основные результаты диссертационной работы представлены на следующих конференциях: Всероссийская школа-конференция «Химия
биологически активных веществ» молодых ученых, аспирантов и студентов с
международным участием «ХимБиоАктив-2012» (Россия, Саратов, 2012); Saratov Fall Meeting SFM’13,15: International School for Junior Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophotonics (Россия, Саратов, 2013 и 2015); II Всероссийский съезд аналитиков, Россия, Москва, 2013; XVIII Саратовский салон изобретений инноваций и инвестиций, Россия, Саратов, 2013; Международная конференция «Биотехнология: Состояние и Перспективы Развития», Россия, Москва, 2014; 6th International workshop "Nanoparticles, nanostructured coatings and microcontainers: technology, properties, applications", Россия, Саратов, 2015.
Финансовая поддержка работы осуществлялась проектами: грант МОН (4.1708.2014), грант ДААД (11.9195.2014), программой У.М.Н.И.К. (№ 0004648 и 0015488), проектами РНФ (14-13-00229) и ФЦП (14.574.21.0128).
Метод инкапсуляции с использованием амфифильных молекул
Существует несколько распространённых способов перевода из органической фазы в водные среды КТ с гидрофобными стабилизирующими лигандами. Одним из них является метод замены лигандов, представляющий собой замещение исходных гидрофобных лигандов на поверхности КТ на гидрофильные, например, на тиольные лиганды с короткой цепью (19, 20), такие как меркаптоуксусная и меркаптопропионовая кислоты. Такой подход приводит к получению относительно небольших (в сравнении с другими методами) частиц, имеющих, тем не менее, низкую коллоидную стабильность и значительно более низкий квантовый выход фотолюминесценции, который является ключевым параметром эффективности флуорофора (21). Самым популярным типом лигандов являются молекулы с концевой тиольной группой, имеющей наибольшее сродство к поверхности КТ. Кроме того, широко используются лиганды на основе аминов, карбоновых или фосфоновых кислот [22–25].
Один из первых способов получения гидрофильных КТ путём покрытия нанокристаллов CdSe/ZnS меркаптоуксусной кислотой был разработан ещё в 1998 году [26]. Он основывался на высоком сродстве монотиольных групп к поверхности оболочки сульфида цинка. Вслед за этим было предложено множество монотиольных лигандов для обеспечения стабильности КТ в водных средах. Среди них можно выделить меркаптопропионовую кислоту [27–29], меркаптоундекановую кислоту [30], 4-меркаптобензойную кислоту [31], тиольные производные сахаров [32], тиолированные производные диэтиленгликоля [33], дендроны [34, 35], цистамин [36], цистеин [37] и другие схожие соединения. На сегодняшний день этот подход всё ещё широко применяется из-за простоты получения и высокой коммерческой доступности используемых лигандов.
Квантовые точки, модифицированные с помощью тиольных лигандов, часто имеют относительно низкий срок хранения [38], что, по имеющимся предположениям, связанно с динамическим характером процесса связывания тиольной группы и ZnS. Кроме того, было обнаружено, что на стабильность тиолсодержащих лигандов влияет pH среды. В частности, было обнаружено, что стабильность коллоидных нанокристаллов, покрытых тиольными лигандами значительно уменьшается при увеличении кислотности раствора. При достижении pH 5 и ниже происходит активное протонирование тиолсодержащих лигандов с последующей их диссоциацией с поверхности нанокристалла, что, по мнению авторов исследования [39], и является основной причиной осаждения стабилизированных таким образом КТ. Также было установлено, что процесс диссоциации является обратимым, а значение pH, соответствующее равновесному состоянию, зависит от размера наночастиц. Кроме того, снижение однородности покрытия поверхности КТ лигандами со временем приводит к снижению квантового выхода фотолюминесценции КТ. Выраженность тушения люминесценции зависит в основном от размера и заряда тиолсодержащего лиганда [40].
