Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 11
1.1 Природа, структура и строение волос 11
1.2 Механизм проникновения экзогенных веществ в волосы 16
1.3 Метаболизм и содержание экзогенных веществ в волосах 20
1.4 Химико-токсикологический анализ волос
1.4.1 Отбор проб волос 22
1.4.2 Внешний смыв 23
1.4.3 Отмывка волос от внешних и пото-жировых загрязнений 23
1.4.4 Подходы к изолированию веществ из матрицы волос 26
1.4.5 Очистка экстрактов 29
1.4.6 Дериватизация 36
1.4.7 Методы анализа тетрагидроканнабинола и его метаболита в волосах 39
1.4.8 Методы анализа синтетических каннабиноидов в волосах 41
1.5 Анализ биожидкостей 43
1.5.1 Определение амфетамина в цельной крови 43
1.5.2 Идентификация морфина и кодеина в моче 44
1.5.3 Анализ природных каннабиноидов в моче 46
CLASS Глава 2. Экспериментальная часть
2.1 Оборудование 48 CLASS
2.2 Материалы и реагенты 49
Глава 3. Изучение адсорбции экзогенных веществ на волосах
3.1 Методика выполнения эксперимента 51
3.2 Результаты и обсуждение 53
Глава 4. Разработка подходов к анализу волос
4.1 Определеие условий проведения отмывки волос от внешних загрязнений 59
4.2 Определение условий извлечения экзогенных веществ из матрицы волос 66
4.3 Исследование условий инструментального анализа 77
4.4 Валидация методики химической идентификации стимуляторов, анальгетиков, галлюциногенов и антидепрессантов в волосах методом газовой хроматографии с применением масс-селективного детектирования
4.4.1 Определение предела детектирования и предела количественной оценки 84
4.4.2 Определение линейного участка калибровочной кривой 85
4.4.3 Определение расширенной повторяемости с учетом пробоподготовки 4.5 Создание методики подтверждающего анализа стимуляторов и галлюциногенов в волосах методом ВЭЖХ-МС/МС 90
4.6 Валидация методики подтверждающего анализа стимуляторов (амфетамина, метамфетамина, МДА, МДМА, МДЕА) и галлюциногенов (РСР) в волосах методом ВЭЖХ-МС/МС 92
4.6.1 Определение предела детектирования и предела количественной оценки 93
4.6.2 Определение линейного участка калибровочной кривой 93
4.6.3 Определение расширенной повторяемости с учетом пробоподготовки 4.7 Анализ внешней поверхности волос на ТГК, каннабинол и каннабидиол методом ВЭЖХ-МС/МС 95
4.8 Анализ внутренней области волос на тетрагидроканнабинол и 11-нор-9-тетрагидроканнабиноловую кислоту методом ВЭЖХ-МС/МС 100
4.9 Анализ внешней поверхности волос на наличие синтетических каннабиноидов классов 3-нафтоилиндолы, индол-3-карбоксилаты и индазол-3-карбоксамиды методов ГХ-МС/МС 108
4.10 Анализ внутренней области волос на наличие синтетических каннабиноидов классов 3-нафтоилиндолы, индол-3-карбоксилаты и индазол-3-карбоксамиды методов ГХ-МС/МС 116 Глава 5. Анализ биожидкостей 1
5.1 Разработка методики химико-токсикологического определения амфетамина в крови методом ВЭЖХ-МС/МС 119
5.2 Оптимизация условий обнаружения морфина и кодеина в моче. Поиск критерий отличия употребления морфина и кодеинсодержащих препаратов 122
5.3 Определение ТГК-кислоты в моче с использованием метода ВЭЖХ-МС/МС
6 Выводы 131
7 Список литературы
- Химико-токсикологический анализ волос
- Методы анализа синтетических каннабиноидов в волосах
- Результаты и обсуждение
- Валидация методики подтверждающего анализа стимуляторов (амфетамина, метамфетамина, МДА, МДМА, МДЕА) и галлюциногенов (РСР) в волосах методом ВЭЖХ-МС/МС
Введение к работе
Актуальность: Одной из важнейших задач химико-токсикологического
анализа (ХТА) и судебной медицины является обнаружение в
биологических объектах экзогенных веществ, способных оказывать
активное физиологическое воздействие на организм человека (далее ФАВ).
Такие исследования необходимы, например, при проведении медицинского
освидетельствования водителей на состояние наркотического опьянения, в
ходе мониторинга употребления наркотических средств и психотропных
веществ детьми школьного возраста, для установления причины летального
исхода и при проведении оперативно-розыскных мероприятий,
направленных на борьбу с незаконным оборотом наркотических средств и психотропных веществ.
Объекты исследования, представляющие наибольший интерес, - моча,
кровь и волосы. После употребления вещества сохраняются в крови в
среднем в течение 24-х часов, в моче - до 3х дней, а в волосах от месяца до
нескольких лет, в зависимости от их длины. Основной недостаток мочи –
содержание веществ преимущественно в виде метаболитов. Волосы же
являются одним из наиболее перспективных биологических материалов
химико-токсикологического исследования. Интерес к данному биообъекту
обусловлен также тем, что он не требует особых условий хранения и
содержащиеся в нем экзогенные вещества сохраняются достаточно долго, а
также находятся преимущественно в нативном (неизменном) виде, что
исключает необходимость поиска метаболитов. Однако анализ волос
информативен лишь в случае многократного или хронического
употребления экзогенных веществ.
