Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 7
1.1. Структура, состав и свойства жирных кислот 7
1.2 Биологическая роль жирных кислот и их значение в медицине и токсикологии 13
1.2.1 Химические классы липидов плазмы крови 13
1.2.2 Биологическая роль жирных кислот 18
1.2.3 Исследование профилей жирных кислот в медицине и токсикологии 21
1.3. Инструментальные методы определения свободных и этерифицированных жирных кислот 26
1.3.1 Определение жирных кислот методами газовой хроматографии. 26
1.3.2 Определение жирных кислот методом жидкостной хроматографии
1.3.3. Определение жирных кислот методом капиллярного электрофореза 29
1.3.4. Методы экстракции жирных кислот из биологических образцов 30
1.3.5. Предварительное хранение и транспортировка биологических проб 31
1.4. Характеристика объектов исследования: химические соединения, потенциально влияющие на метаболизм липидов в организме 34
1.4.1 Фосфорорганические соединения 34
1.4.2 Мельдоний 36
1.4.3 Фторацетат 37
2 Экспериментальная часть 39
2.1 Методика определения свободных жирных кислот 39
2.2 Методика совместного определения свободных и этерифицированных жирных кислот 43
2.3 Определение оптимальных условий хранения и транспортировки биологических образцов 46
2.4 Исследование влияния фосфорорганических соединений на профили жирных кислот плазмы крови крыс 47
2.5 Исследование влияния мельдония на профили жирных кислот плазмы крови практически здоровых добровольцев
2.5 Исследование влияния фторацетата на профили жирных кислот плазмы крови крыс 48
2.6 Исследование влияния алифатических углеводородов на профили жирных кислот плазмы крови и тканей печени и головного мозга крыс. 49 2.7 Статистическая обработка полученных результатов 50
3 Результаты и их обсуждение 51
3.1 Хроматографическое разделение 51
3.2 Подготовка проб к анализу 52
3.3 Построение градуировочных зависимостей 58
3.4 Определение свободных и этерифицированных жирных кислот в плазме крови методом газовой хроматоматографии с масс-селективным детектированием 62
3.5 Оптимизация условий хранения образцов плазмы крови для определения жирных кислот методом газовой хроматомасс-спектрометрии 68
3.6 Изменения профилей жирных кислот плазмы крови крыс при введении сублетальных количеств зарина, зомана и вещества типа Vx, с применением антидотной терапии 73
3.7. Влияние мельдония на метаболизм жирных кислот 82
3.8 Исследование энергетического метаболизма крыс при действии фторацетата 85
3.9. Изменения профилей жирных кислот тканей печени и головного мозга крыс при
хроническом ингаляционном воздействии малых доз алифатических углеводородов 88
Заключение 98
Выводы 101
Список литературы 102
- Исследование профилей жирных кислот в медицине и токсикологии
- Определение жирных кислот методом капиллярного электрофореза
- Определение оптимальных условий хранения и транспортировки биологических образцов
- Изменения профилей жирных кислот плазмы крови крыс при введении сублетальных количеств зарина, зомана и вещества типа Vx, с применением антидотной терапии
Введение к работе
Актуальность
Хромато-масс-спектрометрические методы исследования профилей
низкомолекулярных соединений - метаболитов крови и других
биологических образцов приобретают все большее значение в современной
токсикологии и фармакологии. Исследование метаболических профилей
вносит значительный вклад в развитие лабораторно-клинической
диагностики, например, исследования маркеров обмена жирных кислот (ЖК) являются одним из ключевых направлений в ранней диагностике сердечнососудистых рисков и метаболического синдрома. Изменения концентраций ЖК в свободной (СЖК) и этерифицированной (ЭЖК) формах являются следствием метаболической саморегуляции, а также маркерами поражения или дисфункции органов, поэтому разработка методики совместного определения обеих форм большого числа ЖК весьма актуальна.
Основной метод определения ЖК в сыворотке или плазме крови - это газовая хроматография (ГХ) с пламенно-ионизационным детектированием, с предварительной жидкость-жидкостной экстракцией. В сочетании с масс-спектрометрическим детектированием, метод ГХ имеет ряд неоспоримых преимуществ как в части надежности идентификации аналитов, так в отношении чувствительности и селективности их определения. К недостаткам метода ГХ при любом варианте детектирования относится необходимость предварительной продолжительной дериватизации аналитов при высоких температурах, что может спровоцировать неблагоприятные побочные реакции, в частности изомеризацию непредельных ЖК и их окисление, причем скорость окисления возрастает с повышением степени непредельности кислоты. Таким образом, разработка мягких методов дериватизации необходима для повышения правильности и точности определения ЖК.
