Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Жидкостная хроматография и капиллярный электрофорез сердечно-сосудистых лекарственных средств Васильева Мария Владимировна

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Васильева Мария Владимировна. Жидкостная хроматография и капиллярный электрофорез сердечно-сосудистых лекарственных средств: диссертация ... кандидата Химических наук: 02.00.02 / Васильева Мария Владимировна;[Место защиты: ФГБОУ ВО Саратовский национальный исследовательский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского], 2017

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 9

1.1. Общая характеристика гипотензивных и антиагрегантных лекарственных препаратов 9

1.2. ВЭЖХ в анализе лекарственных препаратов для лечения сердечно-сосудистых заболеваний 22

1.3. Современная ТСХ и ее применение для анализа сердечно-сосудистых лекарственных средств 37

1.4. Капиллярный электрофорез и его применение для определения сердечнососудистых препаратов 42

ГЛАВА 2 Методика эксперимента 50

2.1. Объекты исследования 50

2.2. Методика исследования сердечно-сосудистых лекарственных средств методом обращенно-фазовой ВЭЖХ 52

2.2.1. Методика изучения хроматографического поведения исследуемых веществ в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ 52

2.2.2. Методика определения основных действующих веществ и их примесей в субстанциях и таблетках методом ВЭЖХ 54

2.3. Методика проведения эксперимента с применением тонкослойной хроматографии 56

2.4. Методика проведения эксперимента с применением капиллярного зонного электрофореза 59

2.4.1. Методика подготовки образцов лекарственных препаратов к анализу 59

2.4.2. Техника и методика проведения эксперимента 59

2.5. Оценка погрешностей измерения определяемых величин 61

2.6. Методика валидации количественного определения действующего вещества и примесей в таблетированных формах лекарственных средств 62

ГЛАВА 3. Оптимизация хроматографического разделения основных действующих веществ и примесей сердечно-сосудистых лекарственных средств и разработка условий их определения методом обращенно-фазовой ВЭЖХ 68

3.1. Применение метода обращенно-фазовой ВЭЖХ для определения ингибиторов АПФ каптоприла, лизиноприла, периндоприла и их примесей в субстанциях и таблетированных формах 68

3.1.1. Физико-химические особенности сорбции на октадецилсиликагеле ингибиторов АПФ каптоприла, лизиноприла и периндоприла в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ 69

3.1.2. Оптимизация условий определения основных компонентов и регламентируемых примесей в лекарственных средствах каптоприл, лизиноприл и периндоприл методом обращенно-фазовой ВЭЖХ 75

3.2. Разработка методики анализа комбинированного лекарственного препарата на основе периндоприла и индапамида 82

3.3. Применение метода обращенно-фазовой ВЭЖХ для определения адреноблокаторов атенолола, бисопролола, карведилола, метопролола и их примесей в субстанциях и таблетках 89

3.3.1. Физико-химические особенности сорбции атенолола, бисопролола, карведилола и метопролола в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ 90

3.3.2. Определение основных компонентов и примесей в лекарственных средствах атенолол, бисопролол, карведилол, метопролол методом обращенно-фазовой ВЭЖХ 94

3.4. Применение метода обращенно-фазовой ВЭЖХ для определения антагонистов ангиотензина II лозартана и валсартана в субстанциях и таблетированных формах 102

3.4.1. Физико-химические особенности сорбции лозартана и валсартана в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ 102

3.4.2. Оптимизация условий определения лозартана калия и его примесей методом обращенно-фазовой ВЭЖХ 105

3.5. Применение метода обращенно-фазовой ВЭЖХ для определения амлодипина и клопидогрела 107

3.5.1. Физико-химические особенности сорбции амлодипина и клопидогрела в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ 108

3.5.2. Оптимизация условий определения амлодипина и клопидогрела 110

3.6. Валидация разработанных методик определения лекарственных веществ методом ВЭЖХ 114

3.7. Изучение кинетики высвобождения периндоприла, индапамида и метопролола из таблеток с использованием метода ВЭЖХ 121

ГЛАВА 4. Возможности тонкослойной хроматографии и капиллярного электрофореза при определении сердечо-сосудистых лекарственных средств 127

4.1. Нормально-фазовая тонкослойная хроматография сердечно-сосудистых лекарственных препаратов 127

4.2. Обращенно-фазовая тонкослойная хроматография сердечно-сосудистых лекарственных средств 137

4.3. Оптимизация условий определения некоторых сердечно-сосудистых лекарственных веществ методом капиллярного зонного электрофореза 141

4.4. Применение метода КЗЭ для количественного определения основного действующего вещества в субстанциях и таблетках и оценки содержания примесей 151

