Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современное состояние патологической анатомии аденокарциномы толстой кишки (обзор литературы) 15
1.1. Эпидемиология рака толстой кишки 17
1.2. Этиология рака толстой кишки 18
1.3. Канцерогенез аденокарциномы толстой кишки .19
1.3.1. Морфогенез аденокарциномы толстой кишки (экспериментальные данные) .19
1.3.2. Морфогенез аденокарциномы толстой кишки (клинико-морфологические данные) .45
1.3.3. Патогенез рака толстой кишки – дуализм экспериментального и клинико-морфологического подхода 56
1.4. Роль хемокинов и их рецепторов в метастазировании аденокарциномы толстой кишки в рамках стволовоклеточной концепции канцерогенеза 62
1.5. Поиск иммуногистохимических маркеров оценки предполагаемой эффективности химиотерапии аденокарциномы толстой кишки .66
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 77
2.1 Общая характеристика материала 77
2.2 Метод верификации прогрессирования асцитной формы аденокарциномы толстой кишки 84
2.3 Метод иммуногистохимического исследования экспрессии рецепторов к хемокинам (CXCR4, CCR10), маркера стволовых клеток (ALDH1), пролиферативной активности (Ki-67) в аденокарциноме толстой кишки 86
2.4 Иммунногистохимический метод исследования и ПЦР в изучении микросателлитной нестабильности и репарационной системы неспаренных нуклеотидов ДНК 93
2.5 Метод иммуногистохимического исследования маркеров и их сочетания в оценке предполагаемой эффективности стандартной химиотерапии (FOLFOX, FOLFIRI, ДЕ ГРАМОНТ) аденокарциномы толстой кишки .96
2.6 Статистические методы исследования .99
ГЛАВА 3. Морфологическая оценка прогностических факторов у больных аденокарциномой толстой кишки .101
3.1. Иммуногистохимическое исследование рецепторов к хемокинам (CXCR4, CCR10), маркера стволовых клеток (ALDH1), пролиферативной активности (Ki-67) в аденокарциноме толстой кишки 101
3.2. Исследование прогностического значения экспрессии рецептора к хемокину CXCR4, альдегиддегидрогеназы (ALDH1), Ki-67 и их сочетания с точки зрения распространенности аденокарциномы толстой кишки, показателей выживаемости .119
3.3. Сравнительное исследование микросателлитной нестабильности и репарационной системы неспаренных нуклеотидов ДНК методами ПЦР и иммуногистохимии .132
ГЛАВА 4. Морфологическая оценка предиктивных факторов у больных аденокарциномой толстой кишки 141
4.1. Иммуногистохимическое исследование Ki-67, топоизомеразы-II-альфа, III-класса-бета-тубулина, TS, TP, DYPD, PTEN, ERCC1 в зависимости от гистологической дифференцировки и стадии аденокарциномы толстой кишки 4.2. Изучение предиктивной значимости маркеров и их сочетания в оценке предполагаемой эффективности стандартной химиотерапии (FOLFOX, FOLFIRI, де Грамонт) аденокарциномы толстой кишки 163
ГЛАВА 5. Обсуждение полученных результатов 171
5.1. Соотношение клеточных популяций в аденокарциноме толстой кишки .171
5.2. Рецепторы к хемокинам и Ki-67 – факторы прогноза при аденокарциноме толстой кишки .175
5.3. Иммуногистохимия в определении микросателлитной нестабильности и мутаций генов репарации неспаренных нуклеотидов ДНК 182
5.4. Иммуногистохимическое исследование предиктивных маркеров при аденокарциноме толстой кишки 184
5.5. Алгоритм использования морфологических прогностических и предиктивных факторов при аденокарциноме толстой кишки .186
Заключение 189
Выводы 192
Практические рекомендации .194
Список литературы...
