Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Квантово – размерные свойства квантовых точек 12
1.2. Оптические свойства квантовых точек 14
1.3. Синтез коллоидных квантовых точек 17
1.4. Гидрофилизация поверхности квантовых точек
1.4.1. Метод замены лигандов 20
1.4.2. Метод покрытия амфифильными молекулами 24
1.5. Применение квантовых точек в качестве меток для определения микотоксинов 27
Глава 2. Экспериментальная часть 32
2.1. Реактивы для синтеза и модификации квантовых точек 32
2.2. Реактивы для проведения иммунохимического анализа. 33
2.3. Характеристика свойств квантовых точек 34
2.4. Синтез конъюгатов для проведения иммуноанализа 36
2.5. Методика проведения твердофазного иммунофлуоресцентного анализа на полистирольных микропланшетах 37
2.6. Методика проведения твердофазного иммунофлуоресцентного анализа на полиэтиленовых фритах 37
Глава 3. Синтез квантовых точек структуры ядро-оболочки 39
3.1. Синтез ядер селенида кадмия 39
3.2. Синтез квантовых точек типа ядро-оболочка 41
Глава 4. Покрытие квантовых точек оболочками диоксида кремния 46
4.1. Изучение влияние скорости замены лигандов на люминесцентные свойства квантовых точек 46
4.2. Разработка метода силанизации квантовых точек 49
4.3. Выбор оптимальной структуры квантовых точек для силанизации 52
4.4. Модификация полученных квантовых точек различными функциональными группами 57
4.5. Повышение стабильности модифицированных квантовых точек 63
Глава 5. Влияние электрического поля на стабильность люминесценции квантовых точек 66
5.1. Гидрофилизация квантовых точек с помощью амфифильного полимера 69
5.2. Изучение влияния электрического поля на люминесцентные свойства квантовых точек 72
Глава 6. Разработка иммунохимических методов определения дезоксиниваленола с применением квантовых точек в качестве люминесцентных меток 77
6.1. Конъюгация квантовых точек со вторичными антителами 81
6.2. Разработка иммунофлуоресцентного анализа для определения дезоксиниваленола 86
6.3. Разработка иммунофлуоресцентного тест метода для определения дезоксиниваленола 92
Выводы 96
Список литературы 98
- Оптические свойства квантовых точек
- Применение квантовых точек в качестве меток для определения микотоксинов
- Методика проведения твердофазного иммунофлуоресцентного анализа на полистирольных микропланшетах
- Модификация полученных квантовых точек различными функциональными группами
Введение к работе
Актуальность исследования. Методы, основанные на использовании в анализе люминесцентных меток, позволяют детектировать низкие концентрации определяемых веществ (вплоть до определения единичных структур) в самых разнообразных форматах анализа. Воспроизводимость и чувствительность этих методов в существенной степени определяются качеством используемых меток. Квантовые точки (КТ) - полупроводниковые люминесцентные нанокристаллы - на сегодняшний день вытесняют традиционно используемые органические флуорофоры в силу уникальных оптических свойств. Зависимость цвета эмиссии от состава и размера нанокристаллов позволяет синтезировать КТ с необходимыми эмиссионными свойствами; высокая яркость и фотостабильность дают возможность проводить длительное наблюдение за меткой и детектировать единичные КТ.
Синтез КТ изучен и освещен достаточно широко в научной литературе, показано, что наилучшие результаты по яркости, стабильности и однородности по размерам дает высокотемпературный коллоидный синтез в органическом растворителе. Кроме того, для применения в анализе КТ должны образовывать водные коллоиды, стабильные при различных рН, а также иметь функциональные группы для связывания с биомолекулами, например, с антителами.
В связи с этим получение ярких люминесцентных КТ методом высокотемпературного органического синтеза и придание им гидрофильных свойств, а также модификация поверхности различными функциональными группами для их последующего применения в анализе являются актуальными.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является получение, силанизация и функционализация люминесцентных меток на основе нанокристаллов селенида кадмия структуры ядро-оболочка, и их применение в качестве люминесцентных меток в иммунохимическом анализе. Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
разработать методику покрытия КТ с разным цветом свечения оболочкой диоксида кремния;
оценить стабильность полученных наночастиц во внешнем электрическом поле и сравнить влияние внешнего покрытия на характеристики люминесценции;
- оптимизировать методики функционализации поверхности полученных
люминесцентных меток с помощью амино-, карбокси- и глицидокси- содержащих
органосиланов;
- повысить буферную стабильность меток с помощью модификации
поверхности полиэтиленгликолем (ПЭГ) для дальнейшей биоконъюгации;
- осуществить конъюгирование полученных меток с вторичными
антителами с использованием различных путей активации функциональных
групп, а также варьируя соотношение люминесцентная метка – антитело;
- разработать методику твердофазного иммунофлуоресцентного
определения микотоксина дезоксиниваленола (ДОН), используя синтезированную
люминесцентную метку, в микропланшетном и колоночном вариантах и сравнить
их чувствительность.