Выводы 156

Список используемых источников

Введение к работе

Актуальность темы. В настоящее время заболевания сердечно-сосудистой системы являются самыми распространенными и серьезными заболеваниями в мире. В связи с этим широкое применение в терапевтических целях находят сердечнососудистые лекарственные средства (ЛС) разных классов. Важное место среди них занимают гипотензивные и антиагрегантные ЛС. Их производство в России, как правило, основано на применении зарубежных субстанций. В связи с этим важной задачей является контроль качества субстанций и производимых из них лекарственных форм. Показателями, подлежащими обязательному контролю в ЛС на соответствие требованиям нормативных документов, являются определение подлинности и количественного содержания основного действующего лекарственного вещества (ЛВ) и примесей. В Государственной Фармакопее РФ ХII выпуска нормативные документы для большинства сердечно-сосудистых ЛС отсутствуют. Анализ зарубежных фармакопей показал, что для оценки качества этих ЛС наиболее распространен метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), причем для каждого препарата используются различные сорбенты и колонки, а также специфические и труднодоступные компоненты подвижных фаз. Используются и другие физико-химические методы анализа – тонкослойная хроматография (ТСХ), ИК-спектрометрия, потенциометрическое титрование и др. Представленные в зарубежных фармакопеях методики часто предполагают применение различных методов для определения действующего вещества и примесей. Анализ научной литературы показал, что метод капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) применяется для определения ЛВ в различных объектах. В сравнении с ВЭЖХ его отличает высокая эффективность, малый расход реагентов, низкая себестоимость анализа, что делает его перспективным для контроля качества сердечно-сосудистых ЛС. Однако методики аналитического контроля сердечно-сосудистых ЛС с использованием КЗЭ в фарма-копеях отсутствуют. Очевидно, что применение для анализа ЛС высокоэффективных разделительных методов, к которым относятся ВЭЖХ и КЗЭ, является целесообразным и предпочтительным, так как дает возможность проводить одностадийное разделение и определение компонентов ЛС.

Отсюда вытекает актуальность диссертационной работы, посвященной развитию хроматографических и электрофоретических методов разделения и определения компонентов сердечно-сосудистых ЛС для усовершенствования их контроля в фармацевтической промышленности.

Работа выполнена при поддержке гранта № 4.110.2014/К в рамках выполнения госзадания министерства образования и науки РФ.

Цель работы состояла в разработке унифицированных схем определения основных действующих веществ и примесей сердечно-сосудистых лекарственных средств разных классов методами жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза.

В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

  1. Изучить особенности сорбции сердечно-сосудистых лекарственных веществ разных классов на октадецилсиликагеле в условиях обращенно-фазовой (ОФ) ВЭЖХ в зависимости от природы сорбатов и состава подвижной фазы.

  2. Изучить влияние различных параметров хроматографического процесса на удерживание, эффективность и степень разделения действующего вещества и примесей; предложить оптимальные условия их определения в исследованных ЛС методом ОФ ВЭЖХ.

  3. Применить полученные результаты для разработки валидированных методик анализа индивидуальных и комбинированных лекарственных средств методом обращенно-фазовой ВЭЖХ; применить эти методики для проверки биоэквивалентности дженериков и оригинальных препаратов по их способности к растворению, сопоставить кинетические профили высвобождения лекарственных веществ из препаратов с обычным и пролонгированным действием.

  4. Оценить возможности применения нормально-фазовой (НФ) и ОФ ТСХ для определения сердечно-сосудистых лекарственных веществ с применением унифицированных подвижных фаз; предложить способ модификации хромато-графических фаз хиральными макроциклическими селекторами для разделения энантиомеров адреноблокаторов.

  5. Изучить электрофоретическое поведение сердечно-сосудистых лекарственных веществ и оптимизировать условия определения действующих веществ и примесей методом КЗЭ.

Научная новизна работы.

Впервые выявлены особенности сорбционного поведения 12 сердечнососудистых лекарственных веществ, принадлежащих к разным классам – ингибиторов АПФ (каптоприл, лизиноприл, периндоприл), адреноблокаторов (атенолол, бисопро-лол, карведилол и метопролол), антагонистов рецепторов ангиотензина II (валсартан и лозартан), блокатора кальциевых каналов (амлодипин), антиагреганта (клопидогрел) и диуретика (индапамид) – на октадецилсиликагеле из смесей «фосфатный буфер – аце-тонитрил» в условиях ВЭЖХ. Оценено влияние природы сорбата и состава раствора на характеристики процессов, происходящих в адсорбционном слое и в жидкой фазе;

изучено влияние температуры, состава подвижной фазы и режима элюиро-вания на время анализа, эффективность, селективность хроматографического разделения основных и примесных компонентов ЛС методом обращенно-фазовой ВЭЖХ; найдены оптимальные условия разделения и совместного определения компонентов ЛС в условиях изократического и градиентного элюирования, унифицированные для исследованных сердечно-сосудистых ЛС и не требующие применения специфических или труднодоступных реактивов и сорбентов;

предложены трехкомпонентные органические и водно-органические подвижные фазы для определения действующих веществ большой группы сердечно-сосудистых ЛС методами нормально-фазовой и обращенно-фазовой тонкослойной хроматографии;

показано, что метод КЗЭ с применением фосфатного и боратного буферных растворов пригоден для совместного определения основных компонентов и примесей сердечно-сосудистых ЛС разных классов.

Практическая значимость работы. Разработанные методики разделения и количественного определения основных действующих веществ и примесей с применением ОФ ВЭЖХ внедрены в процесс внутрипроизводственного контроля качества сердечно-сосудистых ЛС в ООО «ПРАНАФАРМ» (г. Самара). Разработанные методики валидированы и включены в фармацевтические статьи предприятия на таблетки «Ли-зиноприл», «Периндоприл», «Индапамид», «Лозартан», «Карведилол», а также проекты фармацевтических статей предприятия на лекарственные препараты, находящиеся на государственной регистрации в Министерстве здравоохранения РФ, а именно таблетки: «Ко-Периндоприл», «Валсартан», «Метопролол». Сочетание двух вариантов тонкослойной хроматографии – нормально-фазовой и обращенно-фазовой – и применение унифицированных и доступных подвижных фаз позволяет надежно и экономично провести оценочный контроль подлинности субстанций исследованной группы сердечно-сосудистых ЛС на производстве и лекарственных форм в аптечной сети. Полученные результаты позволяют расширить возможности использования метода капиллярного зонного электрофореза при контроле качества сердечно-сосудистых ЛС.