Анализ мочи и крови позволяет определить даже однократное употребление человеком ФАВ, но в этом случае необходимо проводить определение как исходных соединений, так и их метаболитов. В некоторых же случаях ФАВ может полностью метаболизировать в организме человека. Поиск метаболитов зачастую затруднен ввиду отсутствия аналитических стандартов и образцов сравнения данных соединений.
Одной из наименее охваченных областей в ХТА волос является
определение способа проникновения и удерживание экзогенных веществ в
их структуре, что затрудняет определение условий пробоподготовки волос к
инструментальному анализу. Поэтому для решения вопроса о выборе
способов подготовки данного биообъекта к анализу, необходимо провести исследования степени и механизма адсорбции веществ на поверхности волос и установить характер их взаимодействия.
Основной проблемой обнаружения ФАВ в биообъектах является их
низкое содержание, что требует применения высокочувствительных
методов исследования. Одним из таких методов является хроматомасс-
спектрометрия (ХМС), сочетающая хроматографию (газовую или
жидкостную) и масс-спектрометрию. Наиболее широко в ХТА и судебной
медицине применяется метод газовой хроматографии с масс-селективным
детектированием (далее ГХ-МС). Он отлично подходит для скринингового
анализа, однако, имеет ряд недостатков: низкая чувствительность, сложная
и многоступенчатая пробоподготовка. Для анализа биообъектов методом
ГХ-МС чаще всего используют масс-спектрометр с ионизацией
электронным ударом и квадрупольным фильтром масс. Это позволяет
проводить качественный и количественный анализ на наличие различных
экзогенных веществ органической природы.
Более высокой чувствительностью и специфичностью обладает метод
газовой хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим
детектированием (далее ГХ-МС/МС), он подходит как для скрининговых
исследований, так и для направленного поиска веществ, хотя
пробоподготовка остается такой же сложной. Альтернативным по
селективности, но наиболее чувствительным методом является
высокоэффективная жидкостная хроматография с тандемным масс-
спектрометрическим детектированием (далее ВЭЖХ-МС/МС). Данный
метод не требует такой сложной пробоподготовки, как ГХ-МС. ВЭЖХ-
МС/МС, в отличие от ГХ-МС, используется как подтверждающий метод
анализа, но для него не существует коммерчески доступных универсальных
библиотек масс-спектров. Это приводит к необходимости создавать
собственные методики, методы и библиотеки индивидуально под каждый
прибор. Но благодаря высокой селективности тандемная масс-
спектрометрия нашла широкое применение в ХТА и судебной медицине.
Использование ХМС для анализа волос диктует необходимость
решения вопроса о выборе способа пробоподготовки этого твердого
биообъекта, для чего также необходимо установить характер
адсорбционного взаимодействия экзогенных веществ с матрицей волос.
Цель данной работы: разработка хроматомасс-спектрометрических
методов исследования и определение оптимальных условий
пробоподготовки для анализа наркотических средств, психотропных веществ и лекарственных препаратов (рис. 1) в объектах биологического происхождения.
Рисунок 1. Структурные формулы некоторых наркотических средств, психотропных и лекарственных веществ, анализируемых в биообъектах методами ХМС.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить ряд следующих задач:
-
Разработать методы извлечения наркотических средств (морфин, кодеин, «природные» и «синтетические» каннабиноиды), психотропных (амфетамин, метамфетамин, МДА, МДМА, МДЕА, МДПВ, РСР), сильнодействующих (фентанил, стрихнин) веществ и лекарственных препаратов (карбамазепин, амитриптилин) из матрицы волос.
-
Исследовать адсорбцию (1-пентил-1H-индол-3-ил)-(4-этил-нафталин-1-ил)метанона (далее JWH-210) на поверхности измельченных волос и установить ее закономерности.
-
Разработать и апробировать новые подходы к экспрессному и эффективному экстракционному извлечению целевых веществ из биожидкостей (кровь, моча) для последующего хроматомасс-спектрометрического определения.
-
Оптимизировать инструментальные ХМС методы идентификации целевых веществ.
-
Определить метрологические характеристики разработанных методик анализа наркотических средств, психотропных, сильнодействующих веществ и лекарственных препаратов в биообъектах
Научная новизна: Впервые исследована адсорбция представителя
синтетических каннабиноидов класса нафтоилиндолы на темных и светлых образцах волос. На основании экспериментальных данных по адсорбции JWH-210 выбраны условия извлечения целевых аналитов из матрицы волос.
Химико-токсикологический анализ цельных волос разделен на исследование внешней поверхности и внутренней области. Изучены и экспериментально разработаны подходы к пробоподготовке волос к инструментальному анализу методами ГХ-МС, ГХ-МС/МС и ВЭЖХ-МС/МС.
Впервые проанализированы данные по методам деконтаминации волос, на основании которых предложены четыре методики отмывки внешней поверхности волос.
Предложена универсальная процедура деконтаминации при подготовке
волос к химико-токсикологическому анализу. Установлено влияние
изменения параметров щелочного гидролиза и жидкость-жидкостной
экстракции на степени извлечения наркотических средств (морфин, кодеин,
«природные» и «синтетические» каннабиноиды), психотропных
(амфератмин, метамфетамин, МДА, МДМА, МДЕА, МДПВ, РСР), сильнодействующих (фентанил, стрихнин) веществ и лекарственных препаратов (карбамазепин, амитриптилин) из матрицы волос.
