Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 12
1.1 Строение селезенки в норме и влияние на нее экзогенных и эндогенных факторов 12
1.1.1 Строение селезенки в норме 12
1.1.2 Морфофункциональные особенности селезенки при воздействии на организм различных химических, физических и биологических факторов 16
1.2 Спинномозговая жидкость. Ее образование, циркуляция, влияние на различные системы органов 21
Глава 2 Материал и методы исследования 29
2.1 Взятие спинномозговой жидкости и подготовка ее к введению 29
2.2 Схема эксперимента и методы исследования селезенки 29
Глава 3 Результаты исследований 35
3.1 Структурные особенности селезенки новорожденных крыс после трех и десятикратного парентерального введения ксеногенной спинномозговой жидкости 35
3.2 Структурные особенности селезенки крыс периода полового созревания после трех- и десятикратного введения ксеногенной спинномозговой жидкости. 43
3.3 Структурные особенности селезенки половозрелых крыс после трех- и десятикратного введения ксеногенной спинномозговой жидкости 52
3.4 Структурные особенности селезенки крыс периода предстарческих изменений после трех- и десятикратного введения ксеногенной спинномозговой жидкости 60
3.5 Структурные особенности селезенки крыс зрелого возраста после облучения и его коррекции спинномозговой жидкостью 68
Глава 4 Обсуждение результатов исследований 78
Заключение 100
Выводы 103
Практические рекомендации 104
Список сокращений 105
Список литературы 106
- Морфофункциональные особенности селезенки при воздействии на организм различных химических, физических и биологических факторов
- Структурные особенности селезенки новорожденных крыс после трех и десятикратного парентерального введения ксеногенной спинномозговой жидкости
- Структурные особенности селезенки половозрелых крыс после трех- и десятикратного введения ксеногенной спинномозговой жидкости
- Структурные особенности селезенки крыс зрелого возраста после облучения и его коррекции спинномозговой жидкостью
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Стремительное развитие цивилизации, увеличение объемов добычи, переработки и использования углеводородов, радиоактивных веществ, влечет за собой активное антропогенное загрязнение окружающей среды с повышением фона радиации на производстве и в быту. Влияние столь неблагоприятных факторов на здоровье человека приводит к структурным изменениям в тканях, нарушению деятельности отдельных органов, а в особо тяжелых случаях и всего организма в целом. Все это заставляет ученых обращать пристальное внимание на органы иммуногенеза, обеспечивающие защитные механизмы организма. Селезенка является крупнейшим периферическим лимфоидным органом, вносящим значительный вклад в формирование иммунного ответа, количественный и качественный состав иммунокомпетентных клеток крови и лимфы (Йегер Л., 1999; Путалова И. Н. и др., 2010; Филимонов В. И. и др, 2013;Никитюк Д. Б. и др, 2015; CestaM. F., 2006).
Будучи по своей функции фильтром крови, селезенка быстро реагирует на содержащиеся в ней антигены и поврежденные клетки изменениями микроструктуры и цитоархитектоники (Афанасьев Ю. И., 2002). В то же время селезенка крайне уязвима для экзогенного воздействия как орган, содержащий активно пролиферирующие клетки. Достаточно широко изучены морфологические преобразования селезенки после воздействия различных веществ химической и биологической природы, а также стрессовых и тяжелых патологических состояний, гипергравитации, ионизирующего излучения (Груздева О. Н., 1999; Клименко М. О, 2010; Мороз Г. А., 2011; Бахмет А. А., 2014; Барканов В. Б. и др., 2015; Кварацхелия А. Г., 2016).
Возрастающее влияние экзогенных факторов на организм требует поиска новых способов укрепления его защитных функций. Несмотря на большое разнообразие иммуномодулирующих препаратов, изыскание новых средств для коррекции иммунопатологических состояний не прекращается. Одним из перспективных направлений является использование в этих целях природных биогенных препаратов, к которым относим ксеногенную спинномозговую жидкость (КСМЖ, цереброспинальная жидкость, ликвор).
Спинномозговая жидкость (СМЖ) является уникальной биологической средой организма, обеспечивающей нормальное функционирование нервной системы. Специфика образования СМЖ и пути ее циркуляции не только по цистернам и межоболочечным пространствам, но и в паренхиме головного мозга, обуславливают транспортно-регуляторную функцию ликвора (Пикалюк В. С. и др, 2010). Химический состав ликвора позволяет рассматривать его как интегрирующее звено между эндокринной и центральной нервной системами. А частичный отток СМЖ через периневральные пространства, окружающие черепномозговые и спинномозговые нервы, обеспечивает ее связь с иммунной
системой. СМЖ богата различными органическими соединениями, в том числе и биологически активными веществами, такими как нейропептиды, факторы роста, гормоны, оказывающие влияние на клетки лимфоидного ряда (Пикалюк В. С. и др, 2010). Содержание в ликворе некоторых из этих веществ значительно превосходит их концентрацию в плазме крови (Thompson E.J, 2005). Учитывая высокий регуляторный потенциал ликвора, теоретический интерес представляет изучение его влияния на органы иммуногенеза «в обход» гематоэнцефалического барьера. Отсутствие видовой и индивидуальной специфичности дает возможность использовать ксеногенной СМЖ как биостимулятор без предварительной очистки и обработки, делает возможным введение его любым видам животных, в том числе и человеку, без риска вызвать сильные аллергические реакции или отторжение (Головацкий А. С. и др., 2008; Мороз Г. А., 2010). Аллоликворотерапия и ксеноликворотерапия неоднократно успешно применялись в практической медицине при острых кровопотерях (Атанова Е. Н., 1931), неврологических (Неуймина М.К. и др., 1991) и психических (Пикалюк В. С. и др., 2016) заболеваниях без глубокого теоретического обоснования и фундаментальных доклинических исследований. Доступность и обширность сырьевой базы обуславливает низкую себестоимость и удобство изготовления лекарственного препарата на основе ксеногенного ликвора. По химическому составу наиболее близким к ликвору человека является спинномозговая жидкость крупного рогатого скота (Ткач В. В., 1988). Возможность использовать ликвор коров в качестве основы для биопрепарата обуславливает широкую сырьевую базу, низкую себестоимость и удобство его изготовления.
