Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Роль компонентов микроокружения злокачественных новообразований в течении опухолевого процесса (обзор литературы) 12
1.1. Терминология, определение понятий в учении о микроокружении опухоли 12
1.2. Современные представления о влиянии структурных компонентов перитуморальной зоны на течение опухолевого процесса 14
1.3. Учение о внеклеточных нейтрофильных ДНК-сетях и их роли в течении опухолевого процесса 23
Глава 2. Материалы и методы исследования 28
2.1. Принципы группировки материала, дизайн исследования 28
2.2. Характеристика объектов исследования 33
2.3 Методы исследования 41
2.3.1. Микроскопические методы исследования перитуморальной зоны 50
2.3.2. Статистические методы обработки результатов 56
Глава 3. Морфологическая характеристика воспалительно-клеточного инфильтрата и волокнисто-сосудистого компонента перитуморальной зоны при карциноме гортани 58
3.1. Морфологические особенности воспалительно-клеточного компонента перитуморальной зоны при карциноме гортани 58
3.2. Структурные особенности волокнисто-сосудистого компонента перитуморальной зоны карциномы гортани 82
Глава 4. Сравнительная морфологическая характеристика компонентов перитуморальной зоны при карциноме гортани и карциноме гортани в состоянии лучевого патоморфоза 94
Глава 5. Структурные особенности компонентов перитуморальной зоны при различных клинических стадиях карциномы гортани 108
Заключение 124
Выводы 131
Практические рекомендации 133
Список сокращений 134
Список используемой литературы 135
- Современные представления о влиянии структурных компонентов перитуморальной зоны на течение опухолевого процесса
- Морфологические особенности воспалительно-клеточного компонента перитуморальной зоны при карциноме гортани
- Сравнительная морфологическая характеристика компонентов перитуморальной зоны при карциноме гортани и карциноме гортани в состоянии лучевого патоморфоза
- Структурные особенности компонентов перитуморальной зоны при различных клинических стадиях карциномы гортани
Современные представления о влиянии структурных компонентов перитуморальной зоны на течение опухолевого процесса
Углубленное изучение роли и значения противоопухолевой защиты в возникновении и развитии ЗНО занимает одно из ведущих мест в иммунологии, наряду с иммунодиагностикой, иммунопрофилактикой и иммунотерапией [49]. В современной онкологии изучение роли иммунной системы в патогенезе ЗНО является одним из перспективных научно-поисковых направлений [48-49, 120, 143, 145-147, 150, 167, 177, 201-202]. В зону микроокружения многие отечественные авторы относят перитуморальные тканевые компоненты без четкой размерной градации. Микроокружение опухоли рассматривается ими как сложная система стромально-паренхиматозных взаимоотношений и ответная хроническая воспалительная реакция на рост опухоли [10, 65].
Микроокружение опухоли - важный показатель иммунного ответа на опухоль и является важным компонентом опухолевой прогрессии [93, 196]. Оно сформировано комплексно взаимодействующими между собой внеклеточным матриксом, нервными окончаниями, кровеносными сосудами, а также клетками воспалительного инфильтрата, которые, в свою очередь, продуцируют сигнальные молекулы типа провоспалительных цитокинов, селектинов, хемокинов, которые могут воспринимать опухолевые клетки [96, 136], а сам воспалительно-клеточный инфильтрат определяет пролиферативную активность, миграцию и метастазирование опухолевых клеток [11, 199, 200]. В связи с этим, придают особое значение определению выраженности воспалительной инфильтрации и формированию представлений о составных особенностях данной инфильтрации [64]. В свою очередь, C. A. Whipple в своих работах определяет микроокружение опухоли как новую терапевтическую мишень и матрицу стромальных клеток (в частности фибробластов), которые способствуют росту и прогрессии опухоли [18, 213, 227].
Наряду с механизмами защиты самой опухоли, иммуносупрессия может вызываться ятрогенно физическими и химическими агентами, применяемыми для лечения злокачественных новообразований. Большинство из них, включая облучение и цитостатики, разрушают иммунокомпетентные клетки. В работах C. Perisanidis et al. (2013) показано, что оценка системной воспалительной реакции имеет прогностическое значение в широком диапазоне злокачественных новообразований [188, 225]. Исследователи B. Rassouli et al. (2015) и C.R. Haddad et al. (2015) изучили соотношения лимфоцитов и нейтрофилов, тромбоцитов и лимфоцитов периферической крови на примере когорты пациентов с местно-распространенным плоскоклеточным раком головы и шеи, получавшим химио-лучевое лечение. Исследователи оценивали общую выживаемость, метастазирование и рецидивы. Независимым предиктором смертности рассматривался высокий показатель соотношения тромбоцит/лимфоцит, предиктор рецидива плоскоклеточного рака головы и шеи – высокое соотношение нейтрофил/лимфоцит [190, 229].