Было обнаружено, что для сохранения коллоидной стабильности и квантового выхода гидрофилизированных КТ критически важна качественная реализация метода обмена лигандов. Например, прочность связи монотиола и сульфида цинка на поверхности может быть повышена путём удаления тиольного водорода в ходе процесса адсорбции [41], а падение интенсивности люминесценции может быть уменьшено при остановке процесса лигандного обмена, выделенной в отдельный этап синтеза. Кроме того, была разработана методика формирования оболочки КТ с одновременным покрытием её гидрофильными лигандами, что позволяет осуществлять наращивание оболочки ZnS и её модификации с помощью водорастворимой меркаптопропионовой кислоты в одну стадию, обеспечивая меньшее снижение квантового выхода модифицированных КТ по сравнению с исходными [42].
На стабильность квантовых точек после перевода в водную фазу также оказывает влияние pH раствора [43]. При высоких значениях pH тиольная группа лиганда подвергается депротонированию с образованием тиолата, который образует более прочную связь с поверхностью КТ, чем тиольная группа [44]. Снижение квантового выхода КТ, вызванное закреплением тиолсодержащих лигандов на поверхности, может быть эффективно снижено путём дальнейшей сшивки или добавления дополнительных слоёв к поверхности [45]. В частности, для этой цели проводили связывание лигандов меркаптопропионовой кислоты с лизином в присутствии дициклогексилкарбодиимида. Стабильность и квантовый выход таких КТ были выше, чем у гидрофилизированных КТ, не подвергавшихся такой модификации. Тем не менее, из-за значительной толщины покрытия полученные КТ обладали очень большим размером [46].
Цвиттерионные монотиолы, обладающие одновременно положительным и отрицательным зарядом, способны минимизировать гидродинамический размер полученных частиц и снижать уровень неспецифического взаимодействия модифицированных КТ. Тем не менее, несмотря на выдающиеся характеристики, важным недостатком таких лигандов является их нестабильность. Полученные модифицированные с применением цистеина КТ могут выпадать в осадок уже после 24 часов хранения при 4 C [47]. Применение D-пеницилламина (рис. 3) в качестве стабилизирующего цвиттерионного лиганда для гидрофилизации КТ позволяет получить намного более стабильные частицы, сохраняющие коллоидную стабильность в диапазоне pH от 5 до 9 и проявляющие высокую химическую стабильность даже в сильно окислительной среде. Предположительно столь высокие показатели достигаются за счёт сниженного взаимодействия между лигандами D-пеницилламина [48].
Спектроскопические характеристики образцов
Затем осуществляли адсорбцию антител путём добавления в колонку 750 мкл раствора первичных антител в карбонатном буферном растворе (разведение исходного раствора антител 1:105, соответствующее примерно 0,910-8 мг первичных антител на полиэтиленовый фильтр) с последующей инкубацией в течение 20 минут при комнатной температуре. Блокирование активных групп проводили, добавляя 1% водный раствор казеина с инкубацией в течение 20 минут. Затем колонки промывали 750 мкл ФСБ с 0,2% БСА.
Для пробоподготовки образцов кукурузы использовали подход, описанный в [105]. Сначала образцы кукурузы мололи в кофемолке. Для экстракции к 5 г помолотого образца добавляли метанольно:водную смесь (80:20 по объёму, объём смеси – 20 мл) на горизонтальном шейкере в течение 15 мин при комнатной температуре. После центрифугирования (4000 g, 140С, 15 мин) надосадочный раствор отбирали и фильтровали через бумажный фильтр. Для иммуноанализа экстракты кукурузы разбавляли в пять раз с помощью ФСБ.
Расчет аналитических характеристик количественного конкурентного метода При представлении градуировочных зависимостей интенсивности люминесценции (представляющей собой сигнал в данном виде анализа) от концентрации аналита использовали десятичные логарифмы концентраций аналита с реализацией построения зависимости I = f(lgC). Типичная градуировочная кривая определения веществ конкурентным анализом имеет сигмообразный вид, как и все градуировочные графики для иммунохимических методов анализа низкомолекулярных веществ. Эта кривая описывается (линеаризуется) четырехпараметрическим уравнением: y = (A–D)/[1+(x/C )b]+D где А – максимальное значение сигнала люминесценции, b – наклон кривой в точке IC50, С – концентрация IС50, при которой интенсивность люминесценции составляет 50%, D – минимальное значение сигнала поляризации флуоресценции. В качестве основных аналитических характеристик рассматриваются чувствительность, предел обнаружения, диапазон определяемых концентраций, специфичность. В иммунохимических методах анализа чувствительность определяют с помощью двух характеристик: коэффициента чувствительности (тангенс угла наклона градуировочного графика) и параметра IC50 – концентрации аналита, при которой интенсивность люминесценции составляет 50%, т.е. середина градуировочной кривой. Нелинейная форма градуировочной кривой способствует увеличению экспериментальной ошибки на границах диапазона определяемых концентраций. Поэтому принято определять параметр IС50, как основной показатель чувствительности анализа.