Степень разработанности темы. Исследование спинномозговой жидкости началось в первой половине XX века и было направлено на выяснение ее функций. Постепенно, с развитием биохимических и иммунологических методов, был установлен химический и клеточный состав ликвора (Фридман А. П., 1971; Цветанова Е. М., 1986). Изучение эффектов ксеногенной СМЖ на различные органы и ткани учеными Крымской морфологической школы началось в 80-е годы прошлого столетия под руководством профессора В. В. Ткача. В частности, изучено влияние ликвора на жизнеобеспечивающие органы и системы, эндокринные железы, сосудистые сплетения желудочков мозга. На основании теоретических и экспериментальных данных была предложена концепция регуляторного воздействия ликвора (Ткач В. В. и др., 1988; Кривенцов М. А., 2006; Пикалюк В. С. и др., 2012). В формирование генерализованного ответа организма на экзогенное воздействие ксеногенной СМЖ ведущую роль занимает система иммуногенеза. Ранее были изучены особенности структуры брыжеечных лимфатических узлов (Кривенцов М.А., 2008), тимуса (Кривенцов М. А., 2015), а также красного костного мозга крыс (Шаймарданова Л. Р., 2011) на фоне введения ликвора. При этом остаются неизученными морфологические преобразования
крупнейшего периферического лимфоидного органа— селезенки, без чего невозможно составить целостное представление о реакции иммунной системы реципиента на введение ксеногенной СМЖ.
В связи с этим, представляет интерес изучение структурных особенностей селезенки под действием ксеногенной спинномозговой жидкости, а также выявление возможностей ликвора влиять на репаративные потенции органа.
Цель исследования. Комплексно изучить структурные преобразования селезенки крыс в возрастном аспекте и после тотального воздействия ионизирующего излучения на животных половозрелого возраста при парентеральном введении ксеногенной спинномозговой жидкости.
Задачи исследования:
1. Изучить морфологические особенности селезенки крыс различных
возрастных групп.
-
Описать особенности морфологической структуры селезенки под действием ксеногенной спинномозговой жидкости в зависимости от возраста животных и кратности введения ликвора.
-
Выявить морфологические изменения в селезенке крыс после однократного тотального гамма-облучения и оценить репаративные возможности органа после введения ксеногенного ликвора в постлучевом периоде.
Научная новизна. В работе впервые на экспериментальном материале
описаны морфологические особенности паренхимы селезенки крыс после
введения ксеногенного ликвора на разных стадиях постнатального онтогенеза в
зависимости от кратности введения. Установлен факт отсутствия
иммунопатологических реакций со стороны изучаемого органа. Созревание морфологических структур селезенки новорожденных крыс наступает в более ранние сроки. Крысы периода полового созревания реагируют увеличением В-зон или Т-зон белой пульпы в зависимости от кратности введения КСМЖ. Морфологические изменения в селезенке половозрелых крыс аналогичны изменениям, возникающим при воздействии иммуностимулирующих препаратов и проявляются гиперплазией белой пульпы с увеличением количества вторичных лимфоидных узелков. В период предстарческих изменений ликвор оказывает иммуностимулирующее воздействие после трехкратного введения. Обнаружен эффект ускорения процессов репарации селезенки крыс половозрелого возраста после тотального однократного облучения в дозе 5 Гр.
Практическая значимость полученных результатов
В диссертационном исследовании продемонстрированы постнатальные морфофункциональные изменения селезенки крыс после введения ксеногенной спинномозговой жидкости. Эффекты СМЖ, как одной из гуморальных сред, обеспечивающей интеграцию нервной, эндокринной и иммунной систем, важны для построения механизма центральной регуляции функций селезенки и работы
гематоэнцефалического барьера. Материалы исследования дополняют
представление о биологических эффектах ксеногенного ликвора на органы
иммуногенеза в норме и после однократного тотального гамма-облучения.
Полученные результаты подтверждают предположение об
иммуностимулирующих потенциях ликвора и возможности его использования в качестве сырья для биопрепарата широкого спектра действия.
Основные положения и выводы работы были внедрены в учебный и научный процесс на кафедрах нормальной анатомии ФГБОУ ВО Ульяновский государственный университет, кафедрах биологии, патологической анатомии с секционным курсом, лечебной физкультуры и спортивной медицины, физиотерапии с курсом физического воспитания Медицинской академии им. С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В. И. Вернадского».