Методы исследования. Для решения поставленных в работе задач применяли комплекс физических методов исследования (фотолюминесценция, УФ- и видимая абсорбционная спектроскопия, методы динамического рассеяния света, электронная микроскопия, гель-электрофорез) и иммунохимических методов (твердофазный иммунохимический анализ на полистирольных микропланшетах, иммунохимические тест-колонки с полиэтиленовыми фритами в качестве носителей).
Научная новизна состоит в следующем:
разработана методика перевода КТ из органического растворителя в водные растворы с сохранением оптических свойств с помощью силанизации в обратной микроэмульсии;
оптимизированы методики функционализации поверхности полученных наночастиц карбокси-, амино- и глицидокси- функциональными группами;
показана возможность повышения буферной стабильности полученных частиц за счет комбинирования функциональных групп с ПЭГ фрагментами;
впервые изучена стабильность водных растворов КТ во внешнем электрическом поле;
впервые показано применение КТ, покрытых оболочками диоксида кремния, в качестве люминесцентных меток для твердофазного иммунофлуоресцентного определения ДОН.
Практическая значимость работы.
В результате проведенных исследований были разработаны методики получения стабильных в водных растворах КТ с разными цветами эмиссии и высокими квантовыми выходами (КВ). Разработаны методики функционализации поверхности полученных наночастиц, а также подход к повышению их буферной стабильности. Охарактеризована стабильность гидрофильных КТ во внешнем электрическом поле. Показано, что полученные КТ могут быть использованы в
качестве меток в твердофазном иммунофлуоресцентном анализе, как в планшетном, так и в колоночном вариантах.
На защиту автор выносит:
Оптимизированную методику получения функционализированных гидрофильных КТ, покрытых оболочкам диоксида кремния;
Результаты исследования зависимости интенсивности люминесценции полученных КТ от приложенного внешнего электрического поля;
Новый подход к комбинированию функциональных групп и ПЭГ фрагментов на поверхности наночастиц;
Разработанные иммунохимические методы с применением КТ в качестве люминесцентных меток.
Личный вклад соискателя заключается в постановке задач исследования, выборе методов синтеза и модификации КТ, разработке методики силанизации КТ, апробации полученных люминесцентных меток для определения микотоксинов, непосредственном проведении экспериментов, обобщении и анализе полученных результатов, формулировании выводов, написания научных статей.
Публикации. По теме данного исследования опубликовано 30 печатных работ: 9 статей в журналах, рекомендованных ВАК, 4 статьи в трудах международных конференций, 16 тезисов докладов, из них - 8 на Международных конференциях; получено решение о выдаче патента на изобретение.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлены на следующих конференциях: Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов 2011» (Россия, Москва, 2011), Всероссийская научная школа-семинар «Методы компьютерной диагностики в биологии и медицине - 2012» (Россия, Саратов, 2012), Всероссийская школа-конференция «Химия биологически активных веществ» молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием «ХимБиоАктив-2012» (Россия, Саратов, 2012), Saratov Fall Meeting SFM’12, 13,14: International School for Junior Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophotonics (Россия, Саратов, 2012, 2013, 2014), VII международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Россия, Москва, 2013), Vth International workshop on “Nanoparticles, nanostructured coatings and microcontainers: technology, properties, applications” (Бельгия, Гент, 2014), 35th Mycotoxin Workshop (Бельгия, Гент, 2014), XVII International Conference on Quantum Dots
(Великобритания, Лондон, 2015), 5th International Symposium on Mycotoxins and Toxigenic Moulds: Challenges and Perspectives (Бельгия, Гент, 2016), 26th Anniversary World Congress on Biosensors (Швеция, Гетебург, 2016).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (4 главы), выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 126 ссылок. Работа изложена на 114 страницах, содержит 42 рисунка и 15 таблиц.