Впервые проведен анализ внешней поверхности волос на наличие
синтетических каннабиноидов различных классов. Определены условия
хроматографического разделения и детектирования каннабиноидов классов
3-нафтоилиндолы, индол-3-карбоксилаты и индазол-3-карбоксамиды
методом ГХ-МС/МС. Предложены органические растворители,
позволяющие избежать процессы метилирования целевых аналитов в инжекторе прибора.
Определены условия хроматографического разделения и
детектирования каннабиноидов классов 3-нафтоилиндолы, индол-3-
карбоксилаты и индазол-3-карбоксамиды методом ГХ-МС/МС. Для каждой
группы синтетических каннабиноидов предложено выделять
характеристический фрагментарный ион. Далее в режиме «Product ion»
проводить скрининговый поиск фрагментов новых представителей
каннабимиметиков на хроматограммах проб волос. Выбраны органические
растворители для пробоподготовки волос, позволяющие избежать
метилирования целевых аналитов в инжекторе прибора.
Показано, что применение ГХ-МС метода не позволяет одновременно идентифицировать наркотическое средство морфин и метаболит кодеина -норкодеин в моче ввиду незначительного отличия их масс-спектров, поэтому определены наиболее информативные ионы и энергии соударения для идентификации морфина, кодеина и норкодеина методом ВЭЖХ-МС/МС в режиме SRM. На основе результатов анализа проб мочи людей, принимавших кодеин и морфин, предложены критерии дифференциации
употребления наркотического средства морфин и кодеинсодержащих лекарственных препаратов.
Предложены подходы к экспрессному высокоэффективному
извлечению органических соединений из биологических жидкостей (моча,
кровь). Экспериментально определены критерии дифференциации
употребления морфина и кодеина по результатам химико-
токсикологического анализа мочи.
Практическая значимость: Разработаны высокочувствительные
методики хромато-масс-спектрометрического определения наркотических средств, психотропных веществ и лекарственных препаратов в различных биологических матрицах.
Разработанные в ходе данной работы методики химической идентификации ФАВ различных классов в объектах биологического происхождения методами ГХ-МС, ГХ-МС/МС и ВЭЖХ-МС/МС (см. Приложение) успешно применяются в практике Института криминалистики Центра специальной техники ФСБ России.
Внедрение данных методик позволяет проводить криминалистические экспертизы объектов биологического происхождения на современном научно-техническом уровне.
Основные положения, выносимые на защиту:
Результаты исследования адсорбции JWH-210 на образцах
измельченных темных и светлых волос, доказывающие наличие
хемосорбции экзогенных веществ матрицей волос.
Разработка эффективных способов пробоподготовки волос, мочи и крови к инструментальному анализу.
Разработка методик обнаружения стимуляторов, анальгетиков,
галлюциногенов, антидепрессантов, а также «природных» и
«синтетических» каннабиноидов в волосах методами ГХ-МС, ГХ-МС/МС и ВЭЖХ-МС/МС.
Разработка методик экспрессного обнаружения наркотических средств, психотропных веществ и лекарственных препаратов в биологических жидкостях методом ВЭЖХ-МС/МС.
Критерии дифференцирования случаев употребления кодеина и опиатов по результатам анализа мочи разработанными методиками.
Достоверность результатов обеспечивается применением поверенного
оборудования, валидированных аналитических процедур, обеспечивающих
воспроизводимость и правильность экспериментальных данных и
подтверждается соответствием полученных результатов современным
теоретическим представлениям.
Апробация результатов исследования. Результаты работы
докладывались на следующих конференциях:
Всероссийская научная конференция молодых ученых «Медико-биологические аспекты химической безопасности», Санкт-Петербург, 2013.
Всероссийская конференция молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием по химии и наноматериалам «Менделеев-2013», «Менделеев-2014», Санкт-Петербург, (2013, 2014).
Молодежная научно-техническая конференция «Наукоемкие
химические технологии - 2013», Москва, МИТХТ, 2013.
Всероссийская научная молодежная школа-конференция «Химия под знаком Сигма: исследования, инновации, технологии», Омск, 2014.
International conference of young scientists on chemistry «Mendeleev-2015», St. Petersburg, 2015.
Публикации. Основное содержание работы отражено в 21 печатной работе, в том числе в 6 научных статьях в журналах, рекомендуемых ВАК, 6 тезисах докладов на международных и российских конференциях и 9 методиках.
Структура и объем работы. Работа изложена на 147 страницах машинописного текста, включающего 38 таблиц и 58 рисунков. Диссертация состоит из введения, двух глав, выводов и списка цитируемых источников, включающего 146 наименования.
Химико-токсикологический анализ волос
Механизм проникновения экзогенных веществ в волосы до конца не изучен. В современной литературе предложены [46] три основных возможных способа инкорпорирования веществ в структуру волос: активная или пассивная диффузия веществ в волос из кровотока, питающего сосочки дермы, на стадии анагена; диффузия веществ из пота, сальных желез или других выделений на этапе выхода волоса на поверхность кожи; адсорбция веществ из окружающей среды (пыль, пары и т.д.).