- Канцерогенез аденокарциномы толстой кишки
- Иммунногистохимический метод исследования и ПЦР в изучении микросателлитной нестабильности и репарационной системы неспаренных нуклеотидов ДНК
- Исследование прогностического значения экспрессии рецептора к хемокину CXCR4, альдегиддегидрогеназы (ALDH1), Ki-67 и их сочетания с точки зрения распространенности аденокарциномы толстой кишки, показателей выживаемости
- Рецепторы к хемокинам и Ki-67 – факторы прогноза при аденокарциноме толстой кишки
Канцерогенез аденокарциномы толстой кишки
Рак толстой кишки одна из наиболее распространенных форм злокачественных опухолей, занимающая лидирующие позиции по летальности от рака в мире [1, 151].
В настоящее время выделяют как минимум четыре основных пути канцерогенеза аденокарциномы толстой кишки: 1) Трансформация аденомы в карциному; 2) HNPCC (наследственный неполипозный рак толстой кишки); 3) Развитие рака de novo ; 4) Трансформация хронического колита. Во всех из них, кроме синдрома Линча, все больше внимания относят к стволовым ткань-коммитированным клеткам, как мишеням мутаций и источнику злокачественных опухолей. Впоследствии возникающие из них стволовые раковые клетки рассматривают как причину химиорезистентности опухолей, развития рецидивов и метастазов. Таким образом, изучение данной популяции клеток может кардинально изменить подходы к лечению пациентов с аденокарциномой толстой кишки.
Конечный результат лечения больных онкологического профиля до сих пор остается неудовлетворительным. Несмотря на прогресс в хирургической технике и системной химиотерапии, отмечается высокая смертность, обусловленная ранним метастазированием, которое часто имеет место уже при первичном диагнозе, но не обнаруживается традиционными методами.
В рекомендациях ESMO 2009 факторами высокого риска метастазирования рака толстой кишки названы следующие показатели: Gr 3-4, инвазия лимфатических и кровеносных сосудов, периневральная инвазия в условиях кишечной непроходимости, исследование менее 12 лимфатических узлов, T4, T3 c локальной перфорацией, опухолевые клетки в краях резекции, инвазия в соседние органы, высокий уровень РЭА, низкодифференцированная аденокарцинома. И всё же вопрос остается открытым: почему у некоторых пациентов со стадией рТ1N0M0 наступает прогрессирование опухолевого процесса в первые полгода с момента хирургического лечения и пациент стремительно погибает от метастатической болезни и интоксикации, а некоторые пациенты, имевшие стадию рT4N2M0 живут более 10 лет и погибают совсем от других заболеваний?
Таким образом, можно предположить, что процесс метастазирования это не хаотичный процесс, а в нем участвуют определенные факторы. В настоящее время такие потенциальные факторы находятся в стадии изучения: р53, k-ras, bcl-2, TGF-альфа, EGF, пролиферативный индекс, анеуплоидность, хемокины.
Несмотря на то, что адекватное оперативное вмешательство – это главное лечение, адъювантная химиотерапия с 1990 года считается стандартной у пациентов метастазами в лимфатические узлы [60, 113 266]. Поиск молекулярных маркеров с прогностическим или предиктивным эффектом важен для подбора соответствующего лечения пациентам для исключения ненужных препаратов с токсичными побочными эффектами. В настоящее время доказана эффективность определения эстрогеновых и прогестероновых рецепторов, HER2/neu в раке молочной железы с целью назначения адекватного лечения, определения прогноза развития опухоли. Однако это практически единственное применение иммуногистохимии в данном разделе. Хотя большое количество научных исследований (начиная с 1968 года [82]) ведется в данном направлении (в первую очередь касательно определения пролиферации при помощи Ki-67, экспрессии ERCC-1, PTEN, III-класса-бета-тубулина и других молекул [98, 146, 181, 354, 405]), ни один из маркеров не признан в настоящее время достоверным в определении прогноза развития заболевания или предиктивного значения перед назначением лекарственной терапии при аденокарциноме толстой кишки. Поиск данных параметров является важной задачей современной онкоморфологии. 1.1. Эпидемиология рака толстой кишки