Научные положения, выносимые на защиту:
1. Степень выраженности и направленность изменений в паренхиме селезенки
под действием ксеногенной спинномозговой жидкости зависят от возраста
подопытных животных и кратности введения ликвора. У новорожденных
животных наблюдали форсированное созревание органа; у молодых и зрелых
крыс селезенка реагирует гиперплазией белой пульпы; в возрасте предстарческих
изменений происходит замедление возрастной инволюции селезенки.
2. Многократное введение ксеногенного ликвора облученным животным
приводит к появлению в лимфоидных узелках центров размножения лимфоцитов,
заселению лимфоцитами из центральных органов иммуногенеза маргинальной
зоны и красной пульпы селезенки, вследствие чего репарация органа завершается
в более короткие сроки.
Апробация результатов и степень их достоверности
Анализ литературных источников позволил в достаточной степени оценить
актуальность поставленной научной задачи и степень изученности вопроса.
Выбранные методы исследования соответствуют цели и задачам. Все
количественные данные подверглись статистической обработке
параметрическими и непараметрическими методами с уровнем достоверности при вероятности ошибки р<0,05.
Материалы диссертации были освещены на 3 зарубежных и 5 всероссийских конференциях с международным участием.
Личный вклад диссертанта. Автором самостоятельно проведены патентно-информационный поиск, анализ научной литературы по данной проблеме, получение экспериментального материала для световой и электронной микроскопии, изготовление и анализ гистологических препаратов и электроннограмм, органо- и гистоморфометрия с последующей их статистической обработкой и обобщением полученных результатов. Главы диссертации написаны
диссертантом самостоятельно. Под руководством научного руководителя соискатель провёл анализ и обобщение результатов исследования, сформулировал главные положения и выводы. Самостоятельно и в соавторстве с научным руководителем написаны статьи.
Публикации. Основные результаты проведенного исследования изложены в 13 научных работах, из них 5 — в специализированных рецензируемых журналах (3 — в рецензируемых журналах, внесенных в перечень ВАК Российской Федерации), 8 — в материалах конгрессов, съездов и научных конференций.
Объем и структура диссертации. Работа изложена в соответствии с существующими требованиями ГОСТ Р 7.0.11-2011 на 125 страницах компьютерного текста и включает в себя введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, заключение, практические рекомендации, список условных сокращений, список использованной литературы. В диссертационной работе представлено 19 таблиц и 39 рисунков, из которых 28 — микрофотографии. Список литературы содержит 158 источников, из них 111 отечественных и 47 иностранных.
Морфофункциональные особенности селезенки при воздействии на организм различных химических, физических и биологических факторов
Все функциональные зоны селезенки реагируют на воздействие экзо- и эндогенных факторов.
Наиболее стабилен соединительнотканный остов селезенки. Его изменения связаны в первую очередь с естественной возрастной инволюцией и коллагенизацией волокон у животных периода выраженных старческих изменений. Кроме того, при нарушениях кровообращения вследствие действия внешних или внутренних факторов наблюдали отек эндотелиоцитов [20].
Реакция красной пульпы проявляется в основном изменением плотности клеток вследствие снижения или уменьшения кровенаполнения венозных синусов, а также изменением качественного состава спленоцитов. Наблюдали увеличение числа плазматических клеток и макрофагов в тяжах Бильрота при активации гуморального звена иммунитета [151].
Реакция белой пульпы селезенки на внешнее воздействие более разнообразна.
При воспалительных реакциях в организме и травмах селезенка отвечает гиперплазией белой пульпы, увеличением плотности клеток как в белой, так и в красной пульпе. Изменяется клеточный состав в различных зонах лимфоидных узелков. Увеличивается количество Т- и В-лимфоцитов в периферической крови. Изменения достигают своего максимума на 21–28 сутки [36, 62, 108].
При тяжелых патологических состояниях напряженность иммунитета сменяется уменьшением относительной площади белой пульпы, уменьшается плотность клеток как в белой, так и в красной пульпе вследствие уменьшения пролиферации лимфоцитов и миграции их в кровоток [36, 37].
Антигенная стимуляция организма сказывается на изменении клеточного состава и плотности клеточных элементов в различных зонах ЛУ, в первую очередь малых лимфоцитов и тучных клеток [113, 142,].
Иммуносупрессоры органической природы, такие как циклофосфан, гидрокортизон, вызывают гипоплазию белой пульпы селезенки, особенно В-зависимых зон, угнетение пролиферации лимфоцитов и как следствие гуморального звена иммунитета [33, 68, 91, 109].
В настоящий момент разработано большое количество иммунотропных препаратов органического происхождения, в том числе бактериального, растительного, на основе одноклеточных водорослей и т.п. Их действие проявляется, как правило, гиперплазией белой пульпы селезенки за счет увеличения количества лимфоидных узелков с центрами размножения лимфоцитов, увеличения их размеров вплоть до слияния близлежащих узелков. Иммунотропный эффект достигается усилением пролиферации лимфоцитов, сокращения сроков созревания Т- и В-лимфоцитов [13, 23, 58, 90, 94, 108]. Как правило, наиболее интенсивно на введение иммуномодуляторов реагируют животные молодого и зрелого возраста. У животных старческого и предстарческого возрастов в силу естественной инволюции органов иммуногенеза реакция селезенки либо выражена слабее, либо носит обратный характер [13].
