Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. способы получения, модификации и применение магнитных наночастиц магнетита 13
1.1. Магнитные наночастицы, их виды и свойства 13
1.2. Методы синтеза магнитных наночастиц магнетита
1.2.1. Физические методы .15
1.2.2. Химические методы 16
1.2.3. Электрохимический метод .19
1.2.4. Синтез на границе раздела фаз 20
1.2.5. Сонохимический метод и термическое разложение 20
1.2.6. Сверхкритический флюидный метод 20
1.2.7. Синтез c использованием нанореакторов .21
1.2.8. Микробный метод
1.3. Виды модификации МНЧ 26
1.4. Применение МНЧ в биоанализе .33
1.5. Магнитная твердофазная экстракция (МТФЭ)
1.5.1. Общая характеристика МТФЭ .38
1.5.2. Особенности разделения и концентрирования с помощью МНЧ 43
1.5.3. Анализ применения магнитных наночастиц магнетита в отечественной литературе 44
1.5.4. Определение антибиотиков фторхинолонового ряда с применением МТФЭ .47
Глава 2. Объекты, методы исследования, аппаратура, методики синтеза .55
2.1. Вспомогательное оборудование 55
2.2. Реактивы 56
2.3. Методы исследования и аппаратура .58
2.3. Методики синтеза и модификации поверхности наночастиц магнетита 60
2.3.1. Методика синтеза нестабилизированных МНЧ
магнетита 60
2.3.2. Методика получения магнитных наночастиц, стабилизированных лимонной кислотой 60
2.3.3. Методика получения функционализированных оксидом кремния наночастиц магнетита 2.3.4. Методика получения МНЧ, функционализированных оксидом кремния, из стабилизированных лимонной кислотой наночастиц магнетита...62
2.3.5. Методика получения функционализированных оксидом кремния наночастиц магнетита в присутствии ПВП
2.3.6. Методика модификации МНЧ магнетита ПЭИ 63
2.3.7. Методика модификации МНЧ магнетита катионами ЦТАБ и его бисчетвертичными аналогами 63
2.3.8. Методика сорбции энрофлоксацина на МНЧ, покрытых ПЭИ 64
2.3.9. Методика сорбции энрофлоксацина на МНЧ, покрытых ЦТАБ и его аналогами .64 Глава CLASS 3. Синтез, модификация и исследование свойств наночастиц магнетита CLASS
3.1. Экспериментальная установка и схема синтеза наночастиц магнетита .66
3.2. Стабилизация магнетита лимонной кислотой .67
3.2.1. Получение и характеристика стабилизированных МНЧ .67
3.2.2 Влияние температуры, количества основания и лимонной кислоты на размер стабилизированных МНЧ 70
3.2.3. Увеличение размера стабилизированных наночастиц магнетита 72
3.3. Модификация поверхности МНЧ диоксидом кремния 73
3.3.1. Поверхностная модификация нестабилизированных наночастиц магнетита тетраэтоксисиланом 73
3.3.2. Поверхностная модификация наночастиц магнетита, стабилизированных лимонной кислотой, тетраэтоксисиланом .75
3.3.3. Поверхностная модификация наночастиц магнетита тетраэтоксисиланом в присутствии ПВП .77
3.4. Поверхностная модификация наночастиц магнетита полиэтиленимином (ПЭИ) 80
3.5. Поверхностная модификация наночастиц магнетита моно- и дикатионными ПАВ 83
Глава 4. Сорбция и концентрирование фторхинолонов на модифицированных наночастицах магнетита .88
4.1. Влияние различных факторов на сорбцию ЭФ на МНЧ, модифицированных ПЭИ 89
4.2. Сорбция энрофлоксацина на МНЧ, модифицированных ЦТАБ и его дикатионными аналогами 96
4.3. Конценрирование антибиотиков фторхинолонового ряда 98
Глава 5. Сорбционно-флуориметрическое определение фторхинолонов с применением наномагнетита 106
5.1. Градуировочные графики для определения фторхинолонов без концентрирования и при концентрировании магнетитом, модифицированным ЦТАБ 106
5.2. Применение МНЧ магнетита, модифицированных ЦТАБ, для сорбционно-флуориметрического определения энрофлоксацина и левофлоксацина в волжской воде 108
5.3. Определение ЭФ в плазмозаменяющем средстве .110
5.4. Определение ЭФ в препарате «Энронит» 112
5.5. Определение ЛФ в препарате «Лексофлон» 113
Выводы 116
Литература
- Сверхкритический флюидный метод
- Методика получения функционализированных оксидом кремния наночастиц магнетита в присутствии ПВП
- Поверхностная модификация наночастиц магнетита тетраэтоксисиланом в присутствии ПВП
- Применение МНЧ магнетита, модифицированных ЦТАБ, для сорбционно-флуориметрического определения энрофлоксацина и левофлоксацина в волжской воде
Введение к работе
