Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Общая характеристика амелобластомы 12
1.1.1. Гистогенез амелобластомы 15
1.1.2. Морфология амелобластомы 15
1.1.3. Классификации 16
1.2. Клиническая диагностика амелобластомы 20
1.3. Лечение амелобластомы 21
1.4. Wnt сигнальный путь 26
1.4.1. Механизмы активации Wnt–сигнального пути 26
1.4.2. Роль – катенина в клеточной адгезии 30
1.4.3. Роль Wnt /– катенин сигнального пути в одонтогенезе 31
1.4.4. Исследования Wnt/ –катенин сигнального пути в амелобластоме 34
1.4.5. Некоторые другие маркеры Wnt /– катенин сигнального пути 35
1.5. Маркер плюрипотентных клеток SOX2 35
1.6. Маркер пролиферативной активности Ki–67 37
1.7. Таргентная терапия 39
Глава 2. Материал и методы исследования 42
2.1. Клиническая характеристика материала 42
2.2. Этапы обработки операционного биопсийного материала 42
2.3. Обработка медицинской документации 44
2.4. Иммуногистохимический метод 44
2.5. Техника иммуногистохимического исследования 45
2.6. Статистический анализ 47
Глава 3. Результаты исследования 48
3.1 Анализ демографических показателей у пациентов с амелобластомой 48
3.2 Общая характеристика амелобластом 49
3.3 Иммуногистохимическое исследование маркеров Wnt/– катенин сигнального пути в зачатке зуба. Результаты микроскопии 51
3.4 Иммуногистохимическое исследование белков Wnt/– катенин сигнального пути в фолликулярной кисте. Результаты микроскопии 53
3.5 Иммуногистохимическое исследование белков Wnt/– катенин сигнального пути в амелобластоме 54
3.6 Исследование Wnt/– катенин сигнального пути в рецидивирующей амелобластоме 65
3.6.1 Результаты иммуногистохимического исследования с маркером – катенином. Ядерная и внеядерная локализация маркера в рецидивирующих и нерецидивирующих амелобластомах различных морфологических типов 65
3.6.2 Характеристика рецидивирующей амелобластомы 77
3.6.3 Статистический анализ случаев рецидивирования амелобластомы 81
3.6.4 Корреляционные взаимосвязи между ядерной локализацией – катенина и показателем пролиферативной активности, количеством SOX2, наличием рецидива 90
Обсуждение результатов исследования 93
Заключение 101
Практические рекомендации 102
Перспективы дальнейшей разработки темы: 103
Список сокращений и условных обозначений 104
Список литературы 108
- Лечение амелобластомы
- Иммуногистохимическое исследование белков Wnt/– катенин сигнального пути в амелобластоме
- Статистический анализ случаев рецидивирования амелобластомы
- Корреляционные взаимосвязи между ядерной локализацией – катенина и показателем пролиферативной активности, количеством SOX2, наличием рецидива
Введение к работе
Актуальность работы.
Амелобластома – доброкачественная опухоль, имеющая одонтогенное
происхождение, по гистологическому строению схожая с эмалевым органом
зуба. Наиболее частая локализация опухоли – это область угла нижней
челюсти. Для амелобластомы характерно разнообразное клиническое течение
с высокой и низкой вероятностью развития рецидива (50 – 90%) [Калакуцкий
Н.В. с соавт., 2012; Dandriyal R. et al., 2011; Laborde A. et al., 2017]. В то же
время отсутствие метастазов позволяет предположить, что она занимает
промежуточное положение между доброкачественными и злокачественными
опухолями, а тип ее роста можно отнести к местнодеструирующему. На
рентгенологическом снимке опухоль представляет собой однокамерное или
многокамерное образование. Достаточно часто амелобластому
обнаруживают на рентгеновском снимке случайно [Калакуцкий Н.В. с соавт., 2012; Chae M.P. et al., 2015].
Установлено, что основным методом лечения амелобластомы на сегодняшний день является хирургический – кюретаж или резекция челюсти. [Ony N.R. et al., 2012; Catunda I.S. et al., 2013]. Однако объем оперативного вмешательства определяется лечащим врачом и в большинстве случаев выбор метода лечения основывается на размерах опухоли. Следует признать, что четких показаний к выбору метода оперативного вмешательства в зависимости от морфологического типа опухоли не описано. В настоящее время при исследовании операционного и биопсийного материала трудно обойтись без проведения иммуногистохимического исследования, так как оно является высокоинформативным и во многих случаях позволяет определять прогноз заболевания [Khalil E. et al., 2015; Семкин В.А., Бабиченко И.И., 2017].
В настоящее время отсутствуют четкие критерии, позволяющие
прогнозировать развитие рецидива. Основываясь на современных
молекулярных морфологических методиках, актуальным является выявление молекулярных механизмов рецидивирования, формирования и роста амелобластомы и разработка соответствующих методов лечения. В основе одного из возможных механизмов роста амелобластомы может лежать Wnt/–катенин сигнальный путь, который участвует в процессах онкогенеза большинства опухолей: рака толстой кишки, рака предстательной железы, различных вариантов рака щитовидной железы, гепатоцеллюлярного рака. По данным литературы в настоящее время исследований и рекомендаций к лечению амелобластом с помощью препаратов, блокирующих активацию Wnt/–катенин сигнального пути нет.