Рак толстой кишки одна из наиболее распространенных форм злокачественных опухолей, занимающая лидирующие позиции по летальности от рака в мире. По данным Всемирной организации здравоохранения [133] рак толстой кишки в мире занимает третье место по заболеваемости у мужчин (663 000 случаев в 2012 г., 10.0% от всех случаев злокачественных новообразований) и второе у женщин (571 000 случаев, 9.4% от общего числа). 60% случаев рака толстой кишки приходится на развитые страны. В 2012 г. зарегистрировано около 693000 летальных исходов от рака толстой кишки, что составляет 8% от общей онкологической смертности. Таким образом, рак толстой кишки занимает четвертое место по смертности среди новообразований. В России рак толстой кишки занимает второе место по заболеваемости (24671 случай в 2008 г.) после рака легкого у мужчин и второе место (31048 случаев в 2008 г.) после рака молочной железы у женщин. По смертности у мужчин занимает третье место после раков легкого и желудка и второе место после рака молочной железы у женщин [6, 133]. Заболеваемость раком толстой кишки возросла во многих странах, где до этого она была низкой, но снизилась (в Северной Америке), стабилизировалась (северная и восточная Европа) или увеличилась незначительно, где до настоящего времени она была высокой. Заболеваемость раком толстой кишки среди иммигрантов и их потомков быстро доходит до уровня страны, куда люди переехали, что доказывает значение образа жизни, диеты и других факторов окружающей среды в развитии данной нозологии [75]. Риск возникновения рака увеличивается с возрастом [233] и редко встречается до 40 лет за исключением людей с генетической предрасположенностью или предрасполагающими состояниями, такие как хронические воспалительные заболевания толстой кишки или проживание в странах с высокой заболеваемостью [211, 393]. Частота рака прямой кишки у мужчин примерно на 50% выше, чем у женщин, а ободочной на 20%. Соотношение случаев рака прямой кишки к ободочной выше в популяциях с высокой заболеваемостью [71]. Смертность от рака в мире составляет примерно половину от заболеваемости, однако имеется ее значительная вариабельность в зависимости от возможностей лечения, с наиболее низкой в странах с высокой заболеваемостью, но высоким уровнем жизни [75, 133].
Иммунногистохимический метод исследования и ПЦР в изучении микросателлитной нестабильности и репарационной системы неспаренных нуклеотидов ДНК
Изучение морфогенеза опухолей важно как в теоретическом, так и в практическом отношении. Знание морфогенеза опухолевых заболеваний имеет большое значение для понимания их патогенеза [20]. «Важное значение точного знания морфогенеза для понимания патогенеза в сущности непосредственно вытекает из самого понятия о патогенезе…Толкование патогенеза заболеваний без точного знания их морфогенеза является, по меньшей мере, беспредметным и может давать повод к очень грубым ошибкам», - Н.Н. Аничков [26]. С другой стороны, только на основании тщательных и систематических морфогенетических исследований можно выявить предопухолевые и предраковые изменения. Другими словами, о предраке можно с достаточным основанием говорить лишь в тех случаях, когда прослежена вся цепь последовательных изменений от нормальных тканевых структур до развития злокачественной опухоли.