Практика применения разработанной методики при выполнении медико-
биологических исследований показала, что результаты анализа зависят от
условий хранения образцов плазмы крови. К условиям хранения можно
отнести следующие параметры: продолжительность хранения, температура и
количество циклов замораживания и размораживания. Большой объем
отобранных образцов приводит к большей продолжительности хранения, а
создание лабораторного “банка” образцов и применение различных методов
анализа приведет к увеличению количества циклов замораживания и
размораживания. Исследования влияния количества таких циклов на
концентрации эндогенных соединений в образце стали особенно
актуальными в связи с формированием крупных “банков” биологических
образцов. Соблюдение надлежащих условий хранения и транспортировки
биологических образцов позволяет значительно снизить вариации в
результатах анализа, обусловленные хранением. Количественная
характеристика влияния условий хранения биологических образцов позволит значительно повысить точность и достоверность определения ЖК.
Настоящая работа посвящена совершенствованию методики
количественного хромато-масс-спектрометрического определения ЖК в
биологических образцах в целях установления механизмов воздействия
токсичных химических соединений на организм, что позволит внести вклад в
практику медико-биологических исследований, лабораторно-клинической
диагностики, а также гигиенического регламентирования вредных
химических веществ.
Цель работы
Расширение аналитических возможностей методики хроматомасс-спектрометрического определения свободных и этерифицированных жирных кислот в плазме крови, моче и образцах органов и тканей, и оптимизация условий хранения проб и пробоподготовки для диагностики воздействия токсичных веществ на организм человека и животных. В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:
-
Выбрать условия, обеспечивающие возможность одновременного определения свободных и этерифицированных ЖК плазмы крови людей и животных. Оптимизировать условия количественного определения ЖК в образцах гомогенатов головного мозга и печени крыс. Произвести оценку метрологических характеристик методики.
-
Оценить адекватность существующих способов хранения проб для определения СЖК и ЭЖК плазмы крови людей и животных.
-
Апробировать разработанную двухстадийную методику определения ЖК при оценке влияния сублетальных доз фторацетата, фосфорорганических отравляющих веществ: зарина, зомана, VR1, а также средств антидотной терапии (карбоксим и атропин) на качественный и количественный состав СЖК и ЭЖК плазмы крови экспериментальных животных.
-
Апробировать разработанную двухстадийную методику при оценке влияния лекарственных препаратов на примере мельдония на качественный и количественный состав СЖК и ЭЖК плазмы крови человека.
Научная новизна
Впервые предложена двухстадийная методика ГХ-МС-определения СЖК и ЭЖК с использованием экстрактивного алкилирования. Доказано, что во время процедуры извлечения ЭЖК не происходит увеличения концентраций свободных жирных кислот, что свидетельствует об отсутствии конверсии ЭЖК в СЖК.
В плане совершенствования методик анализа биологических проб установлено, что внесение антиоксиданта, в частности 4-метил-2,6-ди-трет-бутилфенола, в плазму крови перед хранением не позволяет увеличить возможный срок ее хранения и допустимое количество циклов замораживания/размораживания.
Показано, что разработанная двухстадийная методика позволяет проводить определение СЖК и ЭЖК в образцах гомогенатов печени и
Российское вещество типа Vx, RVX, О-изобутил-S-2-диэтиламиноэтилметилфосфонат.
головного мозга без каких-либо видоизменений и введения дополнительных стадий подготовки и очистки проб.
Получены новые сведения о влиянии фосфорорганических соединений
на метаболизм липидов: VR в дозе DL50 ингибирует ацетилхолинэстеразу,
но не влияет на липидный обмен в первые 24 часа. Увеличение дозы VR до
20.4 DL50 приводит к нарушениям липидного обмена, а именно к
увеличению концентраций этерифицированных (на 30%) и свободных форм
жирных кислот (на 81%) в плазме крови в течение недели после отравления.
Сравнение изменений профилей СЖК при отравлении
фосфорорганическими отравляющими веществами (ФОВ) с последующей антидотной терапией и без нее демонстрирует, что антидотная терапия карбоксимом способна купировать отставленные последствия отравления, связанные с нарушениями метаболизма липидов, но не эффекты ФОВ в первые часы после отравления.
При интоксикации фторацетатом в тканях экспериментальных животных главными энергетическими источниками являются лактат, глутамат и глутамин. Глюкоза и СЖК не являются энергетическими субстратами в первые часы после отравления, но могут быть утилизированы в более позднем периоде.