Финансовая поддержка работы осуществлялась специальным проектом Ghent University, Joint PhD program (Project 01SF3012), а также проектами РНФ (14-13-00229), МОН (4.1708.2014), ФЦП (14.574.21.0128), программой У.М.Н.И.К. (№ 2450ГУ2/2014).
Оптические свойства квантовых точек
Среди различных требований, предъявляемых к современному химическому анализу, одним из наиболее важных является специфичность, то есть способность детектировать данное вещество в сложных многокомпонентных системах, таких, как сыворотка крови, соки растений, сточные воды. В этой связи широкое распространение получили иммунохимические методы анализа (ИХА). ИХА основаны на специфическом связывании определяемого соединения с соответствующими антителами, поскольку антитела способны проявлять высокую специфичность и афинность по отношению к определяемому веществу [49].
Детектирование образовавшегося комплекса в растворе осуществляют введением метки в один из исходных компонентов реакционной системы. Метку детектируют соответствующим высокочувствительным физико-химическим методом. Методы ИХА можно классифицировать согласно используемой метке. Так, различают радиологический иммуноанализ, где меткой служит радиоактивный изотоп; флуороиммуноанализ, в котором применяются флуоресцентные метки; иммуноферментный анализ (ИФА), где в качестве метки используется фермент; и методы, основанные на использовании наночастиц в качестве метки (например, наночастицы золота или магнитные наночастицы), позволяющий реализовать различные варианты детектирования.
КТ – достаточно новый тип меток, используемых в ИХА. Как было отмечено ранее, уникальные оптические свойства КТ создают перспективы для чувствительного определения аналитов [50, 51].
Возможность определения нескольких аналитов на сегодняшний день является огромным достоинством любого аналитического метода. Так, например, микотоксины – низкомолекулярные вторичные метаболиты, продуцируемые микроскопическими плесневыми грибами, никогда не встречаются в индивидуальном виде. Это объясняется тем, что различные микотоксины продуцируются одним и тем же видом плесени (рисунок 10), таким образом, один микотоксин всегда сопутствует нескольким другим.
Согласно поисковой платформе Web of Science, за последние 20 лет было опубликовано около 100 статей, описывающих люминесцентный ИХА для определения микотоксинов. В подавляющем большинстве в качестве меток использовались органические флуорофоры. Однако в 2011 году появилась первая статья, описывающая ИХА с использованием КТ в качестве меток для определения микотоксина охратоксина А в красном вине с использованием коммерческих КТ (таблица 2). С тех пор было опубликовано не более 20 статей, посвященных данной теме. Однако чувствительность методик и легкость визуализации результатов анализа открывает огромные перспективы ИХА с использованием КТ в качестве меток. Более того, некоторые форматы анализа позволяют проводить определение внелабораторно, в полевых условиях, что является неоспоримым достоинством при анализе микотоксинов, поскольку они могут загрязнять продукты как во время их произрастания, так и во время хранения.
Существующие методы ИФлА анализа микотоксинов с использованием КТ в качестве меток можно условно разделить на несколько групп, в зависимости от формата иммуноанализа и аналитического сигнала, который детектируют в результате анализа. В работе [65] КТ на основе PbS, стабилизированных в водных растворах с помощью тиогликолиевой кислоты, использовали как электрохимические метки в ИХА микотоксина афлатоксина Б1 в образцах арахиса. Данный подход позволил достичь высокой чувствительности, определяя концентрации вплоть до 0,018 нг/мл, что является неоспоримым достоинством метода, поскольку афлатоксин Б1 является высокотоксичным и канцерогенным веществом. В работах [58, 59] для определения афлатоксина Б1 использовали КТ различной структуры, при этом детектировали сигнал ферстеровского резонансного переноса энергии.
В работах [56, 57] описана разработка и использование иммунохроматографических тест-полосок для определения фумонизина Б1 и охратоксина в различных матрицах. Такой подход позволяет создавать чувствительные мобильные тест-системы для скрининг-анализа.
Другой вариант иммунохимической тест системы – колоночный тест-метод - представлен в работах [60-64]. В данных работах использовали КТ различного строения, гидрофилизированные с помощью амфифильных полимеров, меркаптоуксусной кислотой и КТ, загруженные в липосомы. Показано, что данный подход позволяет детектировать различные микотоксины по отдельности, а также комбинации микотоксинов, продуцируемых одним и тем же грибком и часто сопровождающих друг друга [61].