Оценка клеточного инфильтрата стромы ЗНО с подробным рассмотрением всей палитры его состава в последнее десятилетие интересует многих исследователей. По данным группы авторов Y.L. Liu et al. (2005) плотность тучноклеточной и макрофагальной инфильтрации аденокарцином желудка обратно пропорциональна глубине инвазии опухоли и количеству метастатически пораженных лимфоузлов, что свидетельствует о важной роли тучных клеток и макрофагов инфильтрата в предупреждении опухолевой инвазии и метастазирования [30, 110, 169, 174, 209, 238]. Важной диагностической и прогностической ценностью обладают результаты детального изучения микроокружения опухоли, паренхиматозно-стромальных взаимодействий в различных злокачественных эпителиальных опухолях [164, 185, 194, 248]. Известно, что у истоков малигнизации стоят молекулярно-генетические перестройки в эпителиальных клетках. Многие исследования показали, что аналогичные генетические повреждения можно встретить и в клетках стромы опухоли, что в некоторых случаях опережает соответствующие изменения в эпителиальном компоненте [2, 10, 43, 76, 142].
Плоскоклеточная карцинома головы и шеи характеризуется биологической гетерогенностью [27, 28, 34, 104, 118]. На сегодняшний день в отечественной и зарубежной литературе выделяют несколько факторов, определяющих биологические особенности карциномы головы и шеи, такие как ИЛ-8, циклин D1, р53, р16, некоторые авторы с метастазированием карциномы связывают наличие белков протеаз, белков мезенхимальных клеток, молекулы клеточной адгезии, хемокины [20, 34, 39, 114, 129-132, 157, 191, 231, 243].
Согласно теории канцеризации, предложенной Слоттером в 1953 году для плоскоклеточных карцином полости рта, считается, что «рак не возникает как изолированный клеточный феномен, а представляет собой анапластическую тенденцию с участием множества клеток сразу…» [236]. Распространение опухоли в теории полей канцеризации рассматривалось как генетические поломки и преобразование клеток нормального эпителия, непосредственно контактирующего с опухолью, а не в качестве разрушения нормальных клеток опухолевым клоном и дальнейшим его разрастанием [36]. Авторы полагают, что существование полей канцеризации является свойством только эпителиальных опухолей (пищевод, желудок, кожа, легкие и других органов) и связано с защитной функцией эпителиальных клеток [9, 137, 165, 195, 244]. Молекулярные повреждения в геноме клетки при ЗНО, в том числе плоскоклеточных карциномах головы и шеи, бывают генетические и эпигенетические [148, 221]. К последним, в свою очередь, относят аномальное метилирование регуляторных районов генов-супрессоров, в результате чего возникает функциональная инактивация этих генов, регулирующих клеточный цикл. Важным вопросом, связанным с полем канцеризации является вопрос о границах его и протяженности. Мнения расходятся и, предполагается, что его протяженность может зависеть от гистотипа опухоли. Так, для плоскоклеточной карциномы головы и шеи протяженность составляет 7,0 см [240]. На сегодняшний день, отечественными и зарубежными учеными углубленно исследуются пограничные неопухолевые ткани в составе полей канцеризации и их возможные эпигенетические изменения при различных ЗНО различных локализаций [17, 46, 70, 103, 111, 138-140, 197, 224]. Несмотря на противоречивость исследовательских данных в отношении полей канцеризации, также несомненно остается актуальным уточнение эпителиально-стромальных изменений в непосредственной близости к опухоли [33, 80, 170].
Опухолевая прогрессия на примере различных эпителиальных новообразований молочной железы сопровождается значительными количественными изменениями в системе «строма-паренхима» и между различными стромальными клеточными популяциями с изменением характера корреляционных связей между ними. Таким образом, изменения количественных показателей стромальных клеточных популяций могут дать информацию о дальнейшем поведении эпителиального компонента опухоли [1]. Микроокружение опухоли несомненно должно обладать своими особенностями соотношения сосудисто-волокнистого компонента и воспалительно-клеточного инфильтрата, и вероятна определенная динамика изменений в соотношении ее компонентов в зависимости от степени злокачественности опухоли, с учетом лучевого патоморфоза опухоли [66, 68]. Лучевая терапия, в свою очередь, вызывает гибель части популяции опухолевых клеток на примере рака молочной железы, но, в то же время, способствует несостоятельности или прекращению местных иммунных цитолитических реакций в периартериолярных зонах и их ослаблению в перикапиллярных, что в свою очередь повышает вероятность размножения и распространения опухолевых клеток вокруг сосудов [66, 105].