Апробация двухстадийной методики при анализе плазмы крови и мочи здоровых добровольцев принимавших мельдоний позволила выявить отсутствие естественного увеличения концентраций СЖК и ЭЖК в плазме крови после приема пищи. Это может свидетельствовать об активации гликолиза, и преимущественном использовании глюкозы в качестве энергетического субстрата, что приводит к замедлению процессов липолиза и транспорта липидов. Положительным выявленным влиянием мельдония на метаболизм можно назвать снижение соотношения концентраций -6 и -3 полиненасыщенных ЖК.
Практическая значимость работы
На примере большой группы аналитов показана возможность адаптации разработанной методики для хроматомасс-спектрометрического определения СЖК и ЭЖК в биологических образцах. Перечень целевых соединений включает 12 насыщенных кислот (С11-С24) и 20 ненасыщенных кислот (С16-С24), в том числе -3, -6, -9 и полиненасыщенные жирные кислоты. Оптимизированы условия хранения биологических образцов для повышения надежности определения исходного состава СЖК и ЭЖК.
Разработанная двухстадийная методика внедрена в практику
доклинических и клинических исследований в ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России и использована при исследовании мельдония, фторацетата, зарина, зомана и VR без применения и с применением антидотных препаратов (карбоксима и атропина). В дальнейшем предложенная методика может быть использована в центрах профпатологии, медико-биологических НИИ, центрах Роспотребнадзора и токсикологических лабораториях.
Положения выносимые на защиту
1. Двухстадийная хромато-масс-спектрометрическая методика совместного
количественного определения свободных и этерифицированных жирных
кислот в плазме крови людей и лабораторных животных на принципах
экстрактивного алкилирования.
2. Доказательства влияния условий хранения образцов плазмы крови на
содержание в ней СЖК и ЭЖК и предложения по оптимизации условий
хранения биологических образцов: более одного цикла замораживания и
размораживания приводит к увеличению концентраций СЖК и уменьшению
концентраций ЭЖК в образце плазмы крови, хранение образца при
температурах -20 С и -70 С более 14 дней приводит к изменениям
концентраций ЖК разной направленности.
-
Доказательства возможности использования гомогенатов органов и тканей в качестве исходных образцов для определения ЖК в свободной и этерифицированной формах без введения дополнительных стадий их разделения.
-
Результаты, полученные при использовании разработанной методики в лабораторно-клинической диагностике при гигиеническом регламентировании вредных химических веществ, определении механизмов действия токсичных соединений, а также на всех стадиях доклинических и клинических исследований лекарственных средств.
Публикации и апробация работы
Материалы диссертационной работы опубликованы в 6 статьях в
журналах, рекомендованных ВАК и 3 тезисах докладов. Результаты
исследований представлены на международных и всероссийских
конференциях: “VIII Всероссийской конференции с международным
участием молодых ученых по химии “Менделеев 2014” (Санкт-Петербург, 1-4
апреля 2014 г.); “LXXV Ежегодной итоговой научно-практической
конференции “Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины – 2014” (Санкт-Петербург, 21-24 апреля, 2014 г.); “Российском научном форуме “Актуальные вопросы фундаментальной медицины” (Екатеринбург, 23-25 октября 2014 г.).
Структура и объем работы
Исследование профилей жирных кислот в медицине и токсикологии
Жирные кислоты представляют собой алифатические одноосновные карбоновые кислоты с открытой цепью, содержащиеся в основном в этерифицированной форме в жирах, маслах и восках растительного и животного происхождения [5]. Основные ЖК в организме человека имеют чётное число атомов углерода, что связано с особенностями их биосинтеза, при котором к углеводородному радикалу ЖК последовательно добавляются двухуглеродные фрагменты [6] (см. рисунок 2).
Жирные кислоты являются структурными компонентами различных липидов. В составе триацилглицеридов они выполняют функцию депонирования энергии, так как их радикалы содержат богатые энергией СН2-группы [7]. Благодаря своей структуре, при окислении связей С-Н ЖК дают в два раза больше энергии, по сравнению с полисахаридами, что делает жир наиболее эффективной формой для хранения избыточной энергии у живых организмов. Поскольку увеличение клеточной концентрации СЖК является токсичным, они хранятся в основном в виде триглицеридов во внутриклеточных нейтральных липид-ных каплях, которые функционируют и как резервуары энергии, и как запас ЖК и стеринов, необходимый для синтеза мембран [8]. Жиры и фосфолипиды организма при нормальной температуре тела имеют жидкую консистенцию, так как количество ненасыщенных ЖК преобладает над насыщенными. В фосфолипидах мембран ненасыщенных кислот может быть до 80-85%, а в составе жиров подкожного жира - до 60% [5].