В работах [52-54] описаны твердофазные ИФлА на полистирольных микропланшетах для определения различных микотоксинов с использованием КТ в качестве люминесцентных меток. В работе [53] было проведено сравнение чувствительности методов разработанного ИФлА и классического ИФА, в котором в качестве метки выступал фермент пероксидаза хрена. Было показано, что использование люминесцентной метки приводит к увеличению чувствительности метода на порядок. Таким образом, разработка люминесцентных меток на основе КТ для различных форматов ИФлА является актуальным, поскольку позволяет повысить чувствительность методов, определять микотоксины в сложных матрицах, создавать тест-системы и детектировать несколько аналитов одновременно.
Применение силанизированных КТ для этих целей описано не было, однако их размер и возможность контроля заряда на поверхности таких КТ открывает новые возможности их применения в качестве люминесцентных меток. Данная работа посвящена созданию люминесцентной метки на основе силанизированных КТ и ее использованию для иммунохимического определения микотоксина дезоксиниваленола (ДОН). КТ конъюгировали со вторичными антимышиными антителами. Помимо яркости и стабильности, данная метка является универсальной как для различных форматов анализа, так и для различных мышиных антител, полученных для разных аналитов.
Применение квантовых точек в качестве меток для определения микотоксинов
Спектры поглощения снимали на УФ-спектрофотометре Shimadzu UV-1800. Спектры люминесценции снимали на Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer (Agilent Technologies) и на FLSP920 UV-Vis-NIR spectrofluorometer (Edinburgh Instruments). Спектры испускания в формате микропланшета снимали с помощью Safire Multi-detection Microplate Reader (Tecan). Размер наночастиц и их дзета-потенциал определяли с помощью Zeta Sizer Nano Series (Malvern, UK). Фотографии с просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ) были получены с помощью Cs corrected JEOL 2200 FS microscope (Belgium).
Относительный квантовый выход (КВ) рассчитывали по формуле: КВкт = КВродамин /кт дродамин /Родамин#А кт#п2 одамин , где КВКТ - относительный квантовый выход квантовых точек, КВродамин -квантовый выход красителя родамин 6Ж, I кт - интегрированная интенсивность люминесценции КТ, I родамин – интегрированная интенсивность флуоресценции красителя, Ародамин – оптическая плотность раствора родамина при длине волны возбуждения, Акт - оптическая плотность раствора КТ при длине волны возбуждения, nкт - показатель преломления растворителя для КТ, nродамин -показатель преломления растворителя для красителя [66-68].
Диаметр КТ и концентрацию растворов КТ оценивали по спектрам поглощения. Диаметр и коэффициент экстинкции для максимума в спектре поглощения (в экситонном пике) КТ оценивали по формулам [69]: D = (1.6122 х Ю-9)Х4 - (2.6575 х 10-6)Х3 + (1.6242 х 10-3)Х2 - (0.4277) ,+ (41.57) 8=5857 (D)265 где D - диаметр КТ CdSe (нм), к - положение экситонного пика (нм). Концентрацияю КТ рассчитывали по закону Ламберта-Бера: А= С L, где A – оптическая плотность раствора в экситонном пике, – молярный коэффициент поглощения КТ в экситонном пике (л/моль см), С – молярная концентрация КТ (моль/л), L – длина оптического пути (см).
Для приготовления конъюгата КТ-IgG на основе силанизированных КТ, модифицированных карбоксильной группой, использовали метод активированных эфиров [70, 71]. Сначала готовили активирующую смесь: 0.4 мг ЭДК и 1.2 мг ГСС растворяли в 100 мкл МЭС буфера. 700 мкл силанизированных КТ смешивали с 50 мкл активирующей смеси и перемешивали в течение 5 минут. Далее добавляли 300 мл IgG в концентрации 2 мг/мл и составляли смесь на горизонтальной мешалке на 3 часа. Далее оставшиеся непрореагировавшие активированные карбоксильные группы блокировали, добавляя 100 мкл 0.1 М раствора глицина. Раствор очищали от непрореагировавших низкомолекулярных соединений с помощью концентрационных пробирок с мембранами на 9кДА.