Влияние ионов металлов и их неорганических соединений зачастую зависит от продолжительности введения. На ранних сроках эксперимента после однократного введения микрочастиц золота, меди, свинца, селенита натрия в селезенке наблюдали усиление пролиферации лимфоцитов, проявившихся в увеличении количества и размеров герминативных центров в лимфоидных узелках селезенки, а следом и увеличении маргинальной зоны [61, 88, 95, 97,]. Накопление частиц тяжелых металлов в тканях селезенки, а также введение кадмия независимо от срока эксперимента, приводит к угнетению иммуннологической активности по причине апоптоза спленоцитов, угнетения пролиферации. Несколько увеличиваются Т-зависимые зоны лимфоидных узелков и ПАЛВ [25, 76, 88, 95].
Достаточно широко изучено влияние различных стрессов на селезенку крыс. Независимо от продолжительности воздействия стресса, а также от его природы (гомо- или гетеротипический стрессор, гипергравитация, обезвоживание и проч.) в селезенке и лимфатических узлах морфологические изменения имеют иммуносупрессивный характер, распространяясь как на Т-, так и на В-зоны. Они заключаются в подавлении пролиферации и бласттрансформации лимфоцитов, усилении апоптоза, снижении численности популяций Т- и В-клеток [6, 15, 20, 24, 31, 54, 55, 75].
В современной медицине одним из актуальных направлений является исследование механизмов развития иммуносупрессивных состояний и разработка методов их коррекции. Одной из причин возникновения иммуносупрессивного состояния является облучение ионизирующим излучением [63]. Ионизирующее излучение затрагивает один из глубоких уровней организации живого и вызывает изменения метаболических процессов во всех органах и системах. Значительную роль в интеграции ответа организма на повреждение играют кроветворная и иммунная системы. Возникшие при тотальном или локальном облучении качественные и количественные изменения в системе иммунитета приводит к формированию иммунодефицитных состояний [47, 51, 63, 136].
Наиболее чувствительными клетками иммунной системы считаются Т- и В-лимфоциты. Чувствительность лимфоцитов к ионизирующему излучению тем больше, чем больше их способность к пролиферации. Помимо апоптоза и гибели во время митоза, ионизирующее изучение может влиять на качественный и количественный состав маркеров на поверхности клеток, что напрямую сказывается на межклеточных взаимодействиях [21, 47, 140, 150, 153]. Разрушение лимфоцитов происходит как в лимфоидных органах, так и в периферической крови и лимфе. Глубина снижения уровня лимфоцитов прямо зависит от дозы облучения и индивидуальной реактивности организма [124].
Установлено, что В-клетки более радиочувствительны. Данные исследований некоторых авторов подтверждают, что для В-лимфоцитов степень радиочувствительности составляет 1,2–1,8 Гр; это соответственно проявляется в повышении относительного содержания Т-лимфоцитов во всех лимфоидных органах после общего облучения с нарушением естественного соотношения этих клеток [47, 110].
Степень радиочувствительности Т-лимфоцитов неоднозначна. Для преобладающей по количеству группы лимфоцитов D0 составляет 2–2,5 Гр; для другой, малочисленной, устойчивость составляет 6 Гр и выше. При дифференциации клеток радиочувствительность Т-лимфоцитов изменяется. Высокой резистентностью обладают внутритимусные предшественники Т-лимфоцитов. Кортикальные тимоциты представляют собой группу самых радиочувствительных клеток. Медуллярные тимоциты считаются относительно резистентными, так как их устойчивость к облучению выше, чем у периферических Т-клеток [83]. Макрофаги являются более радиорезистентными клетками. Предположительно, различия в радиорезистентности можно связать с разной степенью уязвимости клеток к гибели в интерфазе, которая зависит от защищенности, обусловленной экспрессией онкогена Bcl-2 [110]. Повышение радиочувствительности к интерфазной гибели может возникать при стимуляции Ти В-клеток антигенами и митогенами [21].
Влияние ионизирующего излучения невозможно связать лишь с гибелью Т-лимфоцитов. Важную роль играют также нарушения процесса лимфопоэза [42, 46, 74]. Восстановление популяции В-лимфоцитов происходит быстрее, чем Т-лимфоцитов. Одновременно с восстановлением функций Т- и В-лимфоцитов нормализуется способность их к кооперации. Восстановление лимфоидных органов находится в зависимости от дозы лучевого воздействия [110].