Свободные ЖК в организме природного происхождения, образованы посредством ферментативного гидролиза триацилглицеридов (ТГ). В свободном, неэтерифицированном состоянии ЖК в организме содержатся в небольшом количестве, например, в крови, где они транспортируются в комплексе с белком альбумином [9].
Жирные кислоты, как правило, содержат неразветвленную цепь из атомов углерода (С4-С24, включая углерод карбоксильной группы) и могут быть как насыщенными, так и ненасыщенными [10]. По степени ненасыщенности ЖК подразделяют на насыщенные, в которых двойные связи С=С отсутствуют, мононенасыщенные содержащие одну кратную связь, и полиненасыщенные, в структуре которых содержится более одной кратной связи [11]. По длине углеродной цепи ЖК подразделяют на короткоцепочечные (от С4 до С6), среднецепочечные (от С? до Си) и длинноцепочечные (более Сіз). Короткоцепочечные ЖК зачастую представляют собой промежуточные продукты синтеза или деградации более длинных ЖК, в отличие от которых не являются основными компонентами биологических мембран. В состав большинства мембран в организме входят липиды с ацильными группами, содержащими 14, 16, 18, 20, 22 или 24 атомов углерода [12].
Многие ЖК еще до полного установления их строения имели тривиальные названия, и эти названия настолько прочно утвердились в литературе, что их трудно исключить из употребления [13], поэтому правилами ИЮПАК для номенклатуры ЖК допускается использование их тривиальных названий [14].
В соответствии с систематической номенклатурой, количество и положение двойных связей в ненасыщенных ЖК часто обозначают с помощью цифровых символов: например, олеиновую кислоту как 18:1;9, линолевую кислоту как 18:2;9,12, где первая цифра -число углеродных атомов, вторая - число двойных связей, а следующие цифры - номера ближайших к карбоксилу углеродных атомов, вовлеченных в образование двойной связи [15]. Также позицию двойной связи обозначают знаком , после которого указывают номер атома углерода, ближайшего к карбоксилу, у которого находится двойная связь. Например, С18:19 означает, что ЖК содержит 18 атомов углерода и одну двойную связь у 9-го атома углерода, считая от углеродного атома карбоксильной группы [6]. В настоящее время также применяется собственная номенклатура ненасыщенных ЖК (т.н. «омега-номенклатура»), предложенная Холманом в 1964 году [16]. Эта классификация позволяет учитывать путь образования ЖК в организме. В ней концевой атом углерода, независимо от длины цепи, обозначается символом . Отсчет положения двойных связей производится не как обычно от карбоксильной группы, а от терминальной метильной группы [14]. Структура любой ненасыщенной кислоты может быть выражена тремя цифрами: числом углеродных атомов в цепи, количеством двойных связей и количеством углеродных атомов между двойной связью и метильной группой (со-углеродом)
Определение жирных кислот методом капиллярного электрофореза
В связи с тем, что определение ЖК методом ГХ-МС сопряжено с необходимостью проведения трудоёмкой и времязатратной процедуры дериватизации, жидкостная хроматография является хорошей альтернативой. Благодаря мягким условиям подготовки проб, возможно определение низких эндогенных концентраций полиненасыщенных ЖК, эйкоза-ноидов (эйкозаноиды – это класс более 100 липидных медиаторов, производимых из С20 полиненасыщенных кислот, таких как арахидоновая, эйкозапентаеновая) [93], различных метаболитов [94] и продуктов окисления [95]. Мягкие условия подготовки проб позволяют снизить неконтролируемые изменения в структурах аналитов.
В работе [93], для определения 6 полиненасыщеннвх кислот, 14 эйкозаноидов и 3 окисленных метаболитов применяли осаждение белков и онлайн-ТФЭ в сочетании с тан-демным масс-спектрометрическим детектированием, разделение компонентов пробы проводили на неполярной хроматографической колонке С18, для уверенной идентификации соединений были подобраны специфические МRМ-переходы. Предложенный метод отличается быстрой пробоподготовкой с возможностью автоматизации. Пределы обнаружения составили 200-1000 нг/мл для полиненасыщенных ЖК и 10-1000 пг/мл для метаболитов.