Важность каждого из предложенных путей проникновения экзогенных веществ в волосы еще не определена. В зарубежной литературе [19, 35] роль диффузии веществ из потовых выделений и из окружающей среды в матрицу волос до конца не уточнена, т.к. описано весьма небольшое количество экспериментов, направленных на изучения этих путей инкорпорирования экзогенных веществ в волосы, а результаты проведенных исследований не однозначны. Однако для оценки времени употребления и дозы конкретного вещества наиболее важным является диффузия из кровотока.
Так как в процессе роста волос происходит достаточно быстрое деление клеток, то волосяная фолликула обильно снабжается кровью. Таким образом, экзогенные вещества, циркулирующие в крови, могут проникать в клетки волос. Но в этом случае существуют некоторые ограничения: через клеточную мембрану из крови могут переходить только липофильные молекулы, не связанные с протеинами матрицы крови [46]. Также на такой переход веществ из крови в волосы влияет рН градиент между плазмой крови и кератинами и меланинами, входящими в состав волос. Установлено [68], что рН плазмы крови 7.3, в то время как рН кератинов и меланинов варьируется в пределах от 3 до 6, что приводит к переходу в матрицу волос веществ основной природы. Вещества же кислотной природы имеют тенденцию к обратному переходу из волосяной матрицы в плазму крови.
Этот факт был доказан на примере диффузии из крови в волосы двух схожих по структуре веществ родамина и флуресцина, обладающих основной и кислотной природой, соответственно [14]. В результате исследований [46] в медуле и кортексе был обнаружен родамин, а флуресцин присутствовал только в некератизированных участках волос. Nakahara Y. и Kikura R. было установлено [61] проникновение в матрицу волос лабораторных животных таких соединений, как амфетамин, N-ацетиламфетамин, кодеин, фенобарбитал, кокаин и бензоилэкгонин. На основании полученных результатов был сделан вывод, что на переход веществ в волосы большее влияние оказывают физико-химические свойства веществ, нежели их концентрация в плазме крови. Ранее было установлено [14], что наиболее значимыми являются такие физико-химические свойства веществ как сродство к меланину, липофильность и основность. Некоторые авторы [46] отмечают, что чем более вещества липофильны и основны, тем они лучше проникают в обогащенные меланином волосы и удерживаются в них.
Первые работы [61, 62], посвященные исследованиям связывания экзогенных соединений с меланинами волос, были проведены несколько десятилетий назад. С тех пор в этой области было проведено много исследований и сделано много предположений и выводов. Bridelli M.G., Ciati A. и Crippa P.R. было установлено [14], что с меланинами вещества могут связываться как в молекулярной, так и в ионной форме. Способностью меланина связываться с экзогенными веществами различной природы обуславлены самые сильные механизмы удерживания веществ в организме. Однако в работе [46] установлено, что лучше всего с меланинами связываются вещества, содержащие в своей структуре аминогруппы, ввиду их электростатического притяжения с карбоксильными группами, расположенными на поверхности полимера из меланинов. Также связь с меланинами усиливается силами Ван-дер-Ваальса, возникающими между ароматическими кольцами аминов и индольными кольцами полимеров меланинов. Исследователями [14] был проведен эксперимент по установлению видов изотерм адсорбции, описывающих адсорбцию веществ различной природы на подложку из меланинового полимера. Было установлено, что адсорбция на поверхности меланина может быть описана четырьмя моделями: Лэнгмюра, Фрейндлиха, Темкина и Дубинина-Радушкевича. Изотерма адсорбции Лэнгмюра соответствует адсорбции на специфичные гомогенные поверхности, изотерма Фрейндлиха описывает адсорбцию на гетерогенных поверхностях, изотерма Темкина учитывает эффекты непрямых взаимодействий адсорбат-адсорбент, а изотерма Дубинина-Радушкевича описывает адсорбцию различных соединений на различные типы поверхностей.
Было доказано, что на вид изотермы адсорбции на меланине влияют физико-химические свойства и геометрические характеристики молекул. Так, гентамицин (хорошо растворимое в воде основание) показал самую высокую степень адсорбции на подложке меланина и соответствовал модели изотермы адсорбции Фрейндлиха[14]. Метотрексат (практически нерастворим в воде, кислой природы) соответствовал изотермам адсорбции Лэнгмюра и Дубинина-Радушкевича. И, наконец, хлорпромазин (растворимость в воде 0,4 г/л и рКа = 9,3) соответствовал как изотерме Лэнгмюра, так и Темкина[14].
Nakahara Y. и Kikura R. [61] было изучено влияние строения молекул амфетаминового ряда на их инкорпорирование в матрицу волос. Для этого был проведен эксперимент с использованием лабораторных животных с пигментированной шерстью, которым вводили анализируемые вещества внутривенно и через месяц анализировали их шерсть. Авторами был введен так называемый индекс ICR, характеризующий соотношение концентрации вещества, инкорпорированного в волосы, и площади под кривой зависимости содержания данного вещества в крови от времени его введения в организм животного.
Влияние структуры радикала при атоме азота на индекс ICR [61]. Таким образом, определено влияние длины цепи и строения радикала при атоме азота в молекулах амфетаминового ряда.
Из рисунка 1.2.1 видно, что с увеличением длины алкильной цепи при атоме азота (С3 C2 C1 H) индекс ICR увеличивается. Также установлено, что бензольное или фурановое кольца при атоме азота способствуют увеличению индекса ICR, но эффект фуранового кольца слабее.