Амино-модифицированные силанизированные КТ (700 мкл) растворяли в диметилформамиде, и смешивали с 0.32 г янтарного ангидрида. Колбу продували инертным газом и оставляли перемешиваться 18 часов при температуре 4оС. Далее КТ очищали от диметилформамида и растворяли в МЭС буфере, содержащем 0.01 г ЭДК и 0.015 г ГСС. Через 5 минут перемешивания добавляли вторичные антитела IgG (300 мкл, 2 мг/мл) и оставляли перемешиваться на 2 часа при 37оС. Далее оставшиеся непрореагировавшие активированные карбоксильные группы блокировали, добавляя 100 мкл 0.1 М раствора глицина. Раствор очищали от непрореагировавших низкомолекулярных соединений с помощью концентрационных пробирок с мембранами на 9кДа. Силанизированные КТ, модифицированные с помощью ГОПТЭС, конъюгировали со вторичными антителами согласно протоколу [72]. 500 мкл КТ смешивали с 300 мкл вторичных антител IgG (2 мг/мл) в ФСБ и оставляли перемешиваться на 12 часов. Непрореагировавшие активные группы блокировали раствором булка в ФСБ. Полученные конъюгаты хранили при 40С и использовали в дальнейшем в иммунохимических тест-колонках и при проведении флуоресцентного твердофазного иммунохимического анализа (ИХА) на микропланшетах.
В каждую лунку микропланшета помещали 100 мкл раствора ДОН-овальбумин (разведение 1:15000) в связывающем буфере (рН 9.6) и оставляли на ночь при 4 0С. На следующий день лунки трижды промывали 300 мкл раствора Твин 20 в ФСБ (0.05% по объему), затем блокировали поверхность лунок 300 мкл блокирующего буфера (ФСБ, содержащий 5% казеин) – при 370С в течение 1 часа. Потом лунки промывали три раза 300 мкл 0.05% раствора Твин 20 в ФСБ. Далее добавляли стандартные растворы ДОН в ФСБ в различных концентрациях (50 мкл) и моноклональные антитела, специфичные к ДОН в разведении 1:20000 (50 мкл) и выдерживали при 370С в течение 2 часов. После этого лунки промывали три раза раствором Твин 20 в ФСБ (0.05% по объему). Затем в лунки добавляли конъюгат КТ-IgG в растворе Твин 20 в ФСБ (0,05%), 50 мкл/лунку), после чего микропланшет помещали на горизонтальный шейкер на 1 час. Затем лунки промывали 3 раза. Содержимое каждой лунки растворяли в 100 мл ФСБ и измеряли люминесценцию: длина волны возбуждения 380 нм, а интенсивность люминесценции фиксировали при 600 нм.
Предварительно проводили активацию полиэтиленовых подложек (фритов) согласно рекомендации производителя Senova GmbH (Jena, Germany) [73]. Сначала проводили дегазацию фильтров путем выдерживания их в этаноле в ультразвуковой ванне (15 мин), затем фриты помещали в колонки и проводили их активацию путем пропускания через них 1 мл карбонатного буфера.
После активации, в колонку вносили 100 мкл конъюгата ДОН-овальбумин (разведение 1:1500) и оставляли фрит в растворе на 5 мин. Далее промывали 1 мл карбонатного буфера. Затем блокировали поверхности фрита, помещая его на 5 мин в 100 мкл блокирующего буфера ФСБ с казеином. После промывания 1 мл ФСБ, в колонку помещали смесь стандартных растворов ДОН в ФСБ (50 мкл) и моноклональных антител в разведении 1:2000 (50 мкл). Далее, промыв фрит 1 мл ФСБ, добавляли конъюкат КТ-IgG. Через 5 минут колонку промывали 1 мл 0.05% Твин в ФСБ. Фриты извлекали из колонки и считывали сигнал с помощью микропланшетного спектрофлуориметра, длина волны возбуждения 380 нм, а интенсивность люминесценции фиксировали при 600 нм. Все измерения проводили трижды. Сигмоидные градуировочные зависимости строили в полу-логарифмической шкале: интенсивность люминесценции при 600 нм откладывали по оси у, логарифм концентрации ДОН – по оси х. Эти кривые описываются четырех параметрической функцией Родбарда:
Методика проведения твердофазного иммунофлуоресцентного анализа на полистирольных микропланшетах
На сегодняшний день существует множество модифицированных органосиланов, содержащих различные функциональные группы. В данной работе использовали амино-, карбокси-, меркапто- и глицидокси модифицированные органосиланы, а также ПЭГ содержащие органосиланы (таблица 9). Выбор модифицирующего агента основан на характеристиках получаемых наночастиц, в частности их коллоидная стабильность и сохранение исходных оптических характеристик. Важными параметрами также является доступность методов конъюгации с биомолекулами.