Актуальность темы. Магнитные наночастицы (МНЧ) вызывают в последние 5-6 лет повышенный интерес у исследователей и практиков в химии, медицине, биологии и материаловедении в связи с возможностью реализации нового способа концентрирования и очистки жидких сред от неорганических, органических, биологических примесей, клеток, субклеточных культур, белков и ДНК, а также адресной капсулированной доставки лекарств и генов к клеткам-мишеням живого организма, клеточной и молекулярной магнитной сепарации и гипертермии, магнитной резонансной томографии, хранении и записи информации. Для химического анализа важно, что МНЧ позволяют реализовать принципиально новый подход к отделению твердого сорбента от жидкой матрицы в твердофазном концентрировании, состоящий в использовании явления суперпарамагнетизма наночастиц. Магнитные свойства таких наночастиц возникают только при воздействии на них внешнего магнитного поля и исчезают при его удалении. Этот метод, получивший название магнитной твердофазной экстракции (МТФЭ), позволяет за десяток секунд отделить жидкую матрицу от сорбента, что значительно ускоряет время проведения ТФЭ по сравнению с фильтрованием и центрифугированием. Другими преимуществами МТФЭ являются возможность извлечения аналита из мутных, неочищенных исходных растворов и быстрый массоперенос аналита на сорбент за счет большой площади контакта твердой и жидкой фаз и равномерного распределения МНЧ в коллоидном растворе.
Анализ литературы показывает, что в МТФЭ наиболее часто применяют наночастицы магнетита Fe3O4, получить которые можно простым смешением солей Fe(III) и Fe(II) в инертной атмосфере. Для предотвращения агрегации, увеличения эффективности и селективности сорбции поверхность МНЧ модифицируют неорганическими и органическими соединениями. На данное время актуальным является изучение связи между природой модификатора и сорбата и выявление закономерностей сорбции различных веществ, а также комплексное использование МТФЭ, состоящее в сочетании концентрирования и разделения с определением неорганических и органических соединений различными методами.
Цель работы состояла в выявлении закономерностей концентрирования некоторых 6-фторхинолонов на модифицированных наночастицах магнетита и разработке методик сорбционно-флуориметрического определения указанных лекарственных препаратов.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- выбрать оптимальные условия синтеза, стабилизации и модификации
наночастиц магнетита, выявить факторы, влияющие на их размер;
- охарактеризовать размер и дзета-потенциал модифицированных
наночастиц магнетита при различных рН методами электронной микроскопии и
динамического рассеяния света и изучить взаимосвязь между дзета-потенциалом, величиной рН раствора и степенью извлечения фторхинолонов;
- изучить особенности и оптимальные условия сорбции антибиотиков
фторхинолонового ряда на наночастицах магнетита, условия их десорбции и
получить количественные характеристики сорбции;
- найти оптимальные условия и факторы концентрирования антибиотиков
энрофлоксацина, левофлоксацина и пефлоксацина;
- разработать методики сорбционно-флуориметрического определения
энрофлоксацина, левофлоксацина и провести их определение в коммерческих
ветеринарных препаратах «Энронит» и «Лексофлон», речной воде, а также
плазмозаменяющем средстве.
Научная новизна. Выявлены зависимости размера синтезируемых МНЧ от температуры, количества добавляемой щелочи и лимонной кислоты. Проведена сравнительная модификация наночастиц магнетита катионами ЦТАБ, тремя его бисчетвертичными аналогами с разной длиной спейсера и катионным полиэлектролитом полиэтиленимином (ПЭИ), изучено влияние рН на дзета-потенциал для всех трёх видов покрытий. Методами динамического рассеяния света и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) найдены размеры наночастиц и изучено их распределение по размерам при разных условиях. Методами спектроскопии комбинационного рассеяния и рентгеновской дифракции охарактеризован состав и строение наночастиц магнетита, стабилизированных лимонной кислотой. Найдены оптимальные условия сорбции трёх фторхинолонов на МНЧ магнетита, модифицированных ПЭИ и ЦТАБ, рассчитаны степени извлечения, коэффициенты распределения и коэффициенты их концентрирования. Показано, что сорбция энрофлоксацина хорошо описывается моделью Ленгмюра. Продемонстрирована возможность сочетания концентрирования антибиотиков на наночастицах магнетита с последующим их определением по собственной флуоресценции или сенсибилизированной флуоресценции хелатов с тербием.