На защиту автор выносит:

результаты хроматографического исследования влияния природы сердечнососудистых лекарственных веществ и состава подвижной фазы на их сорбционное поведение в системе сорбат – сорбент – элюент в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ;

зависимости удерживания, эффективности, асимметрии пиков и селективности разделения действующего вещества и примесей от температуры, состава подвижной фазы и режима элюирования; оптимизированные параметры хроматографи-ческого процесса для совместного определения основных и примесных компонентов ЛС методом обращенно-фазовой ВЭЖХ;

разработанные схемы ВЭЖХ-определения компонентов индивидуальных и комбинированных сердечно-сосудистых ЛС, удовлетворяющие валидационным требованиям и результаты апробации этих схем в реальных объектах и методах испытаний ЛС;

обоснование выбора трехкомпонентных органических и водно-органических подвижных фаз для определения действующих веществ сердечнососудистых ЛС методами нормально-фазовой и обращенно-фазовой тонкослойной хроматографии и оценки энантиомерного состава;

- зависимости электрофоретической подвижности, размывания зон компонентов сердечно-сосудистых ЛС от природы и концентрации ведущего электролита, рН, приложенного напряжения и температуры и оптимизированные параметры количественного определения этих компонентов в субстанциях и таблетках методом КЗЭ.

Достоверность результатов работы подтверждается их сходимостью и воспроизводимостью, а также согласованностью результатов, полученных при использовании нескольких независимых методов исследования.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на Всероссийском симпозиуме с участием иностранных ученых «Кинетика и динамика обменных процессов» (г. Краснодар, 2012), XIII Международной конференции «Физико-химические основы ионообменных и хроматографических процессов» (Иониты-2011) (г. Воронеж, 2011), втором съезде аналитиков России (г. Москва, 2013), 2-ом Всероссийском симпозиуме с участием иностранных ученых «Кинетика и динамика обменных процессов» (г. Краснодар, 2013), 2-ой Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (г. Краснодар, 2013), конференции «Теория и практика хроматографии» (г. Самара, 2015), IV Всероссийском симпозиуме с международным участием «Кинетика и динамика обменных процессов» (г. Сочи, 2015 г), III Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (г. Краснодар, 2017).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК, и 11 тезисов докладов.

Вклад автора в представленную работу заключается в экспериментальном исследовании хроматографического и электрофоретического поведения исследованных ЛС, выявлении зависимостей удерживания, подвижностей от состава ПФ и буферного раствора, выборе оптимальных условий анализа, обсуждении результатов, подготовке публикаций, подготовке рекомендаций по их практическому применению.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и двух глав, в которых изложены результаты проведенных исследований и их обсуждение, выводов, списка цитируемой литературы (212 наименований) и приложения. Материалы диссертации изложены на 171 странице текста, включая 52 таблицы, 63 рисунка.

ВЭЖХ в анализе лекарственных препаратов для лечения сердечно-сосудистых заболеваний

Является более мощными сосудорасширяющим средством чем аналогичные препараты первого поколения и характеризуется высокой степенью избирательного действия на сосуды. Они взаимодействуют только с потенциал-зависимыми каналами клеточных мембран L-типа. Амлодипин был внедрен в клиническую практику в 1992 году для лечения артериальной гипертензии и ишемической болезни сердца. Амлодипин - кардиоселективный i-адреноблокатор, не обладает мембраностабилизирующей и внутренней симпатомиметической активностью. Блокируя ток ионов кальция через медленные каналы различных клеток и более избирательно гладкомышечных клеток сосудов, амлодипин уменьшает сосудистое периферическое сопротивление при отсутствии влияния на сократимость сердца. Снижение артериального давления не сопровождается рефлекторной тахикардией за счет медленного развития гипотензивного эффекта, при этом не происходит увеличения выброса катехоламинов. Особенности действия амлодипина определяются его фармакокинетическими параметрами. Он быстро и полно всасывается в желудочно–кишечном тракте, значительно связывается с белком (95–98%). Период полувыведения составляет 35–50 ч, что позволяет в виде фармакологического препарата применять 1 раз в сутки. Амлодипин представляет собой смесь энантиомеров, но фармакологически активным является S-амлодипин. Антагонисты кальция при лечении артериальной гипертензии относят к препаратам первой линии, среди них предпочтение отдаётся препаратам длительного действия, таким как амлодипин [25].

Амлодипин мало растворим в воде, умеренно растворим в этаноле. Торговые названия: акридипин, амловас, амлодак, амлодигамма, амлодифарм, амлокард, амлонг, амлонорм, амлорус, амлотоп, калчек, кардилопин, кармагип, корвадил, кордикор, норваск, нормодипин, омелар, стамло, тенокс [8].