Была проведена оценка влияния строения аминогруппы (первичный, вторичный или третичный амин) в ряду эфедринов (фенилпропаноламин (PPA), эфедрин (EP), метилэфедрин (MEP)) и амфетаминов (амфетамин, метамфетамин, диметиламфетамин (DMA)). Сравнение индекса ICR внутри групп показало, что идет его уменьшение в ряду вторичный первичный третичный амин (рис. 1.2.2 а). Хотя объяснение этому еще не найдено, вероятно, это может быть связано с изменением значения рКа.
Методы анализа синтетических каннабиноидов в волосах
В работе использовалось следующее оборудование: Газовый хроматограф «5890», оборудованный системой автоматического ввода пробы, соединенный с одноквадрупольным масс-спектрометром «5975С» фирмы «Agilent Technologies» (США). Газовый хроматограф оснащен колонкой DB-5MS размером 30 м х0.25 мм, диаметром частиц сорбента 0.25 мкм.
Высокоэффективный жидкостной хроматограф «Accela», оборудованный системой автоматического ввода пробы, с тройным квадрупольным масс-анализатором «TSQ Quantum Access МАХ» фирмы «Thermo Scientific» (США). Колонки для жидкостного хроматографа выбирали в зависимости от анализируемых соединений.
Газовый хроматограф модели «7890», оборудованный системой автоматического ввода пробы, соединенный с квадрупольным масс-спектрометром модели «7000А» фирмы «Agilent Technologies» (США). Газовый хроматограф оснащен колонкой HP-5MS размером 30 м х0.25 мм, диаметром частиц сорбента 0.25 мкм.
Высокоэффективный жидкостной хроматограф серии 1200 фирмы "Agilent Technologies" (США), оборудованный системой автоматического ввода пробы и соединенный с трехквадрупольным масс-селективным детектором TSQ Quantum фирмы "Thermo Scientific" (США). Колонки для жидкостного хроматографа выбирали в зависимости от анализируемых соединений.
Весы лабораторные АВТ - 5М, с пределом допускаемой абсолютной погрешности не более ± 0,01 мг, фирмы Kern (Чехия). Дозаторы пипеточные переменного объема (0,01 - 5 см3), фирмы «Biohit» (Финляндия), ГОСТ 28311-89. Микрошприц переменного объема (0,1 - 100 см3), фирмы «Agilent Technologies» (США). Минишейкер Reax control со сменными приспособлениями для установки емкостей различного диаметра, фирмы «Heidolph» (Германия). Центрифуга Centrifuge 5810R, фирмы «Eppendorf» (Германия). Испаритель под током азота D-33649 Bielefild, фирмы «Liebisch Labortechnik» (Германия). Сушильный шкаф FD 115, фирмы «BINDER» (США). Станция водоподготовки, Milli-Q Integral 3, обеспечивающая получение деионизированной воды с остаточным сопротивлением 18 МОм/см (25 С) и содержанием общего углерода 30 ppb (мкг/дм3), фирмы «Millipore» (Франция).
Фото объектов получены с помощью стереомикроскопа Dynascope Lynx фирмы «Vision Engeneering» (Великобритания) и фотоаппарата Nikon D 5000.
Параметры пористой структуры образцов волос и их удельная поверхность были определены из изотерм адсорбции паров азота при 77 К, измеренных на автоматической вакуумной установке ASAP-220MP фирмы Micromeritics (USA).
В работе использовались: Исследуемые вещества в следующих видах: 1. аналитический стандарт - метанольный раствор с массовой концентрацией 1,00±0,05 мг/см3: морфина гидрохлорид, кодеина гидрохлорид, амфетамин, МДМА («ФГУП ГосНИОХТ»); 2. аналитический стандарт - метанольный раствор с массовой концентрацией 0,10±0,05 мг/см3: фентанил («ФГУП ГосНИОХТ»); 3. аналитический стандарт - порошок с чистотой 99,0 %: МДЕА, МДА, метамфетамин, мефедрон, метадон, РСР, фампрофазон, стрихнин; 4. медицинские препараты - таблетки с содержанием действующего вещества 10 мг чистотой 99,0 %: амитриптилин, карбамазепин; 5. образцы сравнения РВ-22, PB-22F, NM-2201, QCBL-BZ-F, THJ-2201, АМ-1220 AB-Pinaca-F, AB-Chminaca, AB-Fubinaca, AB-Pinaca, AM-2201 и JWH-210 («Cayman Chemica») с чистотой не ниже 98,0 %; 6. 11-нор-А9-тетрагидроканнабиноловая кислота - аналитический стандарт, фирмы «Пика» (США), кат. № 39382. Для каждого целевого вещества ГОТОВИЛИ рабочие метанольные растворы с концентрацией аналита 100 мкг/см3. Органические растворители: гексан «Sigma-Aldrich» (США) кат. № 34859-lL; метанол «Merck» (Германия) кат. № 1.06035.2500; этилацетат «Sigma-Aldrich» (США) кат. № 270989; эфир метилтретбутиловый «Merck» (Германия) кат. № 1.01845.2500; изопропанол «Fluka» (США) кат. № 34965; ayeTOfflrrpmi«Sigma-Aldricli» (Германия) кат. № 34967; хлороформ «Sigma-Aldrich» (Германия) кат. № 372978; диэтиловый эфир «Acros» (Германия) кат. № 11790.