Практическая значимость работы. Предложен подход, сочетающий
синтез, модификацию наночастиц магнетита, сорбцию антибиотиков
фторхинолонового ряда, быстрое отделение матрицы постоянным магнитом,
десорбцию и определение антибиотика флуориметрическим методом. Показано
значительное упрощение и ускорение процедуры отделения жидкой матрицы
анализируемого раствора и сорбента с аналитом за счет использования
постоянного магнита и явления суперпарамагнетизма. Установлено, что
фторхинолоны количественно извлекаются наночастицами магнетита,
покрытыми катионными ПАВ и катионным полиэлектролитом (степень
извлечения 94-98%). Найден состав элюента (ацетон-уксусная кислота = 9:1),
позволяющий десорбировать антибиотик на 94 %. Разработаны методики
сорбционно-флуориметрического определения энрофлоксацина и
левофлоксацина с применением концентрирования методом МТФЭ в ветеринарных препаратах «Энронит», «Лексофлон OR» (ООО «НИТА-ФАРМ», Россия), речной воде и плазмозаменяющем средстве.
На защиту автор выносит:
1. Результаты выбора оптимальных условий синтеза, стабилизации и
модификации наночастиц магнетита.
2. Результаты изучения размера, формы и дзета-потенциала
модифицированного наномагнетита методами просвечивающей микроскопии и
динамического рассеяния света.
-
Результаты выбора оптимальных условий и количественные характеристики сорбции и концентрирования фторхинолонов на наночастицах магнетита, модифицированных тремя типами веществ катионного характера.
-
Методики и результаты сорбционно-флуориметрического определения фторхинолонов в ветеринарных препаратах «Энронит», «Лексофлон OR» (ООО «НИТА-ФАРМ», Россия), речной воде и плазмозаменяющем средстве. Апробация работы. Основные результаты доложены на II Всероссийской конф. по аналитической спектроскопии с международным участием 27 сент.–03 окт. 2015 г., Краснодар; Всероссийской молодежной конф. с международным участием 26-27 ноября 2015 г., РХТУ, Москва; X и XI Всерос. конф. молодых ученых с международным участием «Современные проблемы теорет. и эксп. химии», Саратов, сент. 2015 г. и окт. 2016 г.; II Всероссийской молодежной конф. «Достижения молодых ученых: химические науки». 18-21 мая 2016 г., Уфа; VIIIth International Symposium ”Design and Synthesis of Supramolecular Architectures” and IInd Youth school on supramolecular and coordination chemistry, April 25-29, 2016, Kazan; EUROANALYSIS XVIII, 6-10 Sept. 2015, Bordeaux, France; Сonference on Analytical Chemistry. Modern Trends. 9-12 червня 2014. Kyiv. Ukraine; VIII Всероссийской конф. по радиохимии «Радиохимия – 2015», 28 сент.–2 окт. 2015 г. Железногорск, Красноярский край; 6th EuCheMS Chemistry Congress, Seville, Spain, 11-15 Sept. 2016; ХХ Менделеевском съезде по общей и прикладной химии, Екатеринбург, 26-30 сент. 2016. Личный вклад соискателя в работы, выполненные в соавторстве и включенные в диссертацию, состоял в синтезе, модификации наночастиц магнетита, исследовании факторов, влияющих на их размер и заряд, выполнении эксперимента по исследованию и расчету параметров извлечения и концентрирования фторхинолонов, определению их содержания в объектах, формулировке научных положений и выводов, обсуждении результатов и подготовке публикаций.
Публикации. По материалам диссертации опубликована 21 работа, в том числе 10 статей, из которых 4 статьи в журналах списка ВАК и 11 тезисов докладов. Гранты. Диссертационная работа выполнялась в рамках гранта РФФИ 15-03-99704 «Синтез, модификация и применение магнитных наночастиц для концентрирования и определения биологически активных веществ», а также частично гранта РФФИ 16-33-01120 мол_а «Наноразмерные биокомпозиты для магнитоуправляемой радиотерапии».