Корреляционные взаимосвязи клеточных элементов окружения микрососудов в центральных и периферических зонах опухолевого узла рака молочной железы достоверно изменяются в зависимости от предшествующего местного радиационного воздействия, соответственно клеточный компонент микроокружения в злокачественных опухолях, в том числе в плоскоклеточных карциномах головы и шеи, также способен к динамическим изменениям при прочих равных условиях [7, 21, 27, 52, 97, 100, 113, 125-126, 127-129, 162, 166, 178, 183, 222, 234].
Определение степени регресса плоскоклеточной карциномы гортани базируется на оценке повреждения первичного опухолевого конгломерата и включает в себя 4 степени патоморфоза [66, 68]. Такой анализ опухолевого регресса позволяет предсказать вероятность благоприятного исхода лечения пациентов в долговременной перспективе. Альтерация опухолевых клеток является критерием эффективности лучевой терапии рака гортани [13, 24, 66, 68, 207]. В зарубежной литературе описано иммуносупрессивное воздействие низких доз гамма-излучения на опухолевое микроокружение на примере инсулиномы. В ходе исследования, на фоне излучения повышение плотности опухоль-ассоциированных макрофагов и после гамма-облучения зоны опухоли связывали с неблагоприятным прогнозом [228]. Нейтрофильный гранулоцит также обладает радиочувствительностью. Низкие дозы острого облучения до 0,1ГР стимулируют формирование ДНК-сетей нейтрофилов, в отличие от доз выше 10Гр, а лимфоциты являются наиболее радиочувствительными иммунокомпетентными клетками и гибнут сразу после облучения в больших дозах путем апоптоза. [144].
Врожденный и адаптивный иммунитет осуществляет противоопухолевый надзор посредством клеточного и гуморального факторов [156]. Клеточный иммунитет опосредуется иммунокомпетентными клетками и их продуктами, тогда как гуморальный – действиями сывороточных факторов. Ключевой компонент иммунного ответа – это малые лимфоциты, проходящие через тимус и получающие дифференцировку в клетки, участвующие в клеточном иммунитете (Т-клетки), тогда как другие идут в обход тимуса и дифференцируются в клетки, опосредующие гуморальный иммунитет (В-клетки) [141, 226, 241, 246].
Морфологические особенности воспалительно-клеточного компонента перитуморальной зоны при карциноме гортани
В группу исследования КГ (n=94), согласно критериям ВОЗ [171] вошли «обычные плоскоклеточные карциномы» (convenctional squamous cell carcinoma). Среди них в 49 наблюдениях диагностирована ороговевающая, а в 45 неороговевающая плоскоклеточная КГ. Случаи КГ были разделены с учетом степени дифференцировки новообразования (G1-3) и сформировали 3 подгруппы, а именно высокодифференцированные (G1) – 32 случая, умереннодифференцированные (G2) – 32 и низкодифференцированные КГ (G3) – 30 наблюдений.
Высокодифференцированные плоскоклеточные карциномы морфологически состояли из плоских эпителиоцитов с примесью крупных кератиноцитоподобных клеток, а также мелких базалоидных клеток. Последние зачастую локализовались на периферии новообразования. Практически в каждом поле зрения определялись межклеточные мостики и разновеликие зоны ороговения, митозы определялись крайне редко или отсутствовали (рисунок 3.1).
Для умереннодифференцированной плоскоклеточной КГ был харатерен умеренный ядерный полиморфизм со значительным представительством митотических картин, среди которых регистрировали митозы патологического типа (рисунок 3.2). Для этой группы опухолей значительное ороговение не являлось типичным, а слабая тенденция к появлению роговых масс определялась в единичных случаях.
В низкодифференцированных плоскоклеточных КГ базальный тип клеток преобладал в общей массе опухоли. При этом определялись множественные митозы, включая патологические, слабо выраженные межклеточные мостики, отсутствие ороговения (рисунок 3.3).