Химические реактивы: N-methyl-bis(trifluoroacetamide), «Sigma-Aldrich» (США) кат. № M0789-5ML; калия гидроксид, «Sigma-Aldrich» (США) кат. № 656054-6xlL; соляная кислота «Sigma-Aldrich» (США) кат. № 84415-100ML; кислота муравьиная 99% «Ч» ГОСТ 5848-73; дихромат калия «Sigma-Aldrich» (США) кат. № P5271-2KG; серная кислота «Sigma-Aldrich» (США) кат. № 320501; додецилсульфат натрия «Merck» (Германия) кат. № 8.22050.0100; гелий газообразный марки А ТУ 51-946-80; магния сульфат безводный «Merck» (Германия) кат. № 1.06067.1000; натрия ацетат безводный «Sigma-Aldrich» (Германия) кат. № S2889; сорбент С18 «Agilent Technologies» (США) кат. № 12213012; сорбент PSA «Agilent Technologies» (США) кат. № S2002; глюкуронидаза из E.coli «Roche» (Германия) кат. № 3707601001; натрия сульфат безводный «Sigma-Aldrich» кат. № 238597; натрия гидрофосфат 12-водный «Sigma-Aldrich» кат. № 71636; калия дигидрофосфат безводный «Sigma-Aldrich» кат. № 60218; азид натрия «Sigma-Aldrich» кат. № S2002; карбонат калия «Sigma-Aldrich» кат. №209619; калия гидрокарбонат «Sigma-Aldrich» кат. № 237205.
Колонки для ВЭЖХ: Hypersil Gold Biphenyl размером 75x4.6мм, с диаметром частиц сорбента 3.5мкм «Thermo Scientific» (США); Hypersil Gold Biphenyl размером 50x4.6мм, с диаметром частиц сорбента 1.9мкм «Thermo Scientific» (США); Zorbax Eclipse Plus C18 размером 2.1 мм х 150 мм с диаметром частиц сорбент1.8 мкм (Agilent, США).
Колонки для ГХ: HP-5MS и DB-5MS размерами 30 м х0.25 мм, толщина неподвижной фазы 0.25 мкм (Agilent, США).
Во всех экспериментах использовалась ультрачистая вода, полученная с использованием системы Milli-Q Integral 3 «Millipore» (Франция).
Фильтрование подвижной фазы осуществлялось при использовании системы для фильтрации элюентов фирмы Agilent с нейлоновым мембранным фильтром диаметром 45мм и размером пор 0,45 мм.
Результаты и обсуждение
Альтернативным ГХ-МС инструментальным методом анализа является ВЭЖХ-МС/МС. Данный метод обладает более высокой чувствительностью и специфичностью. Поэтому пределы количественного определения разработанной методики химической идентификации стимуляторов, анальгетиков, галлюциногенов и антидепрессантов в волосах методом ГХ МС могут быть снижены путем использования ВЭЖХ-МС/МС. Таким образом, можно получить высокочувствительные методики подтверждающего анализа ксенобиотиков в волосах. В этих целях была разработана методика подтверждающего анализа стимуляторов (амфетамин, метамфетамин, МДА, МДМА, МДЕА) и галлюциногенов (РСР) методом ВЭЖХ-МС/МС.
Определение условий подготовки волос к анализу проводили путем оценки данных, полученных в п. 4.2. Так для стимуляторов и галлюциногенов наиболее оптимальные условия щелочного гидролиза -выдержка в 1 N растворе КОН в воде при температуре 60С в течение часа. Экстракцию целевых веществ лучше проводить метилтретбутиловым эфиром с последующим упариванием в присутствии 1 % раствора соляной кислоты в метаноле. Сухие остатки целесообразно растворять в метаноле для последующего инструментального анализа. Применение ВЭЖХ-МС/МС также позволяет исключить из пробоподготовки волос стадию дериватизации, что заметно снижает общее время анализа проб.
Для проведения исследований использовали высокоэффективный жидкостной хроматограф Accela с тройным квадрупольным масс-анализатором TSQ Quantum Access MAX фирмы Thermo Scientific (США). Хроматографирование проводили в градиентном режиме на колонке Hypersil
Gold C-18 длиной 50 мм, внутренним диаметром 4,6 мм и размером частиц сорбента 1,9 мкм. В качестве подвижной фазы использовали смесь 0,1 % раствора муравьиной кислоты в метаноле (компонент А) и 0,1 % раствора муравьиной кислоты в деионизированной воде (компонент Б). Состав подвижной фазы изменяли следующим образом: начальное содержание компонента А – 5 % с последующим его повышением до 100% к восемнадцатой минуте и поддержанием данного соотношения компонентов до двадцать третьей минуты. Скорость потока подвижной фазы – 150 мкл/мин. Температура термостата колонки - 40С.