Естественно, что изучение морфодинамики развития опухолей на материале патологии человека очень затруднено, если вообще возможно в полном ее объеме. До 70-х годов не удавалось с достаточной частотой и постоянством воспроизводить у лабораторных животных опухоли некоторых локализаций. Это, в первую очередь, касалось новообразований различных отделов желудочно-кишечного тракта и, в особенности, тонкого и толстого кишечника [18]. Многочисленные попытки индуцировать опухоли тонкой и, особенно, толстой кишок, оставались безуспешными. Так, например, Л.М. Шабад [27] пытался воспроизводить рак прямой кишки у мышей путем введения в нее дегтя, однако опухоли при этом не развивались. В некоторых опытах опухоли толстой кишки, наряду с опухолями других локализаций, изредка вызывали бензидин и его производные [397, 444]. Таким образом, несмотря на наличие довольно большого количества работ, в которых описывалась индукция опухолей кишечника у мелких лабораторных животных, не существовало надежного метода воспроизведения опухолей тонкой и толстой кишок. Положение в значительной мере изменилось после того, как Druckrey и соавт. [123] установили, что парентеральное (подкожное) и пероральное введение 1,2-диметилгидразина (ДМГ) крысам приводит к развитию опухолей в различных отделах кишечника с большой частотой. Это наблюдение было подтверждено в опытах с крысами, хомяками и мышами, у которых с помощью симметричного ДМГ опухоли кишечника воспроизвели Schauer и соавт. [366], Wiebecke и соавт. [453], Osswald и Kruger [296]. ДМГ активируется в печени серией реакцией через образование промежуточных продуктов азометана, азоксиметана, метилазоксиметанола. В конечном итоге образуется ион метилдиазония, который экскретируется в желчь, поступающую в тонкую, а затем в толстую кишку [134] или может поступать прямо в клетки толстой кишки через кровеносное русло [352]. Некоторые исследования показали, что эпителиальные клетки толстой кишки крысы могут метаболизировать ДМГ в карциногенное вещество без предварительной трансформации в печени [293]. Однако ДМГ обладает рядом недостатков, в том числе невысокой стабильностью в растворе. В дальнейшем был использован метаболит ДМГ – азоксиметан, который обладал более высоким потенцирующим действием [281]. С момента открытия его действия было опубликовано несколько тысяч работ, посвященные экспериментальному карциногенезу с использованием азоксиметана [67, 281, 299].
R.F. Jacoby и соавт. [183] показали, что ДМГ вызывает активирующую мутацию k-Ras (G на A) в 66% случаев экспериментальных аденокарцином толстой кишки. Аналогичные мутации были выявлены в предраковых состояниях слизистой оболочки у 20% крыс через 15 недель после введения ДМГ. Интересно, что в этой группе только 2,5% аденом имели мутацию k-Ras в сравнении с 33% в аденокарциномах толстой кишки, которые возникали у этих крыс [182, 455]. Отличием колоректальных аденокарцином, полученных экспериментальным путем, от человеческих является отсутствие мутации гена р53, наиболее частого генетического события в аденокарциноме толстой кишки человека [257, 278, 384, 429].
К.М. Пожарисский в работах 70-х годов [18] показал, что ДМГ, независимо от путей введения в организм, приводит к возникновению множественных опухолей толстой кишки с преимущественной локализацией в нисходящем ее отделе практически у всех крыс, проживших не менее полугода после начала воздействия. Опухоли 12-перстной и проксимальных отделов тонкой кишки обнаруживались приблизительно у половины всех крыс этого возраста. Значительно реже наблюдались опухоли слепой кишки (23%). У самцов опухоли локализовались в прямой кишке в 26% случаев, в то время как у самок наблюдалось значительно более частое (75%) поражения этого отдела кишки [18] (интересно, но в эпидемиологических исследованиях у людей выявляется обратное соотношение: от 1,5 до 2,5 к 1 по разным источникам у мужчин ректальный рак встречается чаще, чем у женщин [184, 431, 460]).
Слизистая оболочка тонкой кишки крыс, как и других млекопитающих, имеет многочисленные ворсинки. Более высокие ворсинки располагаются в 12-перстной и проксимальном отделе тонкой кишки. В подвздошной кишке ворсинки низкие, имеют форму цилиндров, а иногда – широких пластинок. Слизистая оболочка слепой и толстой кишок ворсинок не образуют. Эпителиальная выстилка кишечника крысы, как и других животных, состоит в основном из клеток двух типов: каемчатых и бокаловидных. Кроме этих клеток, в тонкой кишке имеются еще панетовские клетки и клетки Кульчицкого; единичные аргентаффинные клетки обнаруживаются и в криптах толстой кишки. Перечисленные разновидности клеток имеют следующее расположение в тонкой кишке крысы. На самом дне крипты лежат панетовские клетки, количество которых нарастает в дистальном направлении, и в подвздошной кишке они образуют довольно большие скопления. Основную массу клеток, выстилающие крипты, составляют каемчатые клетки с базофильной цитоплазмой.