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 143 страницах машинописного текста, содержит 32 рисунка, 33 таблицы. Диссертация состоит из введения, 5 глав, выводов и списка 213 использованных библиографических источников.
Сверхкритический флюидный метод
Окислительный метод
Представляет собой метод синтеза наноразмерного магнетита из гидроксида двухвалентного железа, при котором происходит его частичное окисление в присутствии различных агентов (например, нитрат-ионов) [13-15]. Кроме того, возможен синтез при использовании в качестве окислителя кислорода воздуха. Данный метод является двухстадийным. Первоначально к раствору хлорида железа (II) при температуре 15-40 С при механическом перемешивании приливают водный раствор щелочи (NaOH или NH4OH) в количестве, необходимом для осаждения 2/3 железа в виде Fe(OH)2. Далее через образовавшуюся суспензию продувают воздух со скоростью 5-15 л/л реактора час. Процесс контролируют величинами рН и редокс-потенциала. В описанных условиях получают гетит в соответствии с уравнением:
Fe(OH)2+1/4 O2 FeO(OH)+1/2 H2O После этого к суспензии приливают раствор щелочи для осаждения оставшегося двухвалентного железа в виде Fe(OH)2. Суспензию подогревают до 70-100 С при механическом перемешивании. На данной стадии получают магнетит по уравнению: 2 -FeO(OH)+Fe(OH)2 Fe3O4+2H2O Недостатками метода являются сложность контроля размера и геометрии наночастиц магнетита, многостадийность, энергозатратность. Химическое соосаждение Химическое соосаждение - это простой, эффективный способ синтеза суперпарамагнитных наночастиц магнетита, средний диаметр которых обычно ниже 50 нм [16]. В основе метода лежит химическая реакция, при протекании которой происходит контролируемое зарождение и рост ядер оксида железа [17]. Широкое применение данного синтетического подхода началось с исследований Рене Массарта [18]. Наночастцы Fe3O4 синтезируют гидролизом смеси хлоридов железа (II) и (III) в соотношении 1:2 в щелочной среде, как правило, в инертной атмосфере. Схематически реакцию формирования магнетита можно отобразить следующим образом: FeCl2 + 2FeCl3 + 8NH3.H2O Fe3O4 + 8NH4Cl + 4H2O
Модифицированную методику Массарта используют и на сегодняшний день, при этом условия протекания процесса варьируют так, чтобы полученные МНЧ магнетита обладали необходимыми свойствами, формой и размерами. В работе [19] показано, что, при коротком времени гидролиза (2-10 минут) после добавления щелочи и изменении концентрации хлоридов железа от 0.0125 М до 1М, получают магнетит сферической формы со средним размером 4 - 43 нм. Недостатком данного способа является довольно большое распределение по размерам (30 %), кроме того, частицы более 20 нм содержат примесь гётита (FeO(OH)). Авторами [20] исследована зависимость размеров МНЧ магнетита и его коллоидная стабильность в водных, кислотных и щелочных растворах, и представлена диаграмма окислительно-восстановительного равновесия в системе магнетит/гематит/Fe(II). Следует отметить, что этот метод является одним из наиболее распространенных вследствие своей простоты и воспроизводимости.
Гидротермальный метод
Используют для синтеза МНЧ в водной среде в реакторах или автоклавах при высокой температуре ( 200 С) и высоком давлении ( 13 790 кПа) [21-24]. Высокие температуры способствуют быстрому образованию зародышей и, вследствие этого, наночастиц небольшого размера. Данный метод позволяет контролировать геометрию наночастиц после оптимизации параметров эксперимента, таких как время реакции, температура, концентрация реагентов, стехиометрия и природа растворителя.
Процесс синтеза включает следующие этапы:
1. Синтез (-FeOOH) НЧ нагреванием при 80 С водного раствора 0.02 М FeCl3 при механическом перемешивании в течение 12 ч; 2. Нанесение тонкого слоя диоксида кремния (SiO2) на НЧ для получения -FeOOH@SiO2;
3. Прокаливание на воздухе с последующей тепловой обработкой, а затем обработка наночастиц ультразвуком в растворе NaOH, для получения полых нанокапсул. В зависимости от условий термообработки возможен синтез полых нанокапсул гематита (-Fe2O3), магнетита Fe3O4 [25]. Проточно-инжекционный метод Синтез магнитных наночастиц в данном методе осуществляют при непрерывном или сегментированном перемешивания реагентов в ламинарном режиме движения жидкости в капиллярном реакторе [26]. Этот способ обладает значительными преимуществами, например, хорошей воспроизводимостью и высокой однородностью смешивания. МНЧ магнетита, синтезированные данным способом, имеют узкое распределение по размерам в диапазоне 2-7 нм.