Антагонисты рецепторов ангиотензина II (АРА II) – один из новых и наиболее динамично развивающихся классов антигипертензивных препаратов. С момента своего первого появления АРА II проделали сложный путь развития от новых лекарственных средств для лечения артериальной гипертонии, характеризующихся в первую очередь отличной переносимостью, до одного из основных классов кардиологических препаратов, доказавших свою превосходную эффективность в предотвращении сердечно-сосудистых осложнений у пациентов с АГ, сердечной недостаточностью, мерцательной аритмией, перенесших инфаркт миокарда, с патологией почек [26]. Во второй половине XX века произошел прорыв в развитии практической фармакологии, созданы новые лекарственные препараты на основе понимания механизма развития болезни. И блокаторы рецепторов ангиотензина II являются именно такими препаратами. Первым синтетическим блокатором рецепторов ангиотензинаII, созданным в 1971 году (раньше, чем первый ингибитор ангиотензинпревращающего фермента), был пептид саралазин [27]. Однако он обладал свойствами частичного агониста и мог использоваться только для парентерального введения. Первые непептидные блокаторы рецепторов ангиотензина были синтезированы на основе имидазолиновых производных в середине 1980–х годов и явились прототипами для современного поколения этого класса препаратов. Эти вещества имели преимущества в виде достаточной абсорбции из желудочно–кишечного тракта, биодоступности, отсутствия частичной активности агониста и селективности в блокаде ангиотензиновых рецепторов 1 типа [28].

В клиническую практику блокаторы рецепторов ангиотензина внедрены в 1994 г., когда для лечения артериальной гипертензии был зарегистрирован первый препарат этой группы – лозартан [29]. 2-бутил-4-хлор-1-[[2 -(1Н-тетразол-5-ил)[1,1 -бифенил]-4-ил]-метил]-1Н- имидазол-5-метанол Лозартан является непептидным блокатором рецепторов ангиотензина II. Обладает высокой селективностью и аффинитетом к рецепторам типа AT1 (при участии которых реализуются основные эффекты ангиотензина II). Блокируя указанные рецепторы, лозартан предупреждает и устраняет сосудосуживающее действие ангиотензина II, его стимулирующее влияние на секрецию альдостерона надпочечниками и некоторые другие эффекты ангиотензина II. Характеризуется длительным действием (24 ч и более), что обусловлено образованием его активного метаболита. Характеризуется длительным действием (24 часа и более), не оказывает клинически значимого влияния на частоту сердечных сокращений [23].

Также лозартан препятствует развитию гипертрофии миокарда, понижает давление заклинивания в легочных сосудах, тормозит высвобождение альдостерона, снижает концентрацию норадреналина в крови. Предупреждает задержку натрия и воды в организме, не вызывает натрийуретический (выводящий ионы натрия с мочой) но, оказывает диуретический эффект, снижая концентрацию мочевой кислоты в крови, повышая ее выведение с мочой. Повышает толерантность к физической нагрузке у пациентов с сердечной недостаточностью.

Лозартан хорошо растворим в воде, растворим в этаноле, плохо растворим в органических растворителях (ацетонитрил и метилэтилкетон).

Торговые названия: блоктран, брозаар, вазотенз, веро-лозартан, зисакар, кардомин-сановель, карзартан, козаар, лакеа, лозап, лозарел, лозартан, лозартан калия, лозартан-тева, лориста, лосакор, лотор, презартан, реникард [8].

В дальнейшем были созданы другие непептидные блокаторы рецепторов ангиотензина – валсартан, ирбесартан, кандесартан, телмисартан и эпросартан, и спектр показаний для назначения данного класса препаратов неуклонно рос [29]. Валсартан – антигипертензивное средство, является специфическим антагонистом рецепторов ангиотензина II [8]. НзС CH3 Н3С ]_[N 0\ .он N- [[2 -(1 Н-Тетразол-5 -ил)[ 1,1 -бифенил] -4-ил] метил] -N-валерил-Ь-валин Оказывает избирательное антагонистическое действие на AT1-рецепторы, которые ответственны за реализацию эффектов ангиотензина II. Вследствие блокады AT1-рецепторов повышается плазменная концентрация ангиотензина II, который может стимулировать незаблокированные AT2-рецепторы. Не обладает агонистической активностью в отношении AT1-рецепторов. Сродство валсартана к AT1-рецепторам примерно в 20 000 раз выше, чем к AT2-рецепторам [30]. Периферический вазодилататор, оказывает гипотензивное действие, не ингибирует АПФ; не влияет на содержание общего холестерина, глюкозы и мочевой кислоты в крови.

Валсартан хорошо растворим в этиловом и метиловом спиртах, плохо растворим в воде. Торговые названия: валз, валсафорс, вальсакор, диован, нортиван, тантордио, тарег [8]. Диуретики. Мочегонными средствами, или диуретиками, называют вещества, увеличивающие выведение из организма мочи и уменьшающие содержание жидкости в тканях и серозных полостях организма. Вызываемое диуретиками усиление мочеотделения связано с их специфическим действием на почки, заключающимся в первую очередь в торможении реабсорбции ионов натрия в почечных канальцах, что сопровождается уменьшением реабсорбции воды. Диуретики используют при лечении гипертонической болезни и хронической сердечной недостаточности. Увеличивая диурез, они уменьшают общую циркуляцию крови, соответственно венозный ее возврат к сердцу и нагрузку на миокард, уменьшают застойные явления в легких. Одним из распространенных в терапевтической практике диуретиков является индапамид[8]. 3-(Аминосульфонил)-4-хлор-N-(2,3-дигидро-2-метил-1Н-индол-1-ил)бензамид

Методика определения основных действующих веществ и их примесей в субстанциях и таблетках методом ВЭЖХ

В работе [184] метод КЭ применен авторами для изучения фармакокинетики лизиноприла. При этом показана большая биодоступность действующего вещества в препарате российского производства, по сравнению с немецким прототипом.