Эпителиальные клетки, располагающиеся в ближайшей к дну половине крипты, лишены типичной для кишечного эпителия щеточной каймы, и среди них видны многочисленные митозы. Между каемчатыми клетками разбросаны бокаловидные клетки на разных стадиях накопления слизи. Если в тонком кишечнике относительно мало бокаловидных клеток, то в криптах толстой кишки они доминируют. Зоной пролиферации в толстой кишке служит нижняя половина крипты. Таким образом, микроскопическое строение как тонкой, так и толстой кишок контрольных крыс не имеет каких-либо принципиальных особенностей по сравнению с таковым других лабораторных животных и человека [21].
У всех крыс опухоли кишечника были множественными и макроскопически имели разнообразную форму. На основании этого признака и характера роста опухолей были выделены следующие анатомические разновидности. К экзофитно растущим новообразованиям были отнесены полипы, которые имели узкую длинную ножку (рисунок 1.1) или располагались на широком основании. В ряде случаев поверхность полипа была покрыта ворсинчато-сосочковыми разрастаниями и опухоль приобретала вид цветной капусты. Грибовидные раки имели довольно широкое основание и уплощенную поверхность, опухолевые массы нависали над окружающей слизистой оболочкой. Противоположную группу составляли опухоли, характеризовавшиеся преимущественно эндофитным типом роста. К ним относились язвенно-инфильтративные раки, которые имели вид плоского опухолевого инфильтрата с изъязвленной поверхностью. В единичных случаях наблюдались эндофитные опухоли с диффузной инфильтрацией, приводящие к резкому утолщению и уплотнению стенки кишки и полному исчезновению складчатости слизистой оболочки [21].
Исследование прогностического значения экспрессии рецептора к хемокину CXCR4, альдегиддегидрогеназы (ALDH1), Ki-67 и их сочетания с точки зрения распространенности аденокарциномы толстой кишки, показателей выживаемости
Однако в ней не выявляются значительные изменения в эпителиальных клетках. Возможно наличие увеличенных и удлиненных ядер, однако отсутствует стратификация, беспорядочное скопление клеток, имеется нормальное количество бокаловидных клеток. В этом подтипе ACF клетки, позитивные на Ki-67 и PCNA, локализованы в нижнем отделе крипты, как и в нормальной ткани. В гиперпластическом типе ACF пролиферирующие клетки уже появляются в верхних слоях крипты, наблюдается уменьшение количества бокаловидных клеток и снижение содержания слизи в них, однако отсутствуют признаки дисплазии [37, 305]. В диспластическом ACF идет значительное уменьшение числа бокаловидных клеток и содержания муцина в них. Эпителиальные клетки увеличены в размере, имеют деполяризованное ядро, стратифицированы. Позитивная реакция на Ki-67 и PCNA наблюдается в верхней части крипт. Спорадический ACF имеет схожее строение с таковым при семейном аденоматозном полипозе, однако в отличие от последнего редко имеет мутацию APC, а в основном наблюдается его гиперметилирование [89, 282, 410].
Через 1,5 – 2 месяца в нескольких случаях на фоне еще более расширенной зоны пролиферации энтероцитов в поверхностных участках слизистой оболочки, преимущественно на вершине ее складок возникали атипические железки, занимающие верхнюю часть одной или нескольких крипт и характеризующиеся базофилией эпителия, гиперхроматозом ядер и увеличением их размеров, отсутствием признаков секреции слизи, наличием большого количества митозов (многие из которых патологические) и образованием многорядных структур с потерей полярности. На гистоавтографах видно, что в этих очагах большинство эпителиальных клеток оказываются мечеными (рисунок 1.4, [21]). Рисунок 1.2 – Расширение зоны пролиферации в слизистой оболочке толстой кишки крысы: а - обзорный снимок, Х 200; б – видны митозы в устье крипт, Х 1000 (микрофотография гистологического препарата докторской диссертации проф. Пожарисского К.М. [21]).