В основе данного метода лежит выделение на катоде вещества в процессе электролиза простых или комплексных катионов и анионов. Если в цепь постоянного электрического тока включить систему, состоящую из двух электродов и раствора (расплава) электролита, то у электродов будут протекать реакции окисления-восстановления [27, 28]. Выделившийся на катоде рыхлый или плотный осадок состоит из множества нанокристаллитов. На текстуру осадка влияют различные факторы, такие, как условия диффузии, температура среды, природа вещества и растворителя, электрический потенциал, тип и концентрация ионов целевого продукта и посторонних примесей, адгезионные свойства осаждаемых частиц и другие. Авторы [29] получили наночастицы -Fe2O3 и Fe3O4 размером 3-8 нм в растворе бромида тетраоктиламмония в N, N-диметилформамиде в качестве электролита с использованием железного анода и платиновой фольги в качестве катода. Синтезированные МНЧ стабилизировали катионными ПАВ.
Методика получения функционализированных оксидом кремния наночастиц магнетита в присутствии ПВП
Наночастицы магнетита получали методом химического соосаждения из смешанного раствора солей двух- и трехвалентного железа по методике Массарта [18]. Первоначально готовили раствор используемых реагентов: 1.3 г FeCl36H2O и 0.48 г FeCl2 4H2O растворяли при комнатной температуре в 30 мл деионизованной воды при перемешивании, 2 г NaOH растворяли при комнатной температуре в 50 мл деионизованной воды. Полученные растворы обрабатывали ультразвуком в течение 10 минут при 25о С. В реакционную камеру помещали 20 мл 1 М NaOH и 130 мл воды. На панели управления устанавливали параметры температуры (40о С) и скорости оборотов (1800 об/мин). Через реакционную камеру барботировали азот в течение 15 минут, чтобы удалить растворенный кислород. Далее в активно перемешиваемый раствор гидроксида натрия впрыскивали под давлением азота раствор солей железа в течение нескольких секунд и оставляли при перемешивании на 3 минуты в атмосфере азота. Полученный черный осадок наночастиц магнетита осаждали с помощью постоянного магнита и сливали надосадочную жидкость. Затем при перемешивании к осадку добавляли 150 мл деионизованной воды, еще раз перемешивали в течение 5 – 7 мин и сливали надосадочную жидкость при помощи магнита. Процедуру повторяли 3 раза. Полученный коллоидный раствор магнитных наночастиц помещали в пластиковую пробирку и хранили при комнатной температуре.
Синтез магнитных наночастиц, стабилизированных лимонной кислотой проводили при аналогичных условиях. Первоначально готовили раствор используемых реагентов: 1.3 г FeCl36H2O и 0.48г FeCl2 4H2O растворяли при комнатной температуре в 12 мл воды при перемешивании, 2 г NaOH растворяли при комнатной температуре в 50 мл воды. Полученные растворы подвергали ультразвуковому воздействию в течение 10 минут при 25о С. В реакционную камеру помещали 20 мл 1 М NaOH и 150 мл воды. На панели управления устанавливали параметры температуры (40о С) и скорости оборотов (1800 об/мин). Через реакционную камеру барботировали азот в течение 15 минут, чтобы удалить растворенный кислород. Далее в активно перемешиваемый раствор гидроксида натрия впрыскивали под давлением азота раствор солей железа. Спустя 3 минуты после введения солей вводили 20 мл лимонной кислоты (40 мг/мл) и продолжали перемешивание раствора в течение 2 минут.
Поскольку полученные частицы не оседали под действием магнитного поля, в силу своих маленьких размеров, проводили диализ с целью очистки коллоидного раствора от ионов солей. Для этого наполняли диализный мешок синтезированным магнетитом и помещали его в химический стакан объёмом 0,5 л, заполненный деионизованной водой. Процесс проводили с использованием магнитной мешалки при комнатной температуре в течение 4 дней, меняя воду каждые сутки.