Диапазон определяемых концентраций (ДОК) соответствовал прямолинейному участку градуировочного графика. Обычно ДОК определяют в диапазоне изменения сигнала от 80 до 20% ингибирования сигнала в отсутствие аналита. ДОК является важным параметром градуировочного графика, который дает первую информацию о чувствительности метода, так как в этом диапазоне реализуются наименьшие ошибки определения. Специфичность метода характеризует взаимодействие антител со структурно-близкими аналогами определяемого вещества, а также веществ, близких по физиологической активности и содержащихся в реальных образцах. Количественно специфичность выражается в процентах кросс-реактивности (% КР), по формуле: % КР = (С1:С2)100% C1 - концентрация определяемого вещества (А), С2 - концентрация кросс- реактивного вещества (Б) Специфичность метода считается высокой, если % КР меньше 10% для кросс-реактивного вещества. Если % КР составляет 1%, то считается что это вещество не влияет на определение анализируемого вещества. Производителем определена кросс-реактивность применяемых антител. Показано, что данные антитела обладают кросс-реактивностью только к 3 ацетилдезоксинилваленолу и она составляет 34%. Из этого следует, что антитела и методы на их основе специфичны только к ДОН и 3-ацетилдезоксинилваленолу.
Предел обнаружения (ПрО) рассчитывали по правилу «трёх сигм» (3) с учетом того, что в конкурентных методах анализа с ростом концентрации аналита происходит снижение аналитического сигнала. Для расчёта ПрО из среднего значения сигнала в отсутствие аналита (n = 21) вычитали утроенное значение среднеквадратичного отклонения (). Рассчитанное на основе сигмоидальной кривой значение концентрации, соответствующее данной величине аналитического сигнала, использовали в качестве ПрО.
Оптические свойства комплексов КТ-ПАМАМ
Как видно из приведённых в таблице 3 данных, при наращивании оболочек CdS/ZnS и CdS/CdZnS/ZnS на ядра CdSe КВ нанокристаллов возрастает. Значение квантового выхода для изначально полученных ядер CdSe обоих типов составляло примерно 10 % (с незначительными различиями в зависимости от конкретных ядер) и увеличилось до 56 % и 59 % после покрытия оболочками CdS/ZnS и CdS/CdZnS/ZnS, соответственно. Таким образом, осуществлённое покрытия ядер более широкозонными полупроводниками приводит к эффективной изоляции излучающей структуры от внешней среды.
Время жизни люминесценции Время жизни люминесценции КТ измеряли с использованием лазерного диодного источника света с длиной волны 370 нм. Кривые затухания люминесценции исследованных образцов имеют вид экспоненциальных кривых (рис 17). Время жизни люминесценции КТ составило 18 нс для ядер CdSe, 44 нс для оранжевых КТ (CdSe/CdS/CdZnS/ZnS) и 38 нс для красных КТ (CdSe/CdS/ZnS), полученных на основе этих ядер (рис. 21). Увеличение времени жизни при покрытии ядер оболочками свидетельствует об эффективной изоляции излучающего нанокристалла от внешней среды, а также подтверждает качество нанесения оболочки.
Полученные значения времени затухания возбужденного состояния больше, чем для органических красителей. Например, для флуоресцеина время жизни люминесценции (в водной среде) составляет примерно 4,00 нс, для родамина 6Ж – примерно 4,08 нс. Данные молекулы широко используются для изучения характеристик среды и в аналитических целях на основе поляризационных измерений их флуоресценции. Большое значение времени жизни возбужденного состояния дает теоретическую возможность использовать исследуемые КТ, например, при вращении молекул с высокой молекулярной массой, или в иных методах исследования, основанных на измерении деполяризации люминесценции.