Меченые клетки практически во всех клетках атипичных железах слизистой оболочки толстой кишки крысы, в сравнении с нормальными железами, где меченые клетки выявляются только в донных отделах: а – обзорный снимок, Х200, б – зона измененной слизистой оболочки, Х400 (микрофотография гистологического препарата докторской диссертации проф. Пожарисского К.М. [21]). Проведенные в этих случаях изучения серийных срезов показали, что такие изменения локализуются в поверхностных участках крипт и не связаны с ее нижними отделами. Совокупность морфологических признаков этих поражений дает основание классифицировать их как карциномы In situ (рисунок 1.5). Важно подчеркнуть, что возникновению карциномы In situ не предшествовали гиперпластические изменения слизистой оболочки. Учитывая возможность гиперплазии, развивающейся в процессе канцерогенеза, К.М. Пожарисский и соавторы производили подсчет числа клеток по длиннику крипты на продольных ее срезах. Оказалось, что крипты как в норме, так и на всех стадиях канцерогенеза (вне мест локализации опухоли) состоят приблизительно из 50 клеточных позиций. В эти же сроки в единичных случаях отмечалось изменение контуров железистых структур, составляющих карциному in situ, образовывались сосочковые выросты, направленные как в просвет опухолевых железок, так и в сторону поверхности слизистой оболочки. В области таких очагов возникали инфильтраты, состоящие преимущественно из лимфоцитов и гистиоцитов; наблюдалась также десмопластическая реакция. В отдельных опухолевых железках имелись мелкие очажки некрозов, а их просвет был заполнен клеточным детритом. Все указанные морфологические изменения расценивались как признаки инвазии в пределах слизистой оболочки, что соответствует понятию поверхностного рака (рисунок 1.6). Такой тип злокачественных поражений при индукции опухолей кишечника у крыс при помощи ДМГ наблюдали E.A. Schauer и соавт. [378]. Более часто поверхностный рак наблюдался в последующие сроки эксперимента (3-5 месяца). Макроскопически он имел вид маленьких узелков, располагающихся, главным образом, на вершине складок слизистой оболочки. Рост поверхностного рака при таком расположении приводил к распространению опухолевого очага на поверхности слизистой и образованию экзофитных разрастаний локализующихся над слоем опухолево неизмененной слизистой оболочкой [21]. Рисунок 1.5 – В поверхностных отделах крипт слизистой оболочки толстой кишки крысы выявляются атипичные железы (рак in situ), окраска гематоксилином и эозином: а – обзорный снимок, Х200; б – рак in situ в поверхностных отделах слизистой оболочки, Х 400 (микрофотография гистологического препарата докторской диссертации проф. Пожарисского К.М. [21]). Постепенный рост опухоли в глубину слизистой оболочки приводил к тому, что вся толща ее к 4 месяцу была замещена аденокарциномой. По мере роста поверхностного рака вокруг него происходила гиперплазия слизистой оболочки.
Наряду с этим, соответственно месту возникновения поверхностного рака отмечалось расширение подслизистого слоя с выбуханием его в сторону просвета кишки, что давало начало образованию ножки экзофитной опухоли. Образованию соединительнотканной ножки полиповидных опухолей, по-видимому, способствуют перистальтические движения кишечника и тракция возникших экзофитных разрастаний кишечным содержимым; последний фактор приводит к тому, что экзофитные новообразования обычно наклонены в дистальном направлении и опухолевые массы как бы нависают над окружающей слизистой оболочкой. Первые экзофитные новообразования, обнаруженные к 4 месяцу эксперимента, имели уже выраженную инвазию ножки – это является показателем того, что инвазивный характер роста этих опухолей наступает очень быстро (рисунок 1.7) [19].