Для ЖХ описаны, в том числе, методы подготовки проб, включающие стадию дери-ватизации. Например, было предложено проводить определение ЖК в тканях атеросклеро-тических бляшек после их удаления с внутренней стенки артерии. Для этого, сначала проводили экстракцию ЖК из матрицы с помощью раствора хлороформа в метаноле, затем полученную смесь гидролизовали с помощью 40% гидроксида калия, далее проводили де-риватизацию свободных ЖК диметиламиноэтанолом с добавлением метилиодида. Полученные триметиламиноэтиловые эфиры ЖК определяли методом ВЭЖХ/МС-МС, пределы обнаружения составили 4-40 нг/мл [96].
Определение жирных кислот методом капиллярного электрофореза Как было отмечено выше, определение транс-ЖК кислот методом ГХ сопряжено с рядом проблем, связанных с необходимостью введения стадии дериватизации среднелету-чих и нелетучих аналитов [97]. Необычной альтернативой методам определения транс-ЖК является капиллярный электрофорез.
КЭ - это инструментальная техника с высоким разрешением, которая позволяет разделять сложные комплексы биологических и химических смесей, что делает этот метод привлекательным для определения различных липидов [98]. КЭ для определения транс-ЖК начали применять с 2003 г., основным объектом исследования стали пищевые продукты [99]. В работе [97] КЭ использовали для определения транс-ЖК в продуктах питания. Для этого липидную фракцию обрабатывали раствором NaOH/MeOH, а затем пробы были проанализированы на капиллярном электрофорезе Agilent Technologies с ультрафиолетовым детектором (длина волны 200 нм). Анализ ЖК проводили в буфере, рН которого выше рК кислот (выше 5), соответственно анализ проводился анионной формы ЖК. Таким образом были проведены анализы ненасыщенных ЖК C19:1, C18:1t, C18:1c, C18:2, C18:3. Сравнение результатов процедуры по определению транс-ЖК на КЭ и ГХ не показало значительной разницы, однако использование КЭ позволяет значительно сократить время анализа и пробоподготовки. Недостатком метода является низкая чувствительность по сравнению с ГХ, например, в шоколадной продукции методом КЭ обнаружить транс-жиры не удалось из-за низкого предела обнаружения. В работе [100] КЭ использовали для определения транс-ЖК в сырной продукции.
Известны работы по применению КЭ для определения фосфолипидов в крови [101], показано, что метод КЭ составляет хорошую альтернативу тонкослойной хроматографии.
В работе [102] показан пример сопряжения КЭ и масс-спектрометра с ионизацией электрораспылением. Пределы обнаружения составляли 20 мкг/мл для лауриновой, мири-стиновой, пальмитиновой и стеариновой кислот.
Чаще всего, содержание эндогенных кислот определяют в плазме крови, реже в моче [88]. Иногда проводится более избирательный анализ, например, на содержание ЖК в мембранах эритроцитов [103] или в тканях атеросклеротических бляшек [78].
Основным методом экстракции, применяемым как до, так и после дериватизации, является жидкость-жидкостная, с использованием, например, н-гексана [104,105], дихлор-метана, этилацетата в качестве экстрагентов [106]. Наряду с жидкость-жидкостной применяют твёрдофазную экстракцию (ТФЭ) с использованием патронов С18 [93] и Strata-X (Phenomenex, Macclesfield, UK) [107]. Преимуществом ТФЭ является возможность автоматизации пробоподготовки, что приводит к ускорению процесса и минимизирует ошибки.
Экстрактивное алкилирование
Особое внимание к экстрактивному алкилированию с точки зрения применения в анализе связано с тем, что в этом процессе объединяются стадии экстракции и получения летучих производных анализируемых веществ. Реакции протекают в мягких условиях, причём использование межфазных агентов позволяет уменьшить продолжительность реакций и увеличить выходы продуктов. В качестве катализатора межфазного переноса используются четвертичные аммониевые и фосфониевые или другие ониевые соли, например, тет рабутиламмонийбромид, бензилтриэтиламмонийхлорид, трибутилгексадецилфосфо нийбромид [108].
Особенно важно при определении ЖК предотвратить реакции гидролиза липидов. Для оценки возможного вклада реакций гидролиза и переэтерификации, в работе [1] авторы провели ряд экспериментов с внесением в сыворотку крови растворов L--дипальмитоиллецитина и триолеина в хлороформе. После процедуры экстрактивного алки-лирования метилиодидом с катализатором межфазного переноса гидроксидом тетрабути-ламмония установили, что процессы гидролиза и переэтерификации липидов в условиях экстрактивного алкилирования протекают в незначительной степени и не вносят заметного вклада в результаты определения СЖК.