В отличие от квантовых точек на основе селенида кадмия, в процессе наращивания оболочек общий вид спектра поглощения КТ структуры CuInS2/ZnS не изменялся (рис. 18). Тем не менее, при переходе от одной условной оболочки ZnS к двум и более (под количеством оболочек подразумевается число циклов введения прекурсоров Zn и S в ходе модификации ядер) наблюдался резкий рост интенсивности поглощения в диапазоне 350-600 нм, которая не увеличивалась при дальнейшем наращивании оболочек.
Изменения в спектре поглощения КТ CuInS2/ZnS с различным числом условных слоёв ZnS Полученные КТ CuInS2/ZnS обладали достаточно широкими спектрами люминесценции, характерными для квантовых точек этой структуры, с положениями пиков эмиссии на 655 и 700 нм (рис. 19).
При увеличении числа оболочек сульфида цинка наблюдались изменения в положении максимума пика люминесценции (рис. 20) с максимальным изменением при нанесении второй оболочки ZnS. При этом после нанесения второй условной оболочки направление смещения меняется на противоположное. Рис. 20. Положение максимума пика люминесценции КТ CuInS2/ZnS в зависимости от числа условных оболочек
Время жизни люминесценции Для КТ на основе CuInS2 также исследовали зависимость времени жизни люминесценции от числа оболочек ZnS. Рис. 21. Время жизни люминесценции КТ на основе CuInS2 при разном количестве условных оболочек ZnS Показано, что время жизни люминесценции указанных КТ резко увеличивается при наращивании первого слоя оболочки сульфида цинка и затем при переходе к двум слоям ZnS (рис. 21). Дальнейший рост времени жизни является уже не столь выраженным (Таблица 4).
Поскольку этот тип КТ менее изучен, представляло интерес изучить пошагово изменение значений квантового выхода при нанесении оболочек. Показано, что полученные ядра CuInS2 обладают крайне низким квантовым выходом (меньше 1%), который увеличивается до 15% после наращивания первой оболочки более широкозонного полупроводника. Следующее значительное увеличение квантового выхода – с 15 до 62 % – наблюдается после нанесения второй оболочки ZnS. Дальнейшее увеличение толщины оболочки также приводит к повышению КВ, но этот прирост измеряется в единицах процентов. Так, с нанесением 3, 4 и 5 условного слоя сульфида цинка рост КВ люминесценции нанокристаллов составляет 8, 1 и 4 %, соответственно. График зависимости КВ от числа оболочек ZnS приведён на рис. 22. Рис. 22. Квантовый выход и время жизни КТ на основе CuInS2 с увеличением количества условных оболочек ZnS
Можно утверждать, что квантовый выход люминесценции некадмиевых КТ, а также время жизни люминесценции и оптическая плотность в области 350-650 нм увеличиваются с увеличением количества условных оболочек более широкозонного полупроводника ZnS. Можно проследить некоторые закономерности наращивания оболочек. Так, ключевые характеристики CuInS2 с одной оболочкой ZnS, такие как квантовый выход и время жизни люминесценции, хоть и превышают таковые для немодифицированных ядер, но значительно уступают КТ с двумя оболочками. Можно предположить, что количество слоёв сульфида цинка от 1 до 3 является недостаточным для достижения высоких значений важнейших параметров квантовой точки, а эффективно действующая оболочка формируется после четвертой итерации введения прекурсоров в реакцию. Дальнейший же рост квантового выхода и времени жизни люминесценции является не столь выраженным, что, по-видимому, свидетельствует о достаточно полном покрытии ядер широкозонным полупроводником.
Таким образом, показано, что при использовании одних и тех же ядер нанесение оболочки разными способами оказывает различное влияние на оптические характеристики получаемых КТ. Так, для ядер CdSe (1) зелёного цвета свечения нанесение оболочки ZnS приводило к эффективной изоляции ядра нанокристалла (о чём свидетельствует значительный рост квантового выхода люминесценции), но при этом положение максимума эмиссии всё так же находилось в зелёной области, в то время как при использовании методики SILAR для формирования структуры CdSe/CdS/CdZnS/ZnS максимум пика люминесценции смещался в оранжевую область.