В ходе определения качественного состава клеток ПЗ во всех случаях установлен полиморфноклеточный характер отграничения опухоли с преобладанием лимфогистиоцитарных элементов и плазмоцитов. При этом среди элементов инфильтрата определялись группы нейтрофильных и эозинофильных гранулоцитов, макрофагов, ксантомных («пенистых») клеток с примесью гигантских многоядерных макрофагов. Клеточные элементы полиморфноклеточного инфильтрата располагались на всем протяжении ПЗ диффузно с наибольшей концентрацией в зоне непосредственной границы с элементами новообразования.
При проведении морфологического исследования установлено, что представительство различных воспалительноклеточных элементов в строме КГ и ПЗ различалось в зависимости от степени дифференцировки новообразования. Так, в менее дифференцированных КГ (G3) и в строме опухоли и в ПЗ отмечалась более выраженная гранулоцитарно - лимфоцитарная инфильтрация по сравнению с аналогичными параметрами при высокодифференцированной (G1) КГ (таблица 3.1). Как видно из таблицы 3.1. определяются статистически значимые различия в полуколичественной оценке гранулоцитов и лимфоцитов в группах G1 – G3. В низкодифференцированных опухолях выраженность общей полиморфноклеточной инфильтрации была значительнее, чем при умеренно - и высокодифференцированных новообразованиях, и составила 2-3 балла для гранулоцитов, 3-4 балла для лимфоцитов (р=0,00014; р=0,00033 соответственно), тогда как количество плазмоцитов в ПЗ при различных степенях дифференцировки КГ статистически не отличалось (р=0,061). Поскольку гранулоциты достоверно преобладали в инфильтрате, соответственно степень активности воспаления в ПЗ при низкодифференцированных КГ (G3) преобладала и соответствовала 2 и 3 степеням.
Сравнительную оценку иммунофенотипа клеток ПЗ и стромы опухоли провели в 15 случаях высокодифференцированной КГ, в 15 – умереннодифференцированной и в 15 наблюдениях низкодифференцированной КГ. В таблице 3.2 отражена количественная сравнительная характеристика компонентов воспалительно-клеточного инфильтрата ПЗ (медиана и квартили) и объемной доли (об.%)) КГ и стромы опухоли (О) в зависимости от степени дифференцировки опухоли (G1-3). В таблице количество клеток отражено значениями медианы (квартили) = Ме (Q1; Q3); где СD 7+ позитивые лимфоциты это Т- лимфоциты предшественники, СD 4+ это Т-лимфоциты хелперы, СD 8+ это Т- цитотоксические, СD 56+ это NK-клетки (натуральные киллеры), CD79+ и CD 20 + это В-лимфоциты, CD138+ это плазмоциты, CD68+ это макрофаги, CD15+ нейтрофильные гранулоциты.
Для подтверждения ненормального распределния данных использовали критерий Шапиро-Уилка, Колмогорова-Смирнова с поправкой значимости Лильефорса. Слишком малые значения р (менее 0,0001) мы обозначали как р 0,001 согласно рекомендациям по представлению статистических данных в научных публикациях Т. Н. Унгуряну и соавт. [119]. При анализе абсолютных значений количества клеток применяли критерий Краскела-Уоллиса – группирующая переменная степень дифференцировки опухоли (G1-3), для критерия Краскела-Уоллиса поправка Бонферрони равна 0,017; Критерий Манна-Уитни с группирующей переменной область исследования (ПЗ и О) (таблица 3.2). С использованием программы ВидеоТест «Морфология» рассчитывалась объемная доля клеток в % (удельный объем клеток согласно полученным данным программы ВидеоТест «Морфология» х 100%) при исследовании на площади поверхности микропрепарата равной 749,205 мкм (1/мм) при увеличении 100. Каждый этап морфометрического исследования сопровождался исследованием корреляционных связей (коэффициент корреляции Спирмена rs) для оценки взаимосвязей количества клеток воспалительно-клеточного инфильтрата ПЗ и степени дифференцировки опухоли.