Сравнительно недавно вышел обзор [136], посвященный новым разработкам в области определения методом КЭ различных лекарственных препаратов, появившихся за последние 5 лет. Показано, что достаточно большое число работ рассматривают использование метода КЭ для описания процессов ингибирования ферментов [136-140].

Примером такой работы может служить работа [137], в которой метод капиллярного электрофореза применяется для исследования ингибиторной способности пяти различных ингибиторов АПФ (каптоприла, лизиноприла, периндоприла, куинаприла и беназеприла).

В работе [138] аналогичные исследования ингибиторной способности проведены для 12 протеинов, полученных из различных морепродуктов. При этом результаты, полученные методом КЭ сравниваются с полученными методом ВЭЖХ, и показана их высокая сходимость.

Сопоставимость результатов, полученных методами КЭ и ВЭЖХ при определении чистоты различных лекарственных веществ показана и в обзоре [169].

В российской печати вышел обзор [183], посвященный использованию КЭ в фармацевтическом анализе. Описываются многочисленные подходы и практические приложения метода, в том числе для определения содержания основных компонентов и примесей в лекарственных препаратах, стереоселективных разделений, анализа витаминов, стехиометрических определений.

Также в ряде работ для определения гипотензивных препаратов используется другой вариант капиллярного электрофореза – мицеллярная электрокинетическая хроматография [141,142].Так, в работе [142] метод КЗЭ предлагается использовать для определения эналаприла малеата в таблетках «Васотек». При этом в качестве ведущего электролита выступает фосфатный буфер или боратный буфер (рН около 9), определение проводится при комнатной температуре. Однако для разделения цис- и транс- изомеров эналаприла в этой работе предложено использовать метод мицеллярной электрокинетической хроматографии. При этом в качестве мицеллообразователя в ведущий электролит добавляли 40-100 мМ додецилсульфата натрия.

Авторы [141] использовали метод капиллярного электрофореза и мицеллярной электрокинетической хроматографии при разработке условий определения различных сердечно-сосудистых лекарственных препаратов, включая -блокаторы, антиаритмические препараты, блокаторы кальциевых каналов, ингибиторы АПФ. Показана возможность разделения смеси из двенадцати различных лекарственных препаратов. При этом результаты определения согласуются с результатами, полученными методом ВЭЖХ.

Помимо сердечно-сосудистых лекарственных средств капиллярный электрофорез может быть использован для контроля качества и других препаратов: хлорохина [143], аскорбиновой кислоты [144], нестероидных противовоспалительных препаратов [145-148], антибактериальных препаратов (норфлоксацина, левофлоксацина) [149], лекарственных форм на основе рутина [150], обезболивающих средств [177], бензодиазепина и его метаболитов [176].

Также как и в случае с ВЭЖХ, достаточно широко в литературе рассматривается возможность применения метода КЭ при определении лекарственных веществ в биологических матрицах (плазме, моче). Этой проблеме посвящен обзор [178]. Рассмотрены различные способы концентрирования пробы, включая как предварительное концентрирование (жидкость-жидкостная экстракция, твердофазная экстракция), так и уникальные для метода КЭ способы on-line концентрирования в капилляре.

В России проблемами капиллярного электрофореза наиболее широко занимается Карцова Л.А. с коллегами, на базе Санкт-Петербургского государственного университета. Так, к примеру, в работе [185] исследованы возможности различных вариантов on-line концентрирования ионогенных и нейтральных аналитов (катехоламины, аминокислоты и стероидные гормоны) в условиях капиллярного зонного электрофореза и мицеллярной электрокинетической хроматографии.

Капиллярный электрофорез стал очень интересным альтернативным аналитическим методом определения энантиомеров лекарственных препаратов. Высокая эффективность, получаемая КЭ, даёт возможность осуществлять энантиомерное разделение за более короткое время по сравнению с ВЭЖХ. Кроме того, КЭ имеет целый ряд преимуществ, таких как: эффективные хиральные селекторы, требующие малых затрат по сравнению с хиральными колонками ВЭЖХ; а также низкий расход растворителей и реагентов. В ряде исследований сообщается об успешном разделении энантиомеров лекарственных препаратов методом КЭ. К ним относятся: обезболивающие препараты (бупивакаин, мепивакаин, кетамин и прилокаин) [151], фенирамин [152], нейротоксины [153], ривастигмин [154], метадон [155], карведилол [156].

В обзоре [181] приводятся сведения об успешном разделении энантиомеров различных лекарственных препаратов с помощью различных вариантов КЭ, включая капиллярный зонный электрофорез, мицеллярную электрокинетическую хроматографию, изотахофорез и электрохроматографию. Рассмотрено применение различных хиральных селектров – циклодекстринов и их производных, модифицированных краун-эфиров, протеинов, антибиотиков, хиральных покрытий для капилляров. В работе [171] приведены сведения об использовании хирального КЭ при определении энантиомеров лекарственных веществ в составе сложных биологических матриц – биологических жидкостях, волосах. Показана применимость метода для изучения фармакокинетики энантиомеров лекарственных препаратов.