В работе [109] показана возможность извлечения коротко- и среднецепочечных ЖК (С2-С10) из плазмы методом твёрдофазной микроэкстракции (ТФМЭ). Для этого авторы использовали волокно покрытое дивинилбензол/карбоксен/полидиметилсилоксаном. Достигнутый предел обнаружения на стандартных образцах ЖК составил 200 мкг/мл, применение высаливания с использованием комбинации солей (NH4)2SO4/NaH2PO4 позволила увеличить чувствительность метода. Такая комбинация оказалась намного эффективней, чем внесение смеси NaCl/Na2SO4. В качестве матрицы для исследования были взяты образцы сыра и вин, но метод пригоден и для сложных биологических матриц, таких как плазма крови. В работе [110] посвященной исследованию СЖК в сыре были достигнуты пределы обнаружения в 7 мкг/кг.
В работе [111] описана разработка метода, который может быть применен для оценки пребиотиков, представляющих различные источники неперевариваемых углеводов в ферментных моделях. В этой работе авторы применяли ТФМЭ для определения СЖК в кишечных ферментах. Для этого была создана модельная смесь ферментов и бактерий, находящихся в толстой кишке. Применяли различные волокна для ТФМЭ среди которых дивинилбензол/карбоксен/полидиметилсилоксан показал хорошую экстракцию для летучих короткоцепочечных ЖК (масляной, изовалериановой, валериановой к-ты). Карбок-сен/полидиметилсилоксан показал лучшую экстракцию для муравьиной и пропионовой кислоты. Преимущество метода состоит в отсутствии процедуры дериватизации и уменьшении влияния сложной матрицы на ГХ определение.
Определение оптимальных условий хранения и транспортировки биологических образцов
Исследование проводили с участием 12 практически здоровых мужчин 20-25 лет. Эксперимент разделили на два этапа: в ходе первого этапа у добровольцев в течение одного дня отбирали образцы плазмы крови, в ходе второго этапа добровольцы получали 2500 мг мельдония утром и у них также отбирали образцы плазмы крови по аналогичной схеме. Режимы питания добровольцев на двух этапах исследования одинаковые.
Отбор крови у добровольцев проводили из кубитальной вены в пробирки для гематологии Vacuette с ЭДТА в качестве антикоагулянта.
В первый день фонового тестирования у добровольцев отбирали образцы крови и мочи в течение всего дня: фон, 15 мин, 30 мин, 1 час, 2 часа, 4 часа, 8 часов. Для уменьшения влияния питания на фоновые значения клинико-биохимических показателей добровольцы получали обед не ранее чем через два часа после отбора крови (после точки отбора “2 часа”). Расписание отбора проб плазмы крови после приема мельдония в точности повторяет фоновое тестирование.
В настоящей мы исследовали изменение содержания триглицеридов и СЖК после острой интоксикации натриевой солью фторацетата у крыс; пероральная доза составила 2 мг/кг (1/2LD50) [167]. Для экспериментальных исследований использовали белых крыс породы Wistar. Действие ФА оценивали при пероральном введении. Стандартные методы лабораторной диагностики включали в себя определение лактата, пирувата, цитрата, гликогена, глюкозы, триглицеридов, СЖК. Эксперименты проводили на белых беспородных крысах-самцах массой 180-230 г. Условия содержания экспериментальных животных соответствовали «Правилам лабораторной практики в Российской Федерации (GLP)» (утв. Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 19.06.2003 N 267). Для получения плазмы кровь отбирали в пробирки с ЭДТА-К3 после декапитации крыс и центрифугировали 15 мин при 4000
Для оценки токсических свойств смеси нормальных алифатических углеводородов С6-С10, а именно гексана, гептана, октана, нонана и декана (далее – УВ) был проведен хронический 90-суточный эксперимент. Смеси предельных углеводородов подавали в камеры непрерывно в течении 90 суток с помощью специально сконструированного дозатора, позволяющего точно регулировать и постоянно поддерживать заданную концентрацию смеси в камере в течение эксперимента.
Концентрации УВ в воздухе при экспонировании животных были довольно низкими: содержание гептана в смеси составляло всего 104,7 мг/м3 в первой группе, 20,3 мг/м3 во второй и 3,4 мг/м3 в третьей. Актуальность исследования влияния низких концентраций УВ согласуется с современными тенденциями в токсикологии, которые предполагают исследование концентраций токсикантов, релевантных их содержанию в окружающей среде. Соотношения предельных углеводородов в смеси заданы соотношениями их концентраций в атмосферном воздухе вблизи нефтеперерабатывающих заводов, что наглядно представлено в таблице 11.