Нами установлено (таблица 3.2), что лимфоцитарный состав перитуморального воспалительного инфильтрата и его плотность варьируют в зависимости от степени дифференцировки опухоли, что может быть связано с миграцией некоторых лимфоцитов из ПЗ в строму опухоли. Так, в менее дифференцированных опухолях (G3), в воспалительном клеточном инфильтрате ПЗ КГ статистически значимо меньше CD 4+ позитивных Т- лимфоцитов и плазматических клеток (CD 138+). При анализе количества СD 4+Т-лимфоцитов критерий Краскела – Уоллиса р 0,001; критерий Манна-Уитни для G1 и G2 показатель р1-2 = 0,015; для G2 и G3 р2-3 0,001; для G1 и G3 р1-3 0,001. При анализе количества плазмоцитов критерий Краскела –Уоллиса р 0,001; критерий Манна-Уитни для G1 и G2 показатель р1-2 0,001; для G2 и G3 р2-3 = 0,002; для G1 и G3 р1-3 0,001. В зависимости от степени дифференцировки не наблюдалось достоверных различий в инфильтрации стромы опухоли (О) и ПЗ плазмоцитами (использовали критерий Манна-Уитни, где группирующей переменной была область исследования количества клеток (строма опухоли и перитуморальная зона), значения р1-2 = 0,093; р2-3= 0,087; р1-3= 0, 076 соответственно). Также установлено, что с изменением степени дифференцировки опухоли в сторону менее дифференцированных опухолей количество CD4- позитивных лимфоцитов в ПЗ уменьшалось, причём наблюдалось увеличение их представительства в строме опухоли. Этот феномен может быть проявлением миграции лимфоцитов из кровеносного русла, более выраженном в строме опухоли и в ПЗ при низкодифференцированных опухолях.
Нами установлено, что статистически значимо в низкодифференцированных КГ (G3) прямопропорционально повышается количество в ПЗ СD 7+ Т-лимфоцитов предшественников (rs= 0,456, р 0,001); CD8+ Т-лимфоцитов цитотоксических (rs= 0,174, р 0,001) и CD56+ натуральных киллеров (rs= 0,7, р 0,001), макрофагов (CD68+)(rs= 0,779, р 0,001), В-лимфоцитов (CD79+(rs= 0,804, р 0,001))и СD20+ (rs= 0,768, р 0,001), нейтрофильных гранулоцитов (CD 15+) (rs= 0,724, р 0,001). При корреляционном анализе установлено, что CD4 позитивные клетки уменьшаются в количестве в менее дифференцированных опухолях (G3) (rs= - 0,477, р 0,001). Во всех случаях статистического анализа по группирующей переменной (степени дифференцировки) критерий Краскела – Уоллиса р 0,001.
В КГ G1 и G2 строму опухоли инфильтрировали лишь единичные Т-клетки. Так, для СD 7+ лимфоцитов медиана составила 17 (14;22), для СD 8+ составила 19(15;24); и 11 (5;13) для CD 56+ натуральных киллеров.
Наряду с этим, CD 7+ позитивные, CD8+ CD56+ позитивные лимфоциты определялись в основном в ПЗ, объемная плотность (%) CD8+ и CD56+ лимфоцитов была выше в случаях КГ G3 и составила 9,2, 11,3 и 11,4 соответственно, однако уже без тенденции к распространению Т-клеточного инфильтрата в строму новообразования.
При оценке В-лимфоцитарного клеточного компонента демаркационного воспалительного инфильтрата вокруг опухоли нами установлено, что в полиморфноклеточном окружении преобладали В-лимфоциты преимущественно в низкодифференцированных опухолях (G3) и преимущественно в перитуморальной зоне. Медиана CD79 и CD20 позитивных лимфоцитов 587(534;600) и 357(342;389) соответственно.
Количество CD68+ позитивных макрофагов ПЗ статистически значимо увеличивалось в низкодифференцированных КГ (G3), медиана составила (568(550;602)), причем заметно повышалось количество туморассоциированных макрофагов, что объясняет их фагоцитирующую функцию остатков разрушенных тканей при росте опухоли, а также активную роль макрофагов в лимфогенном метастазировании низкодифференцированных опухолей (G3) за счет выработки VEGF-C, D, A; IL-1b; TNFa и стимуляции лимфангиогенеза, что не противоречит данным S. F. Schoppmann (2002), К. Maruyama (2005), A. Sica (2006). [214, 233, 235]
Сравнительная морфологическая характеристика компонентов перитуморальной зоны при карциноме гортани и карциноме гортани в состоянии лучевого патоморфоза
При анализе клеточного и волокнистого компонентов ПЗ ЗНО различных клинических стадий, находящихся в лучевом патоморфозе (I, II, III степеней) согласно современным морфологическим критериям оценки степени патоморфоза опухоли по Е.Ф. Лушникову и соавт. и Г. А. Лавниковой [66,68] исследовано 25 случаев КГ. Из них к 1 клинической стадии было отнесено 10 случаев КГ (40%), 2 стадии - 7 (28%); 3 стадии – 7(28%); 4 стадии – 1(4%). При анализе коэффициента корреляции Спирмена (r) обнаружена статистически значимая прямая слабая связь между кровеносными сосудами и клинической стадией опухолевого процесса (rs= 0,472 , р=0,017 ). Статистически значимая обратная слабая связь обнаружена между лимфатическими сосудами и клинической стадией (rs= - 0,405 , р=0,044 ), что может объясняться повышением гидростатического давления в тканях за счет растущей опухоли [184].