Обзор [182] посвящен проблеме разделения энантиомеров лекарственных веществ методом КЭ в присутствии нейтральных циклодекстринов. Показано, что применение в качестве хирального агента гептакис(2,3,6-три-О-метил)--циклодекстрина позволило добиться успешного разделения для 47 из 86 лекарственных соединений.

В работе [179] рассматриваются возможности использования смесей электронейтральных и заряженных циклодекстринов в качестве хиральных агентов при разделении энантиомеров лекарственных веществ методом капиллярного электрофореза.

Проблемам использования циклодекстринов в качестве хиральных селекторов для КЭ посвящен и обзор [180]. Однако, в нем автор более глубоко рассматривает влияние различных условий – рН ведущего электролита, тип и концентрация циклодекстрина, присутствие органических растворителей и комплексных соединений в ведущем электролите – на процесс энантиоселективного разделения.

Вопрос разделения энантиомеров гипотензивных лекарственных средств методом КЭ остаётся открытым. В работе [157] сообщается об исследовании возможности энантиоселективного разделения 86 лекарственных препаратов методом КЭ с использованием в качестве хирального селектора гидроксипропил--ЦД. Успешно разделить удалось лишь энантиомеры 34 препаратов. К оставшимся 52 относятся антигипертензивные лекарственные средства, среди которых бисопролол, атенолол, карведилол. Не удалось разделить оптические изомеры бисопролола и атенолола и с использованием в качестве хирального селектора и -ЦД [158].

В работе [159] представлены результаты хирального разделения пропранолола и некоторых его метаболитов методом КЭ с использованием в качестве хирального селектора гидроксипропил--циклодекстрина. Показано, что оптимальной концентрацией хирального агента является 17 мМ. Рассмотрена зависимость времени миграции и эффективности хирального разделения от значения рН ведущего электролита, в качестве оптимального выбрано значение рН=5.

Физико-химические особенности сорбции на октадецилсиликагеле ингибиторов АПФ каптоприла, лизиноприла и периндоприла в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ

Сочетание ингибитора АПФ периндоприла с диуретиком индапамидом обеспечивает быстрое достижение нормального уровня артериального давления. Помимо этого, выпускаются и лекарственные препараты, содержащие только индапамид в качестве активного действующего вещества (арифон, акрипамид, лорвас, ионик, тензар). В научной литературе имеется ограниченное количество публикаций по анализу периндоприла и индапамида. Так, в работе [205] рассматривается возможность их определения в таблетированных лекарственных формах с помощью ВЭЖХ с диодно-матричным детектированием. Ряд публикаций посвящен определению периндоприла, индапамида и их метаболитов в крови и других биологических жидкостях [206-207]. Эксперимент проводили с использованием жидкостного хроматографа «Knauer» с УФ-детектором, термостатом колонок «Jet Stream II Plus», позволяющим проводить элюирование в диапазоне температур 4 – 90 С. Использовали стальную хроматографическую колонку (250 х 4,6 мм), заполненную сорбентом «Диасфер С18» зернением 5 мкм («БиоХимМак СТ»). Перед каждым анализом колонку промывали элюентом в течение 15 минут. Хроматографирование осуществляли как в изократическом, так и в градиентном режимах элюирования. В качестве элюентов использовали смеси фосфатного буфера с рН 2.0 и ацетонитрила с концентрацией ацетонитрила 30-76 % об. Градиентное элюирование осуществляли с применением элюентов «фосфатный буфер - ацетонитрил, 30% об.» (А) и "ацетонитрил" (Б). Градиент состава подвижной фазы представлен в таблице 19. Скорость потока подвижной фазы составляла 1,0 мл/мин. Объем вводимой пробы - 20 мкм. Детектирование проводили при =215 нм [61].

Для разработки методики определения периндоприла и индапамида в индивидуальных и комбинированных лекарственных препаратах методом обращенно-фазовой ВЭЖХ были сопоставлены закономерности их сорбции из водно-ацетонитрильных растворов на октадецилсиликагеле при температуре 30оС и варьировании концентрации ацетонитрила от 24 до 76 % об. в фосфатном буфере (рН 2,0). Установлено, что вытеснительные модели Снайдера-Сочевинского и Скотта-Кучеры выполняются при концентрации ацетонитрила в фосфатном буфере (рН = 2,0) меньше 60 % об. (XM 0,26), рис. 12:

Рисунок 12. Зависимости величины, обратной фактору удерживания периндоприла (1) и индапамида (2) от состава подвижной фазы «фосфатный буфер (рН = 2,0) – ацетонитрил», построенные в рамках модели Скотта-Кучеры, 30С. При больших концентрация ацетонитрила наблюдается сильное отклонение от линейной зависимости 1/k от XM, причем характер этих отклонений свидетельствует о том, что в подвижной фазе происходит сольватация "сорбат - модификатор". Для обоих лекарственных веществ это связано с наличием в их молекулах большого числа полярных групп. Большее удерживание индапамида по сравнению с периндоприлом, очевидно, связано с более сильным (дисперсионным) взаимодействием его молекул с октадецилсиликагелем, что согласуется с рассчитанными значениями логарифма констант распределения исследуемых соединений в системе октанол - вода. Для индапамида log P = 2,64, что превышает соответствующую величину для периндоприла (log P = 2,17).