В дальнейшем интенсивность инвазии резко нарастала. При возникновении опухолевого роста в участке между складками развивались преимущественно эндофитные аденокарциномы, которые начали наблюдаться через 5 месяцев от начала опыта. Не было выявлено принципиальных цитологических различий в карциноме In situ, в поверхностном или инвазивном раке. В более отдаленные сроки после начала эксперимента (6-8 месяцев) отмечалось увеличение количества аденокарцином и их размеров, а также нарастание степени инвазии, которая в ряде случаев достигала серозного покрова кишки. Эти поражения сочетались с большим количеством карцином In situ и поверхностных раков. Основание и ножка многих экзофитных раковых опухолей часто были образованы нормальными железистыми структурами. Причем чем крупнее были экзофитные раки, тем больше было железистых структур в их составе; иногда в таких опухолях обнаруживались подслизистый и даже мышечный слои кишки [21].
Рецепторы к хемокинам и Ki-67 – факторы прогноза при аденокарциноме толстой кишки
Любопытно отметить, что при анализе уровня пролиферации в аденокарциномах толстой кишки не отмечалось увеличение уровня пролиферации со снижением дифференцировки (таблица 4.3). Более того, в низкодифференцированных аденокарциномах уровень пролиферации оказался даже ниже в сравнении с высокодифференцированными. При сравнении диссеминированного и локализованного рака, оказалось, что пролиферативный уровень при локализованной форме аденокарциномы толстой кишки оказался выше в сравнении с диссеминированными формами. Высокий уровень пролиферации по данным литературы наблюдается в ранних локализованных формах аденокарцином толстой кишки [9, 137].
Таблица 4.3 - Рспределение случаев аденокарциномы толстой кишки в зависимости от экспрессии Ki-67, ERCC-1, топоизомеразы-II-, дифференцировки и распространенности опухолей
Топоизомераза-II-альфа – белок с ферментативной активностью, участвующий в топологической сборке ДНК во время транскрипции, конденсации и сегрегации хромосом. Выявляется в S, G2 и М фазах митотического цикла. Топоизомераза-II-альфа – это мишень для антрациклинов, однако изолированное ее определение не позволяет сделать вывод об эффективности доксорубицина и его производных [230]. Кроме того, во многих работах топоизомераза-II-альфа оценивается при помощи in situ гибридизации [85, 129], то есть исследуется амплификация гена, а не его экспрессия, несмотря на то, что увеличение числа копий гена топоизомеразы-II-альфа не всегда коррелирует с его экспрессией [272]. Сравнительный анализ топоизомеразы-II-альфа с уровнем пролиферации
Иммуногистохимическое исследование топоизомеразы-II-a показало ядерную реакцию в раковых клетках, схожую с Ki-67 (рисунок 4.2). Позитивная реакция на топоизомеразу-II-a также выявлялась в основании крипт желез нормальной слизистой оболочки толстой кишки, а также в части клеток стромы, преимущественно в лимфоидных.
При сопоставлении экспрессии топоизомеразы-II-a с Ki-67 [13] в аденокарциномах толстой кишки оказалось, что данный показатель практически не изменяется при различной гистологической дифференцировке. При сравнении групп диссеминированного и локализованного рака толстой кишки степень экспрессии топоизомеразы -II-a в сопоставлении с Ki-67 также оказывался неизменным.
Как известно, химиотерапия при аденокарциномах желудка и толстой кишки относительно солидных опухолей других локализаций малоэффективна [60, 128]. С точки зрения молекулярной биологии – это достаточно странно, так как пролиферативный уровень в аденокарциномах толстой кишки является одним из самых больших.
Тимидилат синтаза – это фермент, генерирующий тимидин монофосфат (dTMP), который в дальнейшем фосфорилируется в тимидин трифосфат, необходимый для синтеза и репарации ДНК [127, 478]. Таким образом, он также как и ERCC1, выполняет функции, связанные с восстановлением ДНК после ее повреждения.