После экспонирования у животных были отобраны образцы органов, которые незамедлительно заморозили в жидком азоте (-196С) и гомогенизировали. К полученным гомогенатам массой от 80 до 120 мг добавляли раствор 4 мл КОН в метаноле, пробы тщательно перемешивали в УЗ-ванне в течении 10 минут, а затем в вортексе в течение 15 минут, затем проводили экстракцию метиловых эфиров 4 мл гексана дважды, экстракт выпаривали и определяли ЭЖК методом ГХ-МС. В оставшийся раствор гидроксида калия для установления рН 7 добавляли фосфатный буфер, а затем проводили процедуру экстрактивного ал-килирования иодистым метилом (200 мкл) в присутствии катализатора межфазного переноса ТБАГ (300 мкл). При увеличении веса образцов соответственно увеличивали количество реагентов.
Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью прикладного пакета программ «STATISTICA» (версия 6.0, StatSoft Inc, 2001) и Microsoft Excel 2007 с дополнением Multibase 2015. В случае трех и более выборок различия по анализируемым показателям оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим попарным межгрупповым сравнением величин по критерию Фишера. Для выявления взаимосвязей между изучаемыми показателями вычисляли коэффициент корреляции Пирсона. Для всех видов анализа статистически значимыми по сравнению с контролем считали значения с р 0,05. Результаты представлены как медиана (5%; 95% перцентиль) [2,3,4,128].
Факторный анализ данных проводили методом PLS-DA, который является частным случаем метода главных компонент (англ. PCA – principal component analysis) [196]. При анализе данных методом PCA особое внимание уделяется графикам счетов и нагрузок, которые несут в себе информацию о распределении данных. На графике счетов каждый образец изображается в координатах t1 и t2 (старшие главные компоненты ГК1 и ГК2) или в координатах младших компонент t3, t4 и пр. Близость двух точек означает их схожесть, т.е. положительную корреляцию. Точки, расположенные под прямым углом, являются некоррелированными, а расположенные диаметрально противоположно – имеют отрицательную корреляцию. График нагрузок при этом используется для исследования роли переменных. На графике нагрузок каждый образец изображается в координатах p1 и p2. Анализ графика нагрузок позволяет установить, какие переменные коррелируют друг с другом. 3 Результаты и их обсуждение
При разработке методики нами было проведено сравнение эффективности разделения метиловых эфиров ЖК на капиллярных колонках: HP-FFAP Polyethylene Glycol, SUPELCO SPB-1701 30 м, 0,250 мм, 0,25 мкм и HP-5MS 30 м, 0,25 мм, 0,25 мкм [2].
Режимы программирования температуры при использовании колонки HP-FFAP Polyethylene Glycol: начальная температура термостата 50С, конечная 200 С, скорость подъема температуры варьировали от 5 С/мин до 20 С/мин, в том числе с использованием “ступенчатого” температурного градиента.
Форма хроматографических пиков наиболее легких компонентов смеси симметрична, однако при достижении температуры выхода 200 С форма пиков тяжелых компонентов не позволяла провести количественную оценку их площадей. Можно предположить, что увеличение конечной температуры до 300 С позволило бы добиться правильной формы пиков тяжелых компонентов, однако диапазон допустимых рабочих температур неподвижной фазы FFAP меньше этой температуры.
Режимы программирования температуры при использовании колонки SUPELCO SPB 1701 30 м, 0,250 мм, 0,25 мкм: начальная температура термостата 50 С, конечная 240 С, скорость подъема температуры варьировали от 5 С/мин до 20 С/мин, в том числе с использованием “ступенчатого” температурного градиента. Оказалось, что с использованием SPB-1701 разделение компонентов происходит еще худшим образом по сравнению с колонкAоbйu nFdFaAncPe . На рисунке 9 представлены хроматограммы, полученые при использова
Изменения профилей жирных кислот плазмы крови крыс при введении сублетальных количеств зарина, зомана и вещества типа Vx, с применением антидотной терапии
Помимо общего изменения концентраций СЖК, измерение профилей позволяет характеризовать качественное изменение липидного состава крови: при отравлении зоманом и зарином в первую очередь из крови утилизируются насыщенные ЖК, а при отравлении RVX происходит обогащение фракции СЖК полиненасыщенными ЖК. Терапия отравлений RVX препаратом Карбоксим позволяет нормализовать концентрации СЖК и ЭЖК в плазме крови, однако такая антидотная терапия не оказывает влияния на повышенное содержание свободных полиненасыщенных ЖК.