Полученный коллоидный раствор магнитных наночастиц помещали в пластиковую пробирку и хранили при комнатной температуре.
В реакционную камеру, содержащую синтезированный нестабилизированный отмытый магнетит, помещали 120 мл этанола, 30 мл деионизованной воды, 1 мл NH4OH и 5 мл ТЭОС. На панели управления устанавливали параметры температуры (40о С) и скорость оборотов (1800 об/мин). Через реакционную камеру барботировали азот в течение 6 часов для предотвращения окисления. Полученный черный осадок наночастиц магнетита осаждали с помощью постоянного магнита и сливали надосадочную жидкость. Затем, при перемешивании к осадку добавляли 150 мл деионизированной воды и снова перемешивали в течение 5 – 7 мин. Процедуру повторяли 3 раза. Полученный коллоидный раствор модифицированных магнитных наночастиц типа ядро/оболочка помещали в пластиковую пробирку и хранили при комнатной температуре.
Методика получения МНЧ, функционализированных оксидом кремния, из стабилизированных лимонной кислотой наночастиц магнетита В стакан, снабженный магнитной мешалкой, приливали 6.25 мл этанола, 2.75 мл деионизованной воды, 0.4 мл раствора магнетита, стабилизированного лимонной кислотой, с массой сорбента 3.5 мг, и 0.3 мл гидроксида аммония. Стакан с реагентами герметизировали лабораторной лентой «Parafilm M» для защиты от попадания в него инородных частиц. В другую пробирку добавляли 240 мкл ТЭОС и 2 мл этанола. С помощью перистальтического насоса по каплям добавляли раствор ТЭОС в этаноле в стакан, снабжённый магнитной мешалкой в течение 6-ти часов, отбирали пробы через определенные промежутки времени, центрифугировали в течение 30 минут при 18G, удаляли жидкую фазу и полученный осадок промывали деионизованной водой. Данную процедуру повторяли несколько раз.
Для предотвращения агрегации наночастиц магнетита их поверхность предварительно покрывали молекулами поливинилпирролидона (ПВП) согласно рекомендациям [188]. Для этого 0.24 мл нестабилизированного магнитного коллоида с массой сорбента 2 мг помещали в химический стакан ёмкостью 50 мл, добавляли при перемешивании магнитной мешалкой 67 мкл раствора ПВП с концентрацией 0.04 М и 20 мл этилового спирта. Полученную суспензию перемешивали 15 минут, после чего также при перемешивании добавляли 0.3 мл гидроксида аммония и по каплям 0.13 мл тетраэтоксисилана. После чего отбирали пробы раствора наночастиц через определенные интервалы времени, которые центрифугировали (5 мин, 18G), жидкую фазу удаляли и промывали МНЧ водой 3 раза. После последней промывки к осажденным МНЧ добавляли 0.5 мл воды и облучали образец в УЗ-ванне в течение 10 минут для получения однородной суспензии.
Поверхностная модификация наночастиц магнетита тетраэтоксисиланом в присутствии ПВП
Целью исследований по модификации поверхности наночастиц магнетита, описанных в главе 3, была не только их защита от агрегации и повышение устойчивости их коллоидных растворов, но и необходимость повышения степени сорбции фторхинолонов, выбранных в качестве модельных аналитов. Как показали предварительные исследования, сорбция этих антибиотиков на исходных наночастицах магнетита была незначительной, так как степень сорбции не превышала 25%. Лучше, но все-таки недостаточной была и степень сорбции на магнетите, покрытом оксидом кремния.
Поскольку аналитико-активной группой всех фторхинолонов является карбоксильная группа, способная диссоциировать в водном растворе в интервале рН 4 – 6 с образованием аниона, то логично для дальнейших исследований по их магнитной твердофазной экстракции (МТФЭ) было использовать виды модификаторов поверхности, придающие магнетиту положительный заряд. В связи с этим далее в работе приводятся данные о сорбции трех фторхинолонов на магнетите, модифицированном полиэтиленимином (ПЭИ), катионами ЦТАБ и его дикатионными аналогами. Общая схема процесса сорбции выглядит следующим образом (рис. 4.1) 4.1. Влияние различных факторов на сорбцию ЭФ на МНЧ, модифицированных ПЭИ
На рис. 4.2 представлены спектры поглощения растворов антибиотика энрофлоксацина в буферных растворах при различных значениях pH. Видно, что в интервале pH 5 - 6 наблюдается небольшой батохромный сдвиг на 7 нм полосы поглощения при 271 нм и гипсохромный сдвиг двойного максимума в области 300-350 нм, что может быть связано с диссоциацией карбоксильной группы антибиотика (рК = 6.2 [199-201]).