Детектирование проводили в режиме мониторинга единичных реакций (SRM). Полярность детектируемых ионов – положительная. Метод ионизации – электрораспыление. Использовали следующие настройки масс-анализатора: напряжение на капилляре – 3500 В, давление газа-распылителя – 30 psi, давление вспомогательного газа – 5 psi, время сканирования – 0,010 с, количество микросканов - 15. Выбор условий детектирования, обеспечивающих максимальную чувствительность, проводили в несколько этапов. Первоначально были исследованы в режиме сканирования метанольные растворы концентрацией 1мкг/мл стандартных образцов амфетамина, метамфетамина, МДА, МДМА, МДЕА и РСР и определены их времена удерживания и молекулярные ионы. Далее для каждого аналита измерены спектры дочерних ионов при разных энергиях столкновения в диапазоне от 5 до 40 эВ с шагом 5 эВ и выбраны три дочерних иона с наилучшими соотношениями сигнал/шум на соответствующих им ионных хроматограммах. Затем определены энергии соударения, при которых эти дочерние ионы имели наибольшую интенсивность. Определенные таким образом условия сканирования и времена выхода всех аналитов представлены в таблице 4.5.1.
Условия сканирования и времена выхода целевых аналитов Исследуемое вещество RT, мин Мол. масса Молекулярный ион Дочерние ионы,m/z Энергиясоударениядля данногоиона,В Амфетамин 6,58 135,2 136,2 [М-Н]+ 119,29 91,2865,35 10 1530 Метамфетамин 6,91 149,2 150,2[М-Н]+ 119,2391,1565,38 15 20 40 МДА 6,90 179,2 180,3 [M+H]+ 163,56 135,53 105,3979,52 1520 20 30 МДМА 7,13 193,2 194,3 [M-H]+ 163,20133,22 105,2577,23 10 20 30 30 МДЕА 7,52 207,3 208,4 [M-H]+ 163,50135,22 133,30 520 20 РСР 9,45 243,4 244,3 [M-H]+ 159,21 86,12 91,09 15 1535 Таким образом, разработана методика подтверждающего анализа стимуляторов (амфетамина, метамфетамина, МДА, МДМА, МДЕА) и галлюциногенов (РСР) в волосах методом ВЭЖХ-МС/МС. Время, требуемое на анализ одной пробы волос по данной методики, значительно меньше, чем при использовании ГХ-МС и составляет 4 часа.
Валидация методики подтверждающего анализа стимуляторов (амфетамина, метамфетамина, МДА, МДМА, МДЕА) и галлюциногенов (РСР) в волосах методом ВЭЖХ-МС/МС Валидацию методики проводили в три этапа, аналогичные описанным в пункте 4.4. В качестве целевых аналитов были использованы представители стимуляторов – амфетамин и МДМА.
Готовился пакет проб, отобранных из 5 заранее отмытых от посторонних внешних загрязнителей образцов волос людей, не употреблявших анализируемые вещества (в дальнейшем — "бланковых проб"). Каждую из бланковых проб делили на 3 части (соответствующие 3 содержаниям анализируемых веществ) массой по 100 мг каждая. Путем добавления к ним стандартных растворов аналитов в разных количествах готовили контрольные пробы волос с различными содержаниями целевых аналитов, указанными в таблице
Как видно из таблицы 4.6.1.1 при содержании анализируемых веществ 5 пг/мг не наблюдалось пиков амфетамина в 3 образцах из 5 и МДМА – в 2 образцах из 5. Во всех пробах с содержанием амфетамина и МДМА 10 пг/мг и 15 пг/мг присутствовали пики анализируемых веществ с соотношением сигнал/шум не менее 3. Таким образом, пределы детектирования по амфетамину и МДМА составили 10 пг/мг. Согласно руководству по исследованию волос [54, 67], предел обнаружения амфетамина и МДМА в волосах должен быть не менее 0,1 нг/мг. Достигнутый предел обнаружения разработанной методики превосходит требуемый в 10 раз. Методику можно считать прошедшей проверку на чувствительность обнаружения вещества, поскольку предел детектирования не превысил 10 пг/мг. Предел количественной оценки рассчитывали путем умножения величины предела детектирования на 10, что составляет 100 пг/мг для амфетамина и МДМА.
Валидация методики подтверждающего анализа стимуляторов (амфетамина, метамфетамина, МДА, МДМА, МДЕА) и галлюциногенов (РСР) в волосах методом ВЭЖХ-МС/МС
Для извлечения из матрицы волос стимуляторов, наркотических анальгетиков и антидепрессантов были определены следующие оптимальные условия щелочного гидролиза: выдержка образца в 1,5 N растворе КОН при 60С в течение часа. Согласно литературным данным [122], для щелочного гидролиза волос при определении в них ТГКК используют 1,0 N раствор щелочи при 95С в течение 10-15 минут. Применение таких условий связано с нестабильностью молекулы ТГКК в щелочной среде. В результате экспериментального сравнения этих двух методов деструкции волос установлено, что степень извлечения (тгкк) по первой схеме (41,8%) ниже, полученной по второй схеме (86,4%), в два раза, кроме того времени на проведение пробоподготовки по второму способу требуется в 4 раза меньше. Для исследования зависимости степени извлечения от концентрации используемой щелочи, сравнивали эффективность гидролиза раствором КОН с концентрациями 0.5, 1.0 и 1.5 моль/л (см. табл. 4.8.2). Установлено, что максимальная степень извлечения достигается при использовании 1,0 N раствора щелочи (тгкк=53,3%), а минимальное - при 1,5 N (тгкк=34,0%). Следует отметить, что при использовании 0,5 N КОН (тгкк=42,0%) в случае образца жестких волос деструкция происходит не полностью. Оценка применения гексановой чистки показала, что ввиду высокой липофильности ТГКК, такой подход резко снижает степень извлечения аналита до 9,5%.