Иммуногистохимическое исследование топоизомеразы-II-a. Позитивная ядерная реакция в раковых клетках и клетках дна крипт слизистой оболочки толстой кишки, Х 200. Данная особенность TS (функция репарации ДНК после ее повреждение химиопрепаратом) объясняет связь ее экспрессии с резистентностью к химиотерапии, несмотря на то, что TS – это мишень для 5-фтор-пиримидинов.
При иммуногистохимическом исследовании тимидилат синтазы реакция носила ядерный характер различной степени интенсивности (рисунок 4.3). Позитивная реакция всегда выявлялась в клетках нормальной слизистой оболочки толстой кишки, а также в клетках стромы, что служило внутренним контролем для оценки иммуногистохимического окрашивания.
При оценке экспрессии TS оказалось, что муцинозные аденокарциномы имеют более высокий уровень экспрессии TS (таблица 4.5), что является плохим прогностическим фактором по данным одних авторов [194], хотя другие исследования не выявили корреляции экспрессии TS с выживаемостью больных распространенной аденокарциномой толстой кишки [432].
Тимидин фосфорилаза (TP) – показатель чувствительности опухолевых клеток к 5-фтор-пиримидинам. Превращает Капецитабин (Кселода) из неактивной в активную форму, а также стимулирует превращение 5-фтор-урацила в FdUMP, который ингибирует TS [467].
Иммуногистохимическое исследование показало смешанный характер реакции (ядерно-цитоплазматическая). На микрофотографии видно (рисунок 4.4), что даже в пределах одного ракового комплекса интенсивность реакции значительно варьировалась. Кроме того, важным наблюдением следует считать, что во всех исследованных случаях строма как внутри опухоли, так и вне ее показывала интенсивную реакцию, превышающую в раковых клетках. Часть случаев имели ярко-позитивную реакцию в строме, но негативную реакцию в опухоли (рис. 4.5).
Последний из ферментов, участвующий в метаболизме 5-фтор-пиримидинов – это дигидропиримидин дегидрогеназа (DPYD, DPD). Ее функция связана с деградацией нуклеотидов тимина и урацила, если их содержание в клетке превышает необходимое количество. Так как 5-фтор-пиримидины по своей сути представляют конкурирующие с тимином и урацилом аномальные нуклеотиды, DPYD также ответственен за разрушение и данного химиопрепарата
Иммуногистохимическое исследование показало позитивную цитоплазматическую реакцию в раковых клетках. На микрофотографии видно (рисунок 4.5), что реакция носила гранулярный тип с большим накоплением фермента в части клетки обращенной в просвет раковой железы. Также как и в случае изучения предыдущих ферментов, экспрессия DPYD выявлялась в нормальных тканях: строме и слизистой оболочке толстой кишки.
Анализ экспрессии DPYD показал, что в среднем негативная реакция наблюдается в 17% аденокарцином толстой кишки, уровень экспрессии практически не изменялся в зависимости от дифференцировки опухоли и от метастатического статуса (p 0,05, таблица 4.5). Это может быть связано с тем, что уровень экспрессии DPYD в первую очередь связывают с токсичностью препаратов ряда 5-фтор-пиримидинов [175, 371, 432], а не с их эффективностью.
В аденокарциномах легкого также наблюдались случаи с отсутствием экспрессии DPYD, а вот в аденокарциномах желудка был выявлен всего один случай с негативной реакцией на DPYD (таблица 4.6).
III-класс--тубулина – это белок микротрубочек цитоскелета нейрогенных клеток, в норме не встречающийся в железистом эпителии, но экспрессируется в части аденокарцином, обеспечивает резистентность опухолевых клеток к таксанам.
Иммуногистохимическое исследование III-класса--тубулина показало цитоплазматическую реакцию (рисунок 4.7) в 67% случаев аденокарцином толстой кишки (таблица 4.7). Реакция была различной выраженности как в пределах одной опухоли, так и в различных наблюдениях. На микрофотографии видно (рисунок 4.6), что позитивная реакция выявлялась в отдельных клетках нормальной слизистой оболочки толстой кишки.