При использовании послойного формирования оболочек (SILAR) для различных ядер CdSe (1) и CdSe (2) удалось достичь практически одинаковых результатов с точки зрения оптических характеристик. Таким образом, выбор типа ядер должен обуславливаться желаемой длиной волны люминесценции результирующих КТ ядро-оболочка.
Конъюгация гидрофилизированных с помощью амфифильных полимеров КТ с антигеном
Тем не менее, согласно наблюдениям, воспроизводимого размера стабилизированных ПМАО-Джеффамин частиц добиться сложнее, чем при использовании дендримерных лигандов. -потенциал комплексов КТ-ПАМАМ значительно выше по модулю, что говорит о более высокой стабильности указанных частиц в водной среде.
Таким образом, перевод КТ в водную фазу методом замены лигандов с использованием ПАМАМ позволяет получить частицы с более высокой коллоидной стабильностью и более высоким квантовым выходом, чем при инкапсуляции с помощью амфифильного полимера (таблица 11). Это особенно важно, учитывая простоту осуществления реакции обмена лигандов, не требующей длительной процедуры очистки и позволяющей стабильно получать частицы нужного размера. Таблица 11. Параметры меток, полученных различными способами.
Способ гидрофилизации Снижение квантового выхода Размер частиц, нм -потенциал, мВ Замена лигандов на ПАМАМ 20% 50-60 50-52 Инкапсуляция сиспользованиемПМАО-Джеффамин 44% 35 -8 - -10
Пригодность полученных люминесцентных меток для применения в аналитических целях напрямую зависит, в том числе, от их стабильности. Метки должны обладать приемлемым временем хранения и, что ещё более важно, постоянством своих ключевых характеристик во времени. Информацию о стабильности стабилизированных дендримерами КТ можно получить как непосредственно путём испытания на стабильность, так и с помощью оценки подверженности люминесцентного нанокристалла влиянию внешней среды.
Исследование воздействия ультрафиолетового излучения на оптические свойства стабилизированных дендримерами КТ
Обнаружено увеличение интенсивности люминесценции после облучения коллоидных квантовых точек ультрафиолетовым светом. Указанный эффект является достаточно выраженным и сохраняется во времени.
Одно из наиболее распространённых предположений механизма этого явления заключается в фотоиндуцированном окислении поверхности ядра квантовой точки с формированием слоёв, состоящих из Cd–OH и SeO2, что приводит к уменьшению его размера. Вследствие зависимости длины волны люминесценции квантовой точки от её размера, уменьшение диаметра нанокристалла селенида кадмия сопровождается характерным смещением положения максимума люминесценции в синюю область спектра. По существующим представлениям, слои Cd–OH и SeO2 также обеспечивают эффективную изоляцию поверхности КТ, что вызывает снижение доли безызлучательных переходов электронов во внешнюю среду. В результате квантовый выход люминесценции нанокристалла повышается.
На взаимодействие КТ с внешней средой оказывают влияние в том числе стабилизирующие нанокристалл в растворе лиганды, непосредственно прикреплённые к поверхности, а также плотность их расположения. По видимому, несмотря на кажущееся плотным экранирование поверхности нанокристалла сначала слоями более широкозонного полупроводника, а затем и стабилизирующими лигандами, ядро КТ способно на непосредственное взаимодействие с элементами внешней среды (в том числе с другими соседствующими КТ) вследствие неполного покрытия и изоляции ядра. В связи с этим, выраженность эффекта фотоактивации зависит от равномерности модификации поверхности КТ, что особенно важно в случае осуществления перевода в другую среду методом замены лигандов, так как из-за равновесного характера процесса замещения возможно неравномерное расположение новых лигандов на поверхности нанокристалла в дополнение к изначально имеющимся дефектам.
Таким образом, изучение эффекта фотоактивации люминесцентных меток позволяет не только установить возможность улучшения их оптических характеристик, но и определить качество изоляции ядра и, соответственно, плотность и равномерность размещения лигандов на поверхности КТ. Последнее представляет особенный интерес ввиду сложности получения подобной информации другими способами, в то время как такой метод проверки даёт возможность грубо оценить качество покрытия нанокристалла. В связи с этим было проведено исследование