Для экстракции целевого вещества из гидролизата обычно используют смесь гексан:этилацетат. Выше показана эффективность использования такой смеси в соотношении 2:1 для стимуляторов, наркотических анальгетиков и антидепрессантов. Для ТГКК ввиду ее более высокой липофильности была исследована эффективность смесей гексан:этилацетат в соотношении 1:1, 2:1, 3:1, 4:1 и 5:1 соответственно. Результаты исследований зависимости степени извлечения от соотношения растворителей в экстрагенте представлены на рис. 4.8.2
Из рис. 4.8.2 следует, что при соотношении гексан:этилацетат 5:1 достигается наибольшая степень извлечения ТГКК. Так как ТГК обладает близкой к ТГКК липофильностью, то данный экстрагент может быть успешно использован для извлечений обоих соединений.
Следует также отметить, что в случае применения смесей с соотношением 1:1 и 2:1 на хроматограммах наблюдали большое количество пиков интерферирующих соединений. Оптимизированные для ТГКК и ТГК схемы пробоподготовки волос представлены на рисунке 4.8.3.
Определение линейного участка калибровочной кривой. Определение повторяемости времени удерживания ТГКК. Определение повторяемости количественного определения ТГКК с учетом погрешности прибора и пробоподготовки. В результате установлено: ПД = 50 пк/мг, ПКО = 500 пг/мг, линейный участок калибровочной кривой составляет 0,05-5 нг/мг (см. рис. 4.8.4), погрешность времени удерживания ТГКК не превысила 0,3 %, а повторяемость составила 18,5 %. Полученный уровень ПД удовлетворяет требованиям Всемирного общества анализа волос (SOHT) к пределам обнаружения каннабиноидов в волосах [23].
Разработанная методика удовлетворяет требованиям ГОСТ Р 8.563-2009, предъявляемым к методикам измерения в Российской Федерации, и стала применяться в экспертной практике Института криминалистики Центра специальной техники ФСБ России. Успешно проведена апробация разработанной методики с использованием волос человека, эпизодически употреблявшего марихуану. Хроматограмма пробы представлена рис. 4.8.5а. Общее время, которое требуется на анализ одной пробы волос по данной методике, составляет не более 3х часов. Анализ внешней поверхности волос на наличие синтетических каннабиноидов классов 3-нафтоилиндолы, индол-3-карбоксилаты и индазол-3-карбоксамиды методов ГХ-МС/МС Одной из важных проблем в области химико-токсикологических исследований на сегодняшний день являются так называемые «синтетические каннабиноиды» или «каннабимиметики». Данные соединения являются веществами синтетического происхождения и получили такое название за их способность связываться с СВ1 и СВ2 (каннабиноидными) рецепторами ЦНС. Таким образом, каннабимиметики должны обладать схожими токсикологическими свойствами с природными каннабиноидами (9-тетрагидроканнабинол, каннабинол и каннабидиол – компоненты конопли). В мире уже синтезировано большое количество таких веществ и их химические структуры весьма разнообразны.
Основная сложность химико-токсикологических исследований вышеуказанных веществ заключается в том, что их токсическое действие и метаболизм до конца не изучены, а разовые дозы очень малы по сравнению с их природными аналогами. Так как экзогенные вещества поступают в волосы преимущественно в нативном виде, это делает данный вид биообъекта наиболее перспективным для проведение химико-токсикологического анализа на наличие синтетических каннабиноидов.
В литературе [104, 118, 120] описаны исследования только внутренней области волос. В качестве инструментальных методов применяются методы ГХ-МС и ВЭЖХ-МС/МС. Используемый в работе [120] ГХ-МС – наиболее распространенный метод анализа волос, но менее чувствительный и селективный, чем ВЭЖХ-МС/МС. В то же время последний – весьма дорогостоящий. Альтернативным ВЭЖХ-МС/МС методом может служить газовая хроматография с тандемным масс-спектрометрическим детектированием (ГХ-МС/МС). В работах [110, 127] представлено успешное применение данного метода для анализа целевых соединений в моче, поэтому представлялось интересным исследовать возможности его использования для анализа волос.
В ходе исследований в качестве аналитов были использованы представители наиболее широко распространенных классов синтетических каннабиноидов: 3-нафтоилиндолов, индол-3-карбоксилатов и индазол-3-карбоксамидов. Инструментальный анализ проводили на оборудовании компании Agilent Technologies, состоящем из газового хроматографа модели 7890 и трехквадрупольного масс-селективного детектора модели 7000А. 108 Хроматограф был оснащен хроматографической колонкой HP-5MS длиной 30 м, диаметром 0,25 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 мкм. Выбор хроматографической колонки осуществлялся на изучении характеристик существующих коммерческих образцов, областей их применения и сравнения с существующими аналогами, а также на изученных литературных данных [118, 120]. Объем вводимой пробы составлял 1 мкл и проводился с помощью автосамплера в режиме деления потока в соотношении 10 : 1. Температура инжектора и интерфейса составляла 280 С. Скорость потока газа-носителя (гелий) – 1,0 мл/мин. Температурный режим работы термостата хроматографа был подобран на модельной смеси растворов сравнения имеющихся соединений и представлен в табл. 4.9.1