При температуре 30 оС времена удерживания исследованных веществ составляют более 40 минут и наблюдается сильное размывание зон. Установлено, что с ростом температуры колонки факторы удерживания лекарственных веществ уменьшаются. Согласно литературным данным [61] наиболее подходящим температурным режимом для определения периндоприла методом обращенно-фазовой ВЭЖХ является его элюирование при температуре 70 оС. Приразработке ВЭЖХ-методик определения лекарственных веществ необходимо соблюдать требования по экспертизе лекарственных средств [208]: методика должна обеспечивать достаточно высокие показатели эффективности хроматографической колонки; фактор асимметрии пиков основных компонентов и примесей должен быть минимизирован; должно обеспечиваться полное разрешение пиков основных компонентов и примесей; относительное стандартное отклонение площадей пиков не должно превышать 5,0 %; предел количественного определения примесей не должен превышать максимально допустимого содержания примесей в соответствующем испытуемом растворе.

Для выбора оптимальных условий хроматографического разделения периндоприла, индапамида и их примесей использовали стандартный раствор двухкомпонентной модельной смеси (концентрация периндоприла эрбумина – 0,2 мг/мл, концентрация индапамида – 0,0625 мг/мл) и стандартный раствор пятикомпонентной модельной смеси (концентрация периндоприла эрбумина – 1,0 мг/мл; концентрация индапамида – 0,25 мг/мл; концентрация примеси В – 0,02 мг/мл; концентрация примеси F – 0,006 мг/мл; концентрация примеси А – 0,00125 мг/мл).

Хроматограмма модельной смеси периндоприла и индапамида, полученная в условиях градиентного элюирования при температуре 70 оС, представлена на рис. 13.

Видно, что пики, соответствующие периндоприлу и индапамиду, хорошо разделены, имеют малую асимметрию (А 2.0) и размывание, что позволяет осуществить быстрый анализ (менее 10 мин) основных компонентов комбинированного препарата "Ко-периндоприл".

Хроматограмма пятикомпонентной модельной смеси, включающей, помимо периндоприла и индапамида, и нормируемые примеси (периндоприла примеси В, периндоприла примеси F, индапамида примеси A), в концентрциях, соответствующих максимально допустимому содержанию примесей в таблетке, согласно нормативным документам, представлена на рис. 14.

Рисунок 14. Хроматограмма пятикомпонентной модельной смеси стандартов периндоприла и индапамида: колонка «Диасфер С18», 250 х 4.6 мм; 70 С; =215 нм; объем пробы 10 мкл; Fc = 1 мл/мин; градиентный режим подачи элюента (табл. 19), 1 – периндоприла примесь B ((2S,3aS,7aS)-1-[(2S)-2-[[(1S)-1-карбоксибутил]амино]пропаноил]октагидро-1H-индол-2-карбоксикислота); 2 – периндоприл; 3 – индапамид; 4 – индапамида примесь А (4-хлор-N-(2-метил-1H-индол-1-ил)-3-сульфамоилбензоламид); 5 – периндоприла примесь F (этил-(2S)-2-[(3S,5aS,9aS,10aS)-3-метил-1,4-диоксодекагидропиразино[1,2-a]индол-2(1H)-ил]пентаноат). При использовании указанного режима концентрация ацетонитрила в фосфатном буфере изменяется от 30 до 51 % об. и обратно. Следовательно, удрживание периндоприла и индапамида, в основном, определяется взаимодействием "сорбат - сорбент" и не осложнено сольватацией «сорбарт – ацетонитрил» в растворе подвижной фазы. Поэтому время удерживания увеличивается в ряду периндоприла примесь В периндоприл периндоприла примесь F. В этом же ряду возрастает липофильность (log P) этих близких по строению молекул: 1,89 2,17 2,22 (табл. 1). Большее удерживание индапамида примеси А (log P=2,72) по сравнению с индапамидом (log P=2.64) также обусловлено различием в липофильности их молекул. Хроматографические характеристики компонентов модельной смеси стандартов, полученные с использованием разработанных условий, представлены в таблице 20.

Обращенно-фазовая тонкослойная хроматография сердечно-сосудистых лекарственных средств

Энантиомерный контроль лекарственных средств предусмотрен фармакопеями западных стран (США, ЕС), однако в Российской Федерации на данный момент он практически отсутствует. Между тем, многие субстанции сердечно-сосудистых ЛС поставляются на фармацевтический рынок в виде рацемических смесей. Для проверки энантиочистоты фармпрепаратов используют в основном методы ВЭЖХ и газовой хроматографии. Как отмечалось выше экспрессность и простота метода ТСХ способствует тому, что на долю этого метода при анализе фармпрепаратов приходится 60% научных работ [127]. В последнее время появились работы, в которых метод обращенно-фазовой ТСХ с хиральными селекторами стали применять для определения энантиочистоты ЛС [124-127].

Нами впервые в условиях нормально-фазовой ТСХ изучено хроматографическое поведение адреноблокаторов (атенолола, бисопролола и карведилола), субстанции которых, как известно, представляют собой рацемические смеси, при добавлении в подвижную фазу динамического модификатора сорбента – -циклодекстрина (SAFT) и 2-гидроксипропил--циклодекстрина (Aldrich).

Выше было показано, что оптимальным элюентом для этой группы лекарственных веществ является элюент №2 «дихлорметан – метанол – гидроксид аммония» (табл. 47). Предварительно было установлено, что оба хиральных модификатора хорошо растворимы в метаноле, а при небольших концентрациях (0,004 мг/мл) – и в трехкомпонентном элюенте №2. Очевидно, что оба хиральных макроциклических соединения, имеющих сильно полярные группы у входа в полость макроцикла, способны к адсорбции на поверхности силикагеля из органической подвижной фазы при ее движении по пластине под действием капиллярных сил.