Обратная слабая связь обнаружена между количеством гранулоцитов и клинической стадией опухоли (rs= - 0,437, р=0,029). Таким образом, начальные клинические стадии опухоли, находящейся в состоянии лучевого терапевтического патоморфоза различных степеней, характеризуются большей объемной плотностью кровеносных и лимфатических сосудов, а также повышенным количеством гранулоцитов, что может объяснять лучший эффект от лучевой терапии на начальных стадиях опухолевого процесса, когда хорошая васкуляризация является залогом успешной лучевой терапии, повышающей безрецидивную выживаемость пациентов [180, 183].
Согласно современным представлениям о лечебном патоморфозе опухоли (Лушников Е.Ф. и соавт) [68], входе исследования проведен морфологический анализ КГ в состоянии лучевого патоморфоза. Для КГ в состоянии слабого лучевого патоморфоза I степени было характерно сохранение гистологической формы опухоли с отсутствием заметных изменений в структуре её, клетках паренхимы и стромы, определялся незначительный полиморфизм и дистрофия опухолевых клеток, единичные фигуры митозов (рисунок 4.1). патоморфоза (I степени) Минимальные дистрофические изменения в клетках опухоли. Группа исследования 2. Окраска гематоксилином и эозином; х400.
При КГ в состоянии умеренного и выраженного лучевого патоморфоза (II и III степеней) в клетках опухолей обнаруживались значительные дистрофические и некробиотические изменения, нарушение деления с появлением гигантских клеток, сосудистые изменения с нарушением кровообращения, сосудистыми расстройствами различной выраженности, очагами кровоизлияний, массовая гибель клеток опухоли с образованием полей некроза (рисунок 4.2 – 4.5).
При IV степени лучевого патоморфоза определялся фиброз ткани с отсутствием опухолевых клеток, замещением некротизированной опухоли соединительной тканью, островки ксантомных клеток, кистозноподобные структуры, группы многоядерных макрофагов, отложения гемосидерина (рисунок 4.6 – 4.7).
При корреляционном анализе обнаружены связи между клетками ПЗ КГ в состоянии лучевого патоморфоза, но в меньшем количестве, чем в исследуемых случаях КГ без предшествующей лучевой терапии (рисунок 4.8 -4.10 ).
Обнаружено, что в случаях КГ в состоянии лучевого патоморфоза CD4+ Т-лимфоциты хелперы и CD 138+ плазмоциты имеют сильную прямую связь (rs= 0,771, р 0,001). В-лимфоциты CD 79 альфа позитивные имеют слабую обратную связь с CD4+ Т-лимфоцитами хелперами (rs= - 0,445, р=0,026) и CD 138+ плазмоцитами (rs= - 0,438, р=0,029). При этом, CD 15+ гранулоциты сохраняют слабую обратную связь с CD 138+ плазмоцитами (rs= - 0,412, р=0,041), умеренную прямую по силе связь только с В-лимфоцитами CD 79 альфа +(rs= 0,573, р=0,003). Т-лимфоциты CD8+ , CD 68+ макрофаги, CD56+ натуральные киллеры утратили статистически значимые связи со всеми клетками воспалительного инфильтрата ПЗ. Тогда как CD7+ Т-лимфоциты имеют сильную прямую свзяь с CD20+ В-лимфоцитами (рисунок 4.11).
При сравнительном анализе показателей медиан количества клеток в ПЗ КГ и КГ в состоянии лучевого терапевтического патоморфоза, статистически значимыми различиями в медианах по исследуемым группам сравнения обладали: СD7 + Т-лимфоциты предшественники (критерий Манна-Уитни U , р=0,026); Т-лимфоциты цитотоксические СD8 + (р=0,035); В-лимфоциты СD20 + (р 0,001); макрофаги СD68 + (р 0,001); В-лимфоциты СD79а + (р 0,001) ; гранулоциты СD15 + (р 0,001) (таблица 4.1). Статистически значимых различий не обнаружено среди Т-лимфоцитов хелперов (СD4+), натуральных киллеров (СD56 +), плазмоцитов (СD138+) (таблица 4.1).