Широко изучено влияние малых доз ионизирующего излучения на селезенку крыс. Авторы указывают на распространение апоптоза лимфоцитов в различных функциональных зонах селезенки после облучения дозой 0,2 Гр [14]. Среди морфологических проявлений апоптоза указывают уменьшение линейных размеров лимфоцитов, конденсацию цитоплазматического матрикса, разрушение митохондрий. Вследствие массовой гибели иммунокомпетентных клеток различные зоны ЛУ белой пульпы селезенки на полутонких срезах выглядят существенно разреженными. [27, 134, 154]
Структурные особенности селезенки новорожденных крыс после трех и десятикратного парентерального введения ксеногенной спинномозговой жидкости
Селезенка новорожденных крыс снаружи покрыта тонкой соединительнотканной капсулой, от которой вглубь органа отходят трабекулы, содержащие сосуды. Паренхима селезенки представлена красной и белой пульпой. Красная пульпа являет собой трехмерную сеть, образованную ретикулярными клетками, в ячейках которой расположены форменные элементы крови. Вся сеть пронизана густой сетью сосудов различного диаметра. Часть из них имеет специфическое строение стенки и носит название венозных синусов. Таким образом вся красная пульпа на гистологическом срезе представлена венозными синусами с селезеночными тяжами Бильрота между ними. Стенки синусов образованы веретенообразными эндотелиальными клетками, между которыми имеются щелевидные пространства. При расширении синусов и значительном наполнении их кровью через эти промежутки форменные элементы крови проходят в селезеночные тяжи. Синусы новорожденных крыс полнокровны, в ячейках ретикулярной сети селезеночных тяжей содержатся форменные элементы крови: эритроциты, лимфоциты на разных стадиях созревания, нейтрофилы, макрофаги. Белая пульпа у новорожденных крыс только начинает формироваться. Наблюдали концентрацию лимфоцитов вокруг артерий, однако четко различить ПАЛВ и ЛУ достаточно сложно. В отдельных случаях в уже сформированных узелках можно определить мантийную (МнЗ) и маргинальную (МгЗ) зоны. Клеточные элементы и ретикулярные волокна в них расположены концентрически вокруг центральной артерии. Герминативных центров (ГЦ) узелки, как правило, не имеют (рис. 3.1.).
Селезенка новорожденных крыс на седьмые сутки эксперимента имела длину 8,5±0,67 мм, ширину 2,92±0,04 мм и толщину 1,7±0,09 мм; объем органа равнялся 42,33±4,41 мм3, а масса — 0,05±0,003 г. Масса животных составляла в среднем 20,57 г. Относительная площадь красной пульпы селезенки новорожденных крыс, получавших физраствор трехкратно, составила 76,93±1,05%, белой пульпы — 17,25±1,09%, на долю соединительнотканных элементов пришлось 6,11±0,84%. Плотность клеток в красной и белой пульпе одинаково высока и составляет порядка 380 кл/0,01 мм2 (табл. 3.1). Часто встречали фигуры митоза, эритроциты и лейкоциты на разных стадиях созревания.
Средний диаметр ПАЛВ равнялся 105,80±18,01 мкм. Среднее значение площади ЛУ у новорожденных крыс составило 34299,63±4001,17 мкм2, их диаметр 242,97±15,47 мкм (табл. 3.2.). В 36,51% случаев в узелках можно различить маргинальную и мантийную зоны. Их относительные площади равнялись 64,53±2,11% и 35,47±2,11% соответственно.
Гистологические исследования позволили выявить некоторые морфометрические особенности селезенки новорожденных крыс после введения КСМЖ. Так, после трехкратного введения ликвора масса животных уменьшилась на 24,65%. Органометрические показатели изменились следующим образом: длина увеличилась до 10,01±0,69 мм, ширина уменьшилась до 2,75±0,17 мм (на 5,71%), а толщина до 1,32±0,09 мм (на 22,55% ); при этом объем органа уменьшился до 37,94±5,81 мм3, а его масса снизилась на 80%.
Соотношение площадей белой и красной пульпы на срезе несколько изменились: доля красной пульпы уменьшилась на 20,08% (до 61,48±5,42%); доля белой пульпы, наоборот, возросла на 90,09% (до 32,79±6,44%); соединительнотканных элементов стало несколько меньше — 5,71±1,40%. В целом наблюдали более четкое разделение паренхимы органа на белую и красную пульпу. Плотность клеток в белой пульпе достоверно выросла на 29,40%, вероятно, за счет миграции лейкоцитов в периартериальные зоны паренхимы селезенки, тогда как в красной пульпе клеток (особенно лейкоцитов) стало меньше на 19,45% . Стало возможным отличить лимфоидные узелки от периартериальных влагалищ (рис. 3.2.), при этом в 47,06% случаев можно было выделить мантийную и маргинальную зоны узелка.
Средний диаметр ПАЛВ возрос на 31,19%. Среднее значение площади лимфоидных узелков увеличилось на 190,83% , диаметр узелков возрос на 75,16% . Изменилось соотношение относительных площадей зон узелка: относительная площадь маргинальной зоны уменьшилась на 13,39%, мантийной зоны — возросла на 24,36%.
На тридцатые сутки эксперимента структура селезенки несколько изменилась. Линейные размеры селезенки контрольных крыс составили: длина 19,50±0,67 мм, ширина 5,00±0,15 мм, толщина 2,90±1,010 мм. Масса органа в среднем равнялась 0,10 г, объем — 262,50±12,70 мм3. Масса животных при этом составила 32,00 г. На поперечном срезе органа относительные площади белой и красной пульпы распределились следующим образом: относительная площадь красной пульпы составила 65,19±2,86%, белой пульпы — 30,67±2,92% (рис. 3.3.).
Соединительнотканные элементы занимали 4,15±0,54% от площади среза. Плотность клеток в различных зонах пульпы селезенки оставалась высокой. В лимфоидных узелках насчитывалось до 425 кл/0,01 мм2, в селезеночных тяжах красной пульпы количество лейкоцитов и эритроцитов практически сравнялось и составляло в общей сложности порядка 318 кл/0,01 мм2.