Измерение профилей свободных и этерифицированных форм ЖК является важным инструментом для определения нарушений липидного обмена, а полученные данные позволяют более полно охарактеризовать состояние тканей и органов в период острой интоксикации ФОС и в более отдаленные сроки.
В настоящей работе было оценено влияние на организм не только отравляющих веществ, но также фармпрепаратов на примере мельдония. Следует отметить, что, помимо индексов полиненасыщенности и непредельности, в исследованиях является полезным и определение индексов активности десатураз и элонгазы, что становится возможным после количественного определения индивидуальных СЖК и ЭЖК. Изменение индексов активности свидетельствуют об изменении метаболизма не только ЖК, но и метаболизма организма в целом.
Активация гликолиза под воздействием мельдония может приводить к изменениям в метаболизме ЖК, поэтому нами было предложено определить влияние мельдония на метаболизм ЖК. Оценка влияния мельдония на концентрации ЖК и их метаболитов в плазме крови произведена впервые и позволила получить новую информацию о механизме действия лекарственного средства.
На первом, фоновом, этапе исследования было проанализировано изменение ЖК в плазме крови в течение дня, начиная с утра, когда отбор крови проводился натощак, а затем в динамике после приема пищи. Было установлено, что после приема пищи концентрации СЖК и ЭЖК начинают возрастать, достигая максимума в 8 ч. Эта тенденция проиллюстрирована на рисунках 29 и 30. Также были определены максимумы индивидуальных кислот и отслежена среднесуточная динамика изменения в плазме крови. На втором этапе было показано, что однократное употребление мельдония предотвращает повышение содержания СЖК и ЭЖК после употребления пищи практически до утреннего уровня.
Суммарные концентрации ЭЖК имеют тенденцию к увеличению после приема пищи при воздействии мельдония, при этом разница между фоновой и контрольной группами статистически значима. В настоящей работе выявлено, что добровольцев, участвовавших в исследовании, можно разделить на две группы, исходя из данных по соотношению концентраций -6 и -3 полиненасыщенных ЖК в крови. В первой группе этот показатель составил 5,1 (3,6; 7,2), а во второй – 14,3 (8,4; 22,0), различия между группами статистически значимы (p 0,0001). Такое разделение оказалось необходимым, так как при приеме мельдония в первой группе изменение индекса отсутствовало, а во второй происходило его снижение после приема пищи. Этот факт отражен наглядно на рисунке 31. Стоит отметить, что корреляция между суммарной концентрацией СЖК и соотношением концентраций -6 и -3 – отсутствует (коэффициент корреляции Пирсона меньше критического значения).
Рисунок 31 – Изменение соотношения концентраций -6 и -3 полиненасыщенных свободных ЖК в крови. Знаком « » отмечены статистически значимые изменения между
двумя группами (p = 0,045) Выявлено, что однократное употребление мельдония препятствует повышению индекса -6/-3 после приема пищи, разница составляет 38 %. Установлено, что снижение индекса происходит за счет уменьшения концентрации -6 полиненасыщенных ЖК, в то время как концентрации -3 остаются неизменными. Выявленные воздействия мельдония на метаболизм ЖК суммированы в таблице 24.
Отсутствие естественного увеличения концентраций СЖК и ЭЖК в плазме крови после приема пищи может свидетельствовать об активации гликолиза, и преимущественном использовании глюкозы в качестве энергетического субстрата, что приводит к замедлению процессов липолиза и транспорта липидов. Положительным влиянием мельдония на метаболизм можно назвать снижение соотношения -6/-3 полиненасыщенных ЖК, что может свидетельствовать о снижении рисков середчно-сосудистых заболеваний.
Краткое описание выявленных воздействий мельдония на метаболизм ЖК Субстраты/ метаболиты Эффект Возможный механизм Свободные ЖК Отсутствует естественное увеличение концентраций после приема пищи. Суммарная концентрация снижена на 37 %. Преимущественное использование глюкозы в качестве энергетического субстрата приводит к замедлению процессов липолиза и транспорта липидов
Этерифицированные ЖК Отсутствует естественное увеличение концентраций после приема пищи. Суммарная концентрация снижена на 34 %. Отношение концентраций -6 к -3 полиненасыщенным свободным жирным кислотам Снижает концентрации -6 ПНЖК. Индекс -6/-3 снижен после приема пищи на 38%. Не ясен.
Определение индексов активности десатураз, а также отношение -6/-3 позволило в полной мере оценить влияние фармпрепарата на организм человека. Разработанная методика определения ЖК может быть использована для оценки воздействия препаратов на метаболизм ЖК.