Между выраженностью постлучевых изменений в опухоли (степеням патоморфоза) и клетками воспалительного инфильтрата статистически значимые связи отсутствуют. Волокнистый компонент ПЗ также претерпевает изменения в ходе лучевой терапии КГ. Так, в ПЗ КГ в состоянии лучевого патоморфоза статистически значимо выше объемная плотность коллагеновых волокон Ме=3,7 (3,55;4,15) в сравнении с КГ без ДЛТ в анамнезе (Ме=1,8 (1,1;3,5), критерий Манна-Уитни U, р 0,001). Объемная плотность ретикулярных волокон в КГ 0,6 (0,375;1,3); а в ПЗ КГ в состоянии лучевого патоморфоза 0,4 (0,3;0,6), р=0,018) (таблица 4.2, рисунки 4.12-4.13).
Структурные особенности компонентов перитуморальной зоны при различных клинических стадиях карциномы гортани
Клиническую стадию опухолевого процесса характеризуют показатели ТNM, включающие такие свойства опухоли, как размеры, глубину прорастания в структуры гортани и врастание в прилежащие ткани, объем поражения анатомических областей органа (надскладочный отдел, подскладочный отдел, вестибулярный отдел; правая и левая половины гортани), способность к метастазированию.
Для обнаружения различия в воспалительном инфильтрате ПЗ при КГ (n=45) в зависимости от клинической стадии опухоли, был рассчитан коэффицитент корреляции Спирмена (учитывая неправильность распределения данных). Нами обнаружена статистически значимая связь клинической стадии КГ и количества Т-лимфоцитов хелперов CD4 (clone 4В12) (rs = - 0,316 , р = 0,034). Остальные компоненты воспалительного инфильтрата ПЗ при КГ связи с клинической стадии опухолевого процесса не имеют (таблица 5.1).
Также, несмотря на достоверные корреляционные связи всех клеток воспалительного инфильтрата ПЗ КГ между собой, отсутствует связь количества клеток воспалительного инфильтрата ПЗ КГ и волокон ПЗ КГ, глубины прорастания опухоли. За глубину прорастания принимали следующие: рост опухоли в пределах подслизистого слоя слизистой оболочки стенки гортани; рост опухоли до хряща; врастание в хрящ и за пределы стенки гортани в мягкие ткани шеи. Коэффициенты корреляции Спирмена соответственно равны: Т-хелперы СD4+ ( rs = -0,189 , р=0,214), Т-лимфоциты предшественники СD7 + ( rs = 0,158 , р= 0,301), Т-лимфоциты цитотоксические СD8 + ( rs = 0,260 , р=0,084), натуральные киллеры СD56 + ( rs = 0,188 , р= 0,216), В-лимфоциты СD20 + ( rs = 0,236 , р= 0,119), плазмоциты СD138+ ( rs = - 0,091 , р= 0,552), макрофаги СD68 + ( rs = 0,231 , р= 0,128), В-лимфоциты СD79 + ( rs = 0,092 , р= 0,549), гранулоциты СD15 + ( rs = 0,271 , р= 0,072).
Полученные данные позволяют предположить, что состав и количество клеток воспалительного инфильтрата ПЗ КГ не зависит от клинической стадии опухолевого процесса и глубины прорастания КГ в подлежащие ткани. А значит, воспалительный иммунный перитуморальный ответ не зависит от размерных характеристик опухоли, соответственно категория «Т» в международной клинической классификации TNM, а значит и в стадировании новообразования (которое основывется на показателях TNM), не имеет значения при анализе микроокружения ПЗ КГ. Исходя из этого, нами проведен анализ категории «N» из клинической TNM классификации, что характеризует региональные метастазы опухоли.
Нами обнаружено, что количество клеток воспалительного инфильтрата ПЗ КГ имеет статистически значимую связь с наличием в исследуемых случаях метастатического поражения шейных лимфоузлов (таблица 5.2). Были исследованы случаи КГ с наличием метастатического поражения региональных лимфоузлов (n= 9) и без метастазов (n=36). Это составило 30% и 56,3% от всех исследуемых случаев КГ. Так, при наличии метастатического поражения в шейных лимфоузлах медиана (Ме (Q1; Q3)) для CD 8 + Т-лимфоцитов (Ме = 210,0 (138,0; 236,0)), для CD 79 альфа + В-лимфоцитов (Ме =587,0 (304,0; 598,0)), для CD20+ В-лимфоцитов (Ме = 345,0 (243,0; 383,5)), для CD15+ гранулоцитов (Ме = 428,0 (227,0; 472,0)), тогда как при отсутствии метастазов в лимфоузлах показатели следующие: медиана для CD 8 + Т-лимфоцитов (Ме = 139,5 (121,5; 157,25)), для CD 79 альфа + В-лимфоцитов (Ме =383,5 (258,75; 501,0)), для CD20+ В-лимфоцитов (Ме = 274,0 (190,0; 321,5)), для CD15+ гранулоцитов (Ме = 293,0 (132,0; 314,5)).