Спектры поглощения энрофлоксацина в ацетатно-аммиачных буферных растворах, Сэнр =5х10-5 М, рН: 1 - 3.2; 2 - 4.1; 3 - 5.0; 4 - 6.1; 5 - 7.0; 6 - 8.2; 7 - 9.0; 8 - 10.4.
На рис. 4.3 представлены спектры флуоресценции растворов ЭФ в ацетатно-аммиачных буферных растворах концентрацией антибиотика 8х10-6 М при различных значениях pH. При изменении кислотности среды наблюдается смещение максимума флуоресценции (при pH 3.2-6.1 max =450 нм, а в интервале pH 7.0-10.3 max =416 нм). Кроме того, показано значительное снижение интенсивности флуоресценции антибиотика при переходе от кислой среды к щелочной (рис. 4.4), т.е. флуоресцирует, по-видимому, цвиттерионная и особенно катионная форма антибиотика. 1000
Спектры флуоресценцции энрофлоксацина в ацетатно-аммиачных буферных растворах, Сэнр =8х10-6 М, рН: 1 - 3.2; 2 - 4.1; 3 - 5.0; 4 - 6.1; 5 - 7.0; 6 - 8.2; 7 - 9.0; 8 - 10.3. 1000 800 600 400 200 7 рН 3 9 Рис. 4.4. Зависимость интенсивности флуоресценции энрофлоксацина от pH среды в интервале 3.2-10.3; Сэнр =8х10-6 М, макс = 450 нм Эффективность сорбции изучали, определяя содержание антибиотика в растворе, оставшемся после отделения МНЧ флуориметрическим методом по собственной флуоресценции энрофлоксацина. Значения степени извлечения (R, %) рассчитывали по формуле: Я, % = хЮО где с0 – концентрация определяемого соединения в исходном растворе до сорбции, с – концентрация в растворе после сорбции,
Сорбция ЭФ, в молекуле которого (табл. 2.1) имеется карбоксильная кислотная группа, должна зависеть от pH, а также времени перемешивания и массы сорбента. Полученные результаты в целом подтвердили это предположение [202] (табл. 4.1).
Анализ таблицы по влиянию рН выявляет, на первый взгляд, некоторую необычность полученных данных, поскольку величина рК карбоксильной группы, участвующей в образовании цикла с Н-связью, находится вблизи рН 6 [199-201], а сорбция была максимальной при рН 3.2, т.е. при кислотности на 3 порядка меньше величины рК. Однако этот факт находит объяснение, если вспомнить, что как заряженные поверхности мицелл ПАВ, так и заряженные молекулы полиэлектролитов, сорбированных на поверхности, могут уменьшать величину рК кислотных групп на 1-4 ед. рН [203, 204]. В связи с этим диссоциация карбоксильной группы ЭФ также может происходить в более кислой области, т.е. при рН 3-4.
Следует отметить, что молекулы ЭФ при данной кислотности могут находиться в виде цвиттериона, поскольку в условиях диссоциации карбоксильной группы атом азота должен быть протонирован (рК 7.5 – 8 [199]). Это предполагает вполне определенное пространственное расположение молекулы ЭФ по отношению к поверхности ПЭИ и, возможно, обеспечивает сохранение величины общего положительного заряда модифицированных наночастиц магнетита и его стабильности в растворе (рис. 4.5).
Применение МНЧ магнетита, модифицированных ЦТАБ, для сорбционно-флуориметрического определения энрофлоксацина и левофлоксацина в волжской воде
Кроме этого на примере ветеринарных препаратов, выпускаемых Саратовской фирмой ООО «Нита-Фарм», нами была оценена возможность определения содержания основного вещества в препаратах «Энронит» и «Лексофлон» – лекарственных средствах в форме раствора для перорального применения, предназначенного для лечения сельскохозяйственных птиц и поросят при желудочно-кишечных и респираторных заболеваниях бактериальной этиологии.
Лекарственное средство «Энронит» в качестве действующих веществ в 1 мл содержит энрофлоксацин (100 мг) и колистина сульфат 1.000.000 MЕ, а также вспомогательные компоненты (метабисульфит натрия, молочная кислота, дистиллированная вода). По внешнему виду представляет собой прозрачный раствор желтого цвета. Смешивается с водой в любых отношениях.