Навеску модификатора растворяли в метаноле, затем добавляли насыщенный водный раствор гидроксида аммония и дихлорметан. В получившийся прозрачный элюент ставили в горизонтальном положении пластины Sorbfil ПТСХ-П-В-УФ (1010 см) с силикагелем на полимерной подложке с нанесенными на стартовую линию растворами субстанций исследуемых веществ (п. 2.3). Детектирование осуществляли в ультрафиолете при длине волны 254 нм.

При модификации подвижной фазы «дихлорметан – метанол – гидроксид аммония (70:10:0,8)» -циклодекстрином (0,004 мг/мл) для субстанции атенолола разделения пятна на две зоны не происходило, для субстанций карведилола и бисопролола происходило частичное разделение (зоны очень близко примыкали друг к другу). Но увеличивая содержание метанола в составе исходного элюента, удалось достичь полного разделения исходной зоны (на старте) на две зоны (по завершении процесса). Типичные хроматограммы для бисопролола с использованием составов элюентов (75:13,5:0,8) и (75:19:0,8) с добавкой -циклодекстрина (0,004 мг/мл) представлены на рис. 47.

Хроматограммы субстанции бисопролола, полученные методом планарной ТСХ пластинках ПТСХ-П-В-УФ при различных составах элюента, Vпробы =3 мкл, = 254 нм: «дихлорметан – метанол – гидроксид аммония» (75:13,5:0,8) с концентрацией -ЦД 0,004 мг/мл (1), «дихлорметан – метанол - гидроксид аммония» (75:19:0,8) с такой же концентрацией -ЦД (2).

Таким образом, нами были предложены и унифицированы условия качественного определения подлинности и чистоты для субстанций и таблеток всех одиннадцати исследуемых лекарственных веществ методом нормально-фазовой ТСХ. Показано, что элюент №1 «толуол – ледяная уксусная кислота – метанол (75:25:1)» можно использовать для определения подлинности трех исследованных ингибиторов АПФ (каптоприла, лизиноприла и периндоприла). Элюент №2 «дихлорметан – метанол – гидроксид аммония (70:10:0,8)» позволяет осуществить качественный анализ четырех лекарственных веществ (бисопролол, карведилол, метопролол, амлодипин). Для определения клопидогрела, валсартана, лозартана и атенолола было несколько изменено соотношение компонентов в элюентах №1 и №2. Было изучено влияние добавки -циклодекстрина и 2-гидроксипропил--циклодекстрина (0,004 мг/мл) в подвижную фазу «дихлорметан – метанол – гидроксид аммония» на хроматографическое поведение зон бисопролола, атенолола и карведилола в условиях нормально-фазовой ТСХ. Установлено, что при модификации элюента «дихлорметан – метанол – гидроксид аммония (70:10:0,8)» как -циклодекстрином так и 2-гидроксипропил--циклодекстрином наблюдается разделение энантиомеров бисопролола и карведилола, однаконаилучшее разделение имеет место в случае добавки 2-гидроксипропил--циклодекстрина.

В научной литературе и нормативных документнах(фармакопеи США, ЕС, РФ) практически отсутствуют данные о возможностях применения метода обращенно-фазовой ТСХ для определения сердечно-сосудистых лекарственных средств. В то же время метод обращенно-фазовой ТСХ позволяет в качестве элюентов использовать сравнительно малотоксичные водно-ацетонитрильные смеси, что делает разработку условий определения подлинности и чистоты лекарственных соединений в рамках данного метода достаточно актуальной задачей.

Для исследования хроматографического поведения исследованных лекарственных средств на обращенно-фазовых пластинах Merck TLS aluminiumsheets RP-18 F254 были использованы составы элюентов, которые ранее использовались нами в условиях ВЭЖХ – смесь ацетонитрила и фосфатного буфера (60:40). Подробно условия проведения ТСХ эксперимента описаны в п. 2.3. При выборе оптимальных условий для определения подлинности и чистоты исследуемых лекарственных препаратов рассматривали зависимости фактора задержки Rf от значения рН фосфатного буфера.

Установлено, что при варьировании рН фосфатного буфера в интервале от от 2 до 5 для ингибиторов АПФ каптоприла и периндоприла наблюдается очень сильное размывание зон, в связи с чем хроматограммы каптоприла и периндоприла на пластинах Merck TLS aluminiumsheets RP-18 F254 не были получены.

На рисунке 49 приведены зависимости Rf некоторых исследуемых соединений, относящихся к различным классам сердечно-сосудистых лекарственных веществ, от значения рН фосфатного буфера в смеси «фосфатный буфер - ацетонитрил», (60:40).

Видно, что с увеличением значения рН в интервале от 2 до 5 удерживание метопролола и клопидогрела значительно возрастает, а фактор задержки Rf, соответственно, уменьшается. При этом наиболее сильно данный эффект проявляется для метопролола, что может быть связано с его протонированием в кислой среде. При повышении значения рН элюента метопролол переходит в молекулярную форму, что и приводит к значительному повышению его удерживания. С другой стороны, молекулы валсартана могут как протонироваться так и превращаться в анион. Вероятно, именно этим можно объяснить достаточно слабое изменение его удерживания с увеличением рН элюента.