Средняя площадь ЛУ равнялась 61434,17±5564,59 мкм2, а их диаметр — 313,80±14,86 мкм (табл. 3.3.). В 81,97% случаев в узелках можно было различить зоны ЛУ, а в 10% случаев узелки имели центры размножения. В узелках с герминативными центрами средняя площадь узелка была больше — 122801,80±26694,23 мкм2, их диаметр — 467,50±57,14 мкм. Относительные площади зон несколько изменились, в первую очередь за счет уменьшения маргинальной зоны.
После десятикратного введения КСМЖ новорожденным крысам их масса увеличилась на 18,75%, однако все органометрические показатели несколько уменьшились. Масса селезенки составила менее 0,05 г. Ширина и толщина органа уменьшились на 25,00% и 31,03% соответственно. Изменения длины незначительны. Объем селезенки также уменьшился на 44,19% до 146,50±10,58 мм3.
На поперечном срезе селезенки относительные площади белой и красной пульпы незначительно изменились и составили: для красной пульпы — 57,11±2,57% (меньше по сравнению с контрольной группой на 12,39%), для белой пульпы — 38,26±2,65% (больше контроля на 24,75%) и для соединительнотканных компонентов стромы — 4,63±0,60% (больше контрольных значений на 11,57%). Достоверно увеличилось количество лимфоцитов в лимфоидных узелках (на 9,21%) и в красной пульпе (на 58,02%), что можно объяснить миграцией незрелых форм лимфоцитов из крови в периферические органы иммунной системы для дальнейшей дифференцировки (табл. 3.1). Средний диаметр ПАЛВ достоверно вырос на 47,92% с 118,78±7,16 мкм до 167,97±8,38 мкм. Средняя площадь ЛУ увеличилась на 84,65% относительно контрольной группы, соответственно увеличился и диаметр ЛУ на 38,65% . В 87,04 % случаев можно различить зоны узелка (рис. 3.4.).
При этом 22,22% узелков содержали герминативные центры. Их размеры превышали размеры первичных узелков. Средняя площадь таких узелков превысила контроль на 50,39%, диаметр — на 17,47% (табл. 3.4.). Относительные площади зон ЛУ изменились после многократного введения ликвора таким образом: мантийная зона увеличилась на 12,33%, маргинальная зона — на 5,09%, периартериальная зона (ПаЗ) и герминативный центр уменьшились на 15,48% и 45,33% соответственно.
Таким образом, введение ксеногенного ликвора новорожденным крысам способствует наступлению функциональной зрелости органа в более ранние сроки. Ее относительная площадь увеличилась на 60%. К тридцатому дню жизни большинство узелков белой пульпы селезенки уже имеют обособленные зоны. Появляются вторичные лимфоидные узелки, содержащие центры размножения лимфоцитов. Многократное введение КСМЖ новорожденным крысам вызвало увеличение относительной площади белой пульпы на 18%, при этом средняя площадь ЛУ возросла на 44,89% относительно контрольной группы.
Структурные особенности селезенки половозрелых крыс после трех- и десятикратного введения ксеногенной спинномозговой жидкости
Селезенка крыс молодого возраста гладкая, темно-красного цвета, вытянута в длину, имела в поперечнике трехгранную форму. Линейные размеры селезенки составили: длина — 37,41±0,58 мм, ширина — 6,66±0,21мм и толщина — 2,88±0,14 мм. Масса органа равнялась 0,57±0,02 г, а его объем — 714,54±23,02. Масса животных контрольной группы достигал 113,67±1,74 г.
На поперечном срезе селезенки соединительнотканные элементы капсулы, трабекул и сосудов занимали 1,36±0,35%, доля красной пульпы составила — 59,47±2,97%, а белой — 39,14±2,66% (рис. 3.10.).
Капсула ровная, плотная. Красная пульпа имеет нормальное кровенаполнение. Плотность клеток в ней порядка 313 клеток на 0,01 мм2 с равным количеством эритроцитов и лейкоцитов (табл. 3.8). Белая пульпа представлена ПАЛВ, диаметр которых достигал в среднем 142,83±16,72 мкм, и крупными ЛУ, которые часто сливаются. Плотность клеток в них составила 417 кл/0,01 мм2. Маргинальная зона ЛУ неширокая. Большинство ЛУ содержит ГЦ (рис. 3.11.).
После трехкратного введения ликвора органометрические показатели селезенки практически не изменились, хотя животные прибавили в весе 25,95 %. Доля соединительнотканных элементов несколько увеличилась до 2,06±0,16%, красная пульпа составила 61,31±2,16%, доля белой пульпы незначительно уменьшилась до 36,75±2,16% (рис. 3.12.).
Капсула органа плотная, ровная. Трабекулы не претерпели значимых изменений. Красная пульпа селезенки имеет нормальное кровенаполнение (348 кл/0,01 мм2 с преобладанием эритроцитов, количество которых увеличилось на 51,27%). При сравнении с контрольной группой выявили увеличение количества первичных ЛУ (рис. 3.13.). При этом ЛУ, содержащие ГЦ, достоверно превосходят в размерах таковые в контрольной группе на 37%. Их диаметр также увеличился на 28%. Это произошло в первую очередь за счет увеличения маргинальной зоны ЛУ. Так, ее относительная площадь в контрольной группе составила 45,05% от общей площади ЛУ, тогда как в экспериментальной группе это значение увеличилось до 51,52% (табл. 3.9.).