Использование микроэмульсии очень удобно, поскольку в этом случае модифицирующий реагент вводят непосредственно в реакционную смесь, после формирования первичной оболочки диоксида кремния. Важным является количество вводимого реактива, поскольку его избыток приводит к нарушению структуры оболочки, что в свою очередь приводит тушению люминесценции и агрегации частиц. В данной работе использовали максимум 1% модифицирующего агента по отношению к использованному количеству ТЭОС. После добавления функционального органосилана, реакционную смесь оставляли на магнитной мешалке еще на 24 часа.
Стабильность полученных частиц оценивали визуально во времени, а также измеряя их дзета-потенциал [82]. Исторически сложилось так, что стабильность дисперсий, в том числе и коллоидных растворов, часто оценивают исходя из электростатического взаимодействия. Согласно теориям агрегативной устойчивости, поверхностный потенциал определяет электростатический потенциал взаимодействия, для характеристики которого часто используется дзета-потенциал. Всё это связано с тем, что в дисперсных системах на поверхности частицы возникает двойной электрический слой ионов, отделяющих её от дисперсионной среды. Ионы определенного знака создают вокруг частицы поверхностный заряд (потенциалопределяющие ионы), который притягивает противоположные ионы из жидкой среды. С движением частицы происходит разрыв двойного электрического слоя, и возникает разность потенциалов между дисперсионной средой и неподвижным слоем жидкости, адсорбированной на поверхности частицы - это и есть дзета-потенциал.
Для оценки качества полученных КТ, определяли их КВ. Можно заметить, что после функционализации КВ незначительно снижается (таблица 10).
Так при значениях дзета-потенциала ±30 мВ частицы отталкиваются друг от друга, что и обуславливает стабильность дисперсии, ниже ±30 мВ -метастабильное состояние, а при низких значениях дзета-потенциала (ниже ±10 мВ) частицы быстро флоккулируют (высыпают хлопьями), это характеризует нестабильную дисперсию. Таким образом, дзета-потенциал используется как мера взаимодействия между частицами, и как следствие дает оценку стабильности самой дисперсной системы. Так, были измерены значения дзета-потенциалов для КТ, покрытых оболочкой диоксида кремния и модифицированных указанными в таблице 11 органосиланами.
Из представленных данных видно, что немодифицированные силанизированные КТ обладают средней устойчивостью. В то время как амино-модифицированные КТ показывают низкое значение дзета-потенциала, что ведет к их быстрой агрегации во времени. Модификация с помощью КЭСТ и ГОПТЕС ведет к значительному увеличению значений дзета-потенциала, увеличивая коллоидную стабильность таких КТ. Однако в случае ГОПТЕС, необходимо использовать крайне малое количество для модификации (около 0.1% относительно ТЭОС). В противном случае происходит необратимая агрегация частиц, связанная, возможно, с высокой активностью глицидокси-группы.
Как было отмечено ранее, для повышения стабильности водных растворов КТ и уменьшения неспецифического взаимодействия с биомолекулами, часто пришивают ПЭГ фрагменты к внешнему слою на поверхности КТ [83, 84]. Такой прием можно использовать и для силанизированных КТ. Для этого используют ПЭГ-производные органосиланов в комбинации с описанными выше модифицирующими агентами [85]. Важной является длина полиэфирной цепи: она должна быть достаточно длиной для повышения стабильности, но в тоже время достаточно компактной, чтобы не блокировать функциональные группы. Также количество ПЭГ цепей на поверхности должно быть контролируемо. В данной работе использовали 2 метокси-полиэтиленоксипропилтриметоксисилан (МПЭГТМС), в котором количество полиэфирных звеньев было от 6 до 9 (рисунок 22).
Модификация полученных квантовых точек различными функциональными группами
Для определения микотоксинов параллельно развиваются две основные группы методов: трудоемкие высокочувствительные методы лабораторного определения микотоксинов и экономичные скрининговые методы [115]. Первая группа методов представлена преимущественно методами высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуоресцентным и масс-спектрометрическим детектированием, позволяющими одновременно определять несколько микотоксинов одного класса [113, 116]; реже используются амперометрические и спектрофотометрические детекторы.