Полученные результаты позволяют судить о повышении количества В-лимфоцитов и гранулоцитов (таблица 5.2 ) в ПЗ КГ при наличии метастатического поражения шейных лимфоузлов, и уменьшении количества этих клеток при отсутствии метастазов в лимфоузлы шеи. Таким образом, при метастазах количественный состав воспалительного инфильтрата ПЗ КГ повышается и направлен на возможное подавление тенденции опухоли к инвазии в сосуды (кровеносные и в большей степени в лимфатические сосуды).
Так как количество только СD4+ Т-лимфоцитов хелперов в ПЗ КГ обнаруживает связь количества этих клеток с клинической стадией опухолевого процесса (согласно значениям TNM) и учитывая, что одним из критериев включения в группу исследования являлось отсутствие отдаленных метастазов (категория М0 в TNM классификации), а количество СD4+ Т-лимфоцитов хелперов в ПЗ КГ не находится в связи с наличием метастазов в лимфоузлы шеи (категория N), глубиной инвазией и протяженностью опухоли, полагаем, что метрические характеристики самой опухоли и наличие метастазов в региональные лимфоузлы не оказывают влияния на воспалительный клеточный СD 4+ инфильтрат ПЗ КГ. Учитывая наличие достоверно значимых корреляционных связей между всеми клетками воспалительного инфильтрата ПЗ КГ, а также между клетками и степенью дифференцировки опухоли (G), вероятно предположить, что на качественно-количественный состав воспалительного клеточного компонента ПЗ КГ оказывают влияние морфологические характеристики опухоли, ее потенциал злокачественности и сами клетки микроокружения опухоли.
Воспалительный клеточный состав и его плотность в ПЗ варьируют в зависимости от степени дифференцировки опухоли. Отсутствуют статистически значимые связи клеточного инфильтрата и клинической стадии опухолевого процесса, что, вероятно связано с миграцией некоторых лимфоцитов из перитуморальной зоны в строму опухоли.
Качественные особенности инфильтрации клетками ПЗ при КГ и опухоли в зависимости от клинических стадий были обнаружены и продемонстрированы на рисунках 5.1 – 5.11. Тогда как статистически достоверных связей количества клеток и клинической стадии КГ мы не обнаружили, это может подтверждать факт миграции лимфоцитов из дистантных областей ПЗ (отдаленных от опухоли) на границу с опухолью. Так, при исследовании микропрепаратов нами обнаружена разница между интенсивностью (характером) изменений в ПЗ и вариантом клинической стадии КГ: чем менее распространен опухолевый процесс (начальные клинические стадии КГ), тем слабее выраженность диффузно-очаговой лимфоцитарной инфильтрации с тенденцией преобладающей локализации элементов инфильтрата на границе между клетками новообразования и ПЗ. С изменением клинической стадии от I к III определяется увеличение клеточной плотности лимфоцитарного инфильтрата вокруг опухолевого узла с миграцией Т-клеток хелперов (CD4+) на границу ПЗ и опухоли, с проникновением данных клеток в строму новообразования (таблица 3.2). Вместе с тем, Т-клетки цитотоксические (СD8+) и естественные киллеры (CD56+) группируются преимущественно на границе с опухолью, формируя очаги, «гнёздные» скопления с минимальной тенденцией к проникновению в пласты опухолевых клеток. На начальных клинических стадия опухолевого процесса отсутствуют качественные различия в распределении CD79+(В-лимфоциты), CD138+(плазмоциты), CD68+ (макрофаги).
Таким образом, были выявлены взаимосвязи плотности и количества воспалительного клеточного инфильтрата и волокнистого компонента в перитуморальной зоне с рядом важных клинико-морфологических параметров плоскоклеточной карциномы гортани (клинической стадией, степенью дифференцировки опухоли, наличием метастазов в региональных лимфоузлах, наличием лучевого патоморфоза опухоли и окружающих тканей, глубиной прорастания опухоли).