Анализ диаметра ПАЛВ у половозрелых крыс, трижды получавших ликвор, не выявил достоверных отличий от контрольной группы.
На субклеточном уровне трехкратное введение ликвора не привело к патологическим изменениям спленоцитов. Встречали лимфоциты на разных стадиях созревания, макрофаги с признаками умеренной фагоцитарной активности (выросты цитолеммы и наличие в цитоплазме фагосом с электронно-плотным содержимым). Присутствуют плазматические клетки с хорошо видными цистернами ЭПС и просветлением цитоплазмы в близости ядра (рис. 3.14.).
Органометрические показатели селезенки крыс после десятикратного введения физраствора не имеют существенных достоверных отличий от таковых в начале эксперимента. Продолжительность эксперимента не вызвала также и значительных гистологических изменений в пульпе селезенки контрольных крыс. Доля первичных ЛУ составила 30%. При этом они значительно меньше по размеру в сравнении со вторичными ЛУ, содержат слабо выраженные зоны.
Десятикратное введение ликвора отразилось на органометрических показателях селезенки. Масса крыс достоверно увеличилась на 5,41%. Масса селезенки у крыс экспериментальной группы составила в среднем 0,65±0,02 г, что на 44,44% больше контрольного значения (0,45±0,03 г). Линейные размеры органа увеличились: длина на 35,71%, ширина на 7,69%, толщина осталась неизменной. Объем органа увеличился на 22,02% .
Изменилась и морфологическая картина селезенки. Десятикратное введение ликвора привело к увеличению доли белой пульпы на поперечных срезах селезенки на 30,58% и уменьшению доли красной пульпы на 18,70% , при этом доля соединительнотканных элементов изменилась незначительно (рис. 3.15.).
Плотность клеток в красной пульпе снизилась до 269 кл/0,01 мм2, снизился и эритроцитарно-лейкоцитарный индекс. В белой пульпе плотность клеток не изменилась. Остался прежним и диаметр ПАЛВ.
Первичные узелки по прежнему составили треть от общего количества, однако размеры вторичных ЛУ и их зон значительно увеличились, особенно сильно это выражено в маргинальной зоне (рис. 3.16, табл. 3.10.).
Так, площадь ЛУ увеличилась на 92% относительно контрольной группы, а их диаметр — на 32%. Площадь маргинальной зоны превысила контрольные значения на 128%, так же увеличилась и ее относительная площадь. При этом относительные площади остальных зон ЛУ достоверно уменьшились. Диаметр ПАЛВ после введения ликвора трех и десятикратно незначительно уменьшался, однако эти изменения не имели статистической достоверности.
На ультраструктурном уровне в белой пульпе селезенки наблюдали большое количество малых лимфоцитов, узкий ободок цитоплазмы которых содержит некоторое количество гранул и митохондрий (рис. 3.17.). Значительная часть гетерохроматина сконцентрирована по периферии ядра, мембрана которого имеет небольшие выступы и инвагинации.
Из полученных данных ясно видно, что введение реципиенту ксеногенной жидкости положительно влияет на функциональную активность селезенки. Это выражается в увеличении доли белой пульпы селезенки за счет увеличения площадей ЛУ, увеличения количества вторичных узелков с центрами размножения лимфоцитов.
Структурные особенности селезенки крыс зрелого возраста после облучения и его коррекции спинномозговой жидкостью
Однократное облучение крыс в дозе 5 Гр приводит к изменениям на различных уровнях организации. Так, масса облученных животных, получавших физраствор, составила 173,33±3,56 г. Это несколько больше, чем у необлученных животных такого же возраста. Вероятнее всего в данном случае имеют место индивидуальные различия, т.к. крысы были из разных пометов. Масса селезенки равнялась 0,56 г. Линейные размеры представляли: длина — 34,83±0,48 мм, ширина — 6,17±0,31 мм, толщина — 2,73±0,08 мм. Объем органа составил 591,60±49,58 мм3. Эти значения не имеют достоверных отличий от контроля.
После однократного тотального облучения крыс в дозе 5 Гр морфологическая картина селезенки значительно изменилась (в качестве контрольной группы выступили крысы зрелого возраста, получавшие физраствор). Красная пульпа малокровна и составила 79,27±5,05% от площади среза. Плотность клеток в ней составила всего 253 кл/0,01 мм2. Из них лейкоциты составили лишь 34% (табл. 3.14.).
На элементы соединительной ткани пришлось 3,81±0,94%, за счет отека трабекул и стенок сосудов. Белая пульпа занимала лишь 16,92±4,50%. ПАЛВ узкие (85,24±7,24 мкм) и бедны на лимфоциты. ЛУ мало, они небольшие по размеру (рис. 3.23.). Их площадь достоверно меньше контрольных значений на 46,64%, а диаметр на 55,17% (табл. 3.15).
Слабо выражен краевой синус. Маргинальная зона опустошена. Периартериальная зона также зачастую отличается малой плотностью клеток (262 кл/мм2). Подавляющее большинство ЛУ не содержит ГЦ. Все это может свидетельствовать о подавлении как гуморальной, так и клеточной ветвей иммунитета.
Через 30 суток после облучения масса животных достоверно снизилась до 162,50±1,61 г, при этом все органометрические показатели селезенки увеличилсь. Так, масса органа выросла на 8,57%, длина увеличилась до 36,00±0,58 мм, ширина — до 7,75±0,17 мм, толщина — до 4,18±0,07 мм, объем селезенки — до 1170,03±51,91 мм3.