Недостатками хроматографических методов анализа являются их дороговизна и длительность однократного определения, обусловленная необходимостью предварительной пробоподготовки (твердофазная или жидкостная экстракция, концентрирование). Кроме того, хроматографические методы анализа требуют большого расхода органических растворителей, в связи с чем, возникает проблема их использования и утилизации без ущерба для окружающей среды. Поэтому, на сегодняшний день актуальной задачей является разработка тест-методов для экспресс-выявления образцов зерна, в которых концентрация ДОН превышает установленный уровень. Это связано также с тем, что ДОН накапливается в продуктах, как во время выращивания зерна, так и во время его хранения.
В настоящее время значительное внимание уделяется разработке сенсорных устройств, которые позволяют проводить экспресс-определение загрязнителей в полевых условиях и не требуют высококвалифицированного персонала. При определении микотоксинов некоторые успехи достигнуты в разработке иммуносенсоров – сенсорных устройств, основанных на регистрации взаимодействия антиген - антитело. Иммуносенсоры позволяют регистрировать сигнал, генерируемый в процессе реакции и преобразуемый в измеряемый электрический сигнал. В зависимости от типа физического преобразователя сигнала можно выделить три основные группы сенсоров на микотоксины: флуоресцентные, электрохимические и сенсоры на основе поверхностно – плазмонного резонанса [115]. Принцип действия большинства сенсоров основан на различных форматах конкурентного твердофазного ИХА. Аналитический цикл включает три стадии: 1) конкурентное взаимодействие с образованием иммунного комплекса, 2) регистрация аналитического сигнала, 3)регенерация сенсорного слоя, которая заключается в разрушении полученного комплекса и осуществляется путем изменения рН или введением органического растворителя.
На фоне общего внимания к разработке быстрых скрининговых методов для определения микотоксинов особый интерес вызывают неинструментальные тест-методы, пригодные для проведения анализа на месте производства и переработки сельскохозяйственной продукции. Возможность проведения скрининга во внелабораторных условиях, даже в отсутствии электрической сети, позволяет оперативно выделить загрязненные партии сельскохозяйственной продукции и предотвратить их объединение с большими объемами сырья при дальнейшей переработке, транспортировке и хранении.
Результаты, получаемые с помощью неинструментальных тест-методов, оцениваются на основе визуального детектирования. В большинстве случаев неинструментальные тесты дают качественную оценку концентраций (ДА/НЕТ), характеризующую присутствие (либо отсутствие) целевого аналита в концентрации выше установленного контрольного уровня. Как правило, при разработке неинструментальных тестов определения микотоксинов стараются достичь предела обнаружения, соответствующего законодательно установленному максимально допустимому содержанию данного микотоксина в анализируемом продукте [116-118].
Надо отметить, что колоночный иммуноферментный анализ получил развитие только в последнее время и описан только для анализа микотоксинов [119]. Он является простым и надежным качественным методом, позволяющим детектировать присутствие определяемого вещества.
Для создания оптимально быстрого и чувствительного метода представлялось важным сравнить результаты применения КТ в качестве меток в различных вариантах иммуноанализа. Для определения присутствия ДОН использовали: традиционный иммуноанализ на микроплашетах с использованием КТ в качестве меток и колоночный тест-метод (на основе пористых полиэтиленовых подложек, фритов).
Таким образом, задачами данной главы явились: - получение конъюгатов КТ со вторичными антителами для создания чувствительной метки; - характеристика показателей твердофазного ИФлА с использованием КТ в качестве меток для количественного определения ДОН; - разработка колоночного тест-метода для детектирования ДОН, используя полиэтиленовые фриты в качестве носителей, оптимизация методики проведения анализа; Для создания метки использовали КТ ядро-оболочка структуры CdSe/CdS/CdZnS/ZnS, покрытые оболочками диоксида кремния и модифицированные различными функциональными группами. Для проведения ИФлА был выбран так называемый непрямой формат: на подложку наносили комплекс определяемый аналит - белок, затем специфичные к выбранному аналиту антитела, а затем видо-специфичные вторичные антитела против первичных антител. При этом только вторичные антитела коньюгированны с КТ и комплекс антиген-антитело дает люминесцентный сигнал только после связывания со вторичным антителом, что позволяет избежать неспецифических реакций.