Для определения содержания ЭФ в лекарственном препарате использовали МТФЭ совместно с флуориметрическим методом. Определение проводилось по следующей методике. Из лекарственного препарата отбирали 0.1 мл и доводили ацетатно-аммиачным буферным раствором pH 3.2 до 4 мл для создания концентрации ЭФ примерно 10-2 М. Далее методом разбавления получали 10-4 М раствор, аликвотную часть 0.1 мл которого вносили в пробирку с раствором магнетита, модифицированным ЦТАБ массой 3 мг, добавляли ацетатно-аммиачный буферный раствор pH 3.2 до общего объёма 4 мл и перемешивали на шейкере 15 минут. По истечению указанного времени ставили эппендорф на постоянный магнит и отделяли надосадочную жидкость. Далее сорбент промывали водой, после чего к нему добавляли 2 мл смеси (ацетон:уксусная кислота=9:1), перемешивали на шейкере 20, ставили эппендорф на постоянный магнит, отбирали надосадочную жидкость, испаряли ее в водяной бане, доливали 4 мл ацетатно-аммиачного буферного раствора pH 3.2 и измеряли интенсивность флуоресценции (возб= 282 нм, фл= 450 нм) и по градуировочному графику определяли количество ЭФ, содержащееся в лекарственном препарате. Правильность определения контролировали методом «введено – найдено» (табл. 5.5). Таблица. 5.5. Результаты и контроль правильности определения энрофлоксацина в препарате «Энронит» методом «введено-найдено» с учетом разбавлений (время сорбции-15 минут, m(Fe3O4@ЦТАБ)=3 мг в 4 мл раствора, 298 К, n=5, Р=0.95)
Введено, мг/мл Найдено, мг/мл Степень выделения, % Sr. 0 94±7 94 0.06 20 112±10 93 0.07 40 132±9 94 0.08 60 147±15 92 0.09 Видно, что в самом препарате найдено 94±7 мг/мл при заявленном содержании 100 мг/мл, т.е метод дает правильный результат с относительной погрешностью менее 10%. Метод «введено-найдено» позволил подтвердить вывод о том, что предложенный сорбционно-флуориметрический метод не содержит систематической погрешности. Кроме энрофлоксацина в состав лекарственного препарата входят вспомогательные вещества, такие как: метабисульфит натрия, молочная кислота. Полученные результаты позволяют также сделать вывод о том, что вспомогательные вещества при данных соотношениях не оказывают мешающего действия на определение энрофлоксацина.
«Лексофлон» («Нита-Фарм», Россия) – лекарственное средство в форме раствора для перорального применения, предназначенное для лечения сельскохозяйственных птиц (цыплят, уток, гусей) при колибактериозе, дизентерии, некротическом энтерите, псевдомонозе, кампилобактериозе, стафилококкозе, пастереллезе; и свиней — для лечения бактериальных заболеваний органов дыхания, пищеварительной и мочеполовой системы, инфекций кожи и мягких тканей, вызываемых чувствительными возбудителями, а также спирохетоза и микоплазменных инфекций. «Лексофлон ОR» преодолевает резистентность к энрофлоксацину и предыдущим поколениям фторхинолонов, более устойчив к ее развитию, эффективен при смешанных инфекциях и быстро восстанавливает продуктивные качества. Лекарственное средство в качестве действующего вещества в 1 мл содержит 150 мг левофлоксацина (в форме гемигидрата), а также вспомогательные компоненты: соляная кислота, ароматизатор «Вишня 667» и вода очищенная. По внешнему виду представляет собой прозрачный раствор от зеленовато-желтого до коричнево-желтого цвета. Смешивается с водой в любых отношениях.
Для определения содержания ЛФ в лекарственном препарате использовали МТФЭ совместно с флуориметрическим методом. Из лекарственного препарата отбирали 0,9 мл и доводили деионизованной водой до 4 мл для создания концентрации антибиотика на уровне 0.1 М. Далее действовали аналогично методике по определению ЭФ в препарате «Энронит». Интенсивность собственной флуоресценции измеряли при возб= 292 нм и по градуировочному графику определяли количество ЛФ, содержащееся в лекарственном препарате. Правильность определения контролировали методом «введено – найдено» (табл. 5.6).