Соотношение красной и белой пульпы значительно изменилось. Красная пульпа составила 57,82±7,81% от площади среза, доля белой пульпы выросла до 40,04±7,86%. Красная пульпа имеет нормальное кровенаполнение. Белая пульпа заполнена лейкоцитами и представлена ПАЛВ и ЛУ, однако диаметр ПАЛВ по-прежнему мал. Количество ЛУ возросло до уровня контроля. Они крупные, иногда сливаются друг с другом (рис. 3.24.). Периартериальная зона хорошо различима и имеет высокую плотность клеток. Маргинальная зона широкая и составила в среднем 47,23±2,36% от площади ЛУ. Многие узелки имеют ГЦ, при этом их размеры мало отличаются от первичных ЛУ. Площадь их возросла на 187,40%, а диаметр на 164,55%. Морфометрические показатели ЛУ не имеют достоверных отличий от контрольной группы. Можно заключить, что морфофункциональное состояние пульпы селезенки в значительной степени восстановилось в течение 30 суток после облучения в дозе 5 Гр.
Облученные крысы, получавшие в качестве корригирующего вещества ксеногенный ликвор, достоверно превосходили по массе крыс, получавших физраствор на 6,73%. Масса органа также увеличилась на 13,04%. Линейные размеры органа составили: длина — 36,83±0,70мм, ширина — 7,58±0,34 мм, толщина — 3,65±0,22 мм, что достоверно больше чем у крыс, получавших после облучения физраствор. Объем органа равнялся в среднем 1040,79±126,56 мм3.
После трехкратного введения ликвора облученным крысам доля красной пульпы несколько уменьшилась (до 75,44±6,57%) за счет увеличения белой (до 19,98±4,86%). Красная пульпа имеет нормальное кровенаполнение, в ней достоверно увеличилось количество как эритроцитов, так и лейкоцитов (табл. 3.14). В белой пульпе плотность клеток также нормализовалась и достигла 400 кл/мм2. Наблюдали обильное ветвление артериол в ЛУ и в красной пульпе селезенки. Диаметр ПАЛВ значительно ниже контрольных значений, однако на 3,53% выше, чем у крыс, не получавших ликвор после облучения. Размеры ЛУ возросли (табл. 3.16).
Их площадь превышала таковую у облученных крыс, не получавших ликвор, на 73,90 %, а диаметр — на 112, 10 %. В ЛУ все еще трудно определяется маргинальная зона и маргинальный синус, однако хорошо видны периартериальная зона и ГЦ, имеющиеся в большинстве ЛУ (рис. 3.25.).
Площадь ГЦ составила 11085,1± 870,83 мкм2, а диаметр — 149,0± 6,97 мкм, что в два раза превышает таковые в контрольной группе. Остальные морфометрические параметры белой пульпы селезенки приближались к контрольным значениям. При этом на ультраструктурном уровне паренхима селезенки носила явные признаки деструкции и отека (рис. 3.26.). Встречали большое количество активных макрофагов, поглощающих клеточный детрит. Многие клетки (лимфобласты, плазмоциты) с разрушенной клеточной мембраной. Часто наблюдали нейтрофильные гранулоциты и эозинофилы, а лимфоциты единичны.
После десятикратного введения ликвора облученным крысам на 30-е сутки эксперимента масса животных равнялась 173,00±2,92 г. Масса селезенки составила 1,117±0,12 г, что на 83,11% больше чем у облученных крыс, получавших физраствор, и на 114,81% больше контрольных значений. Линейные размеры достигли: длина — 41,50±1,67, ширина — 8,58±0,20 и толщина — 6,87±0,31. Объем органа равнялся 2471,60±232,96 мм3.
Соотношение площадей красной и белой пульпы сравнялись с таковыми у облученных крыс, не получавших ликвор (рис. 3.27.). Плотность клеток в красной и белой пульпе приблизилось к контрольным значениям. Диаметр ПАЛВ несколько возрос и составил 108,00±6,08 мкм. Количество ЛУ увеличилось, две трети из них содержали герминативные центры. Четко различимы все зоны узелка, включая маргинальную. Абсолютные размеры площади и диаметра ЛУ, а также их зон, были близки к контрольной группе и не имели статистически достоверных отличий от них.
На субклеточном уровне признаков деструкции клеток обнаружено не было. Пульпа селезенки полнокровна, в капиллярах большое количество эритроцитов, встречали тромбоциты. Ретикулярные клетки со светлым ядром и светлой цитоплазмой, содержащей большое количество гранул, митохондрий (рис. 3.28.). Присутствуют лимфоциты различной степени зрелости (средние, малые). По небольшому количеству выростов цитолеммы и фагосом можно предположить умеренную активность макрофагов.
Таким образом, облучение крыс в дозе 5 Гр приводит к опустошению белой пульпы селезенки, что проявляется в исчезновении ЛУ, обеднении популяции лейкоцитов. При этом данный процесс обратим и к 30-м суткам эксперимента структура селезенки в достаточной мере восстанавливается. Введение ликвора крысам в состоянии острой иммуносупрессии приводит к более раннему восстановлению морфофункциональных показателей селезенки.