Степень разработанности темы.
Исследования амелобластомы, проводимые в настоящее время на молекулярном уровне немногочисленны. В зарубежной литературе большое
внимание уделено выяснению факторов, которые могут лежать в основе формирования амелобластомы. В классификации ВОЗ 2017 года приводятся данные о том, что этиопатогенез амелобластомы связан с повторяющимися соматическими мутациями в сигнальных путях митоген-активированной протеинкиназы (MAPK) и Hedgehog пути [Kurppa K.J et al., 2014, Sweeney R.T. et al, 2014, Brown N.A.et al., 2014, Soluk-Tekkein M. et al., 2018, El-Naggar A.K. et al., 2017].
Интерес к этим сигнальным путям связан с тем, что они являются активными
во время развития зубов [Dassule H.R. et al., 2000, Heikinheimo K. et al., 2002,
Kumamoto H. еt al., 2004], а мутации в компонентах MAPK (BRAF, KRAS и
FGFR2) были выявлены как в доброкачественных [Pereira N.B. et al., 2016],
так и в злокачественных одонтогенных опухолях [Davies H., 2002, Wright
J.M. et al., 2017]. В свою очередь, активный на нескольких стадиях
морфогенеза зуба Wnt/–катенин сигнальный путь [Liu F., 2008] скорее
всего, может участвовать в формировании амелобластомы. Wnt/–катенин
сигнальный путь играет роль в механизмах роста, пролиферативной
активности и дифференцировки клеток, а также в поддержании
плюрипотентного состояния стволовых клеток, в том числе эмбриональных
[Nusse R., 2008; Dravid G. et al., 2005; Гребенникова Т.А. c соавт., 2016].
Ключевой молекулой канонического сигнального пути является
стабилизированный –катенин, вызывающий устойчивую передачу сигналов
Wnt сигналов [Jrvinen E. et al., 2006], дисбаланс в структуре передачи
сигнала, связанных с –катенином может привести к развитию опухоли
[Valenta T. et al., 2012]. Учитывая гистогенез амелобластомы, исследование
передачи сигналов в каноническом Wnt пути изучают на ранних стадиях
развития зуба [Zhu X. et al., 2013; Yuan G. et al., 2015; Jrvinen E. et al., 2006].
Wnt/–катенин сигнальный путь активен на нескольких стадиях морфогенеза
зуба, поэтому должен быть жестко регламентирован для нормального
развития зубов [Liu F., 2008]. В патогенезе амелобластомы отводят
положительную роль белку –катенину, и отрицательную – белкам-
ингибиторам сигнального пути: APC, GSK–3 и AXIN [Wei Z. et al., 2013].
Лиганд Wnt–1, известен как фактор, играющий важную роль в развитии зуба.
Wnt–1 выявляется в эмалевом узелке и, вероятно, является центральным
регулятором развития зубов [Liu F. et al., 2008]. Wnt/–катенин сигнальный
путь активен на нескольких стадиях морфогенеза зуба [Liu F., 2008] и, скорее
всего, может участвовать в формировании амелобластомы. В литературных
источниках, при изучении механизмов одонтогенеза большое значение
уделено маркеру клеток, обладающих плюрипотентными свойствами SOX2+.
SOX2 выявляется в клетках–предшественниках зуба [Juuri E. et al., 2013].
Некоторые ученые рекомендуют при использовании
иммуногистохимического метода диагностики амелобластом использовать сочетание маркеров SOX2 и Ki–67 для выявления наиболее сложных случаев [Lei Y. et al., 2014]. Маркер Ki–67 применяется в иммуногистохимическом исследовании амелобластом для оценки пролиферативной активности клеток
и прогноза заболевания [Бабиченко И.И. и соавт., 2013; Tekkesin M. S. et al., 2012; Abdel-Aziz A. et al., 2012; Nafarzadeh S. et al., 2013; Bologna-Molina R. et al., 2013; Carren-Burciaga R.G. et al., 2015]. До настоящего времени для разработки таргентной терапии амелобластомы остаётся актуальным поиск ингибиторов сигнальных путей, участвующих в её формировании, одним из которых может являться канонический Wnt/–катенин сигнальный путь.
Цель исследования:
Изучить роль канонического Wnt/–катенин сигнального пути в
формировании и особенностях клинического течения различных
морфологических типов амелобластомы
Задачи исследования:
1. Определить клинические особенности пациентов с амелобластомами,
связанные с формированием рецидивов.
2. Изучить распределение основных компонентов Wnt/–катенин
сигнального пути в эпителии зубного зачатка, фолликулярной кисте и
различных морфологических типах амелобластомы.
3. Изучить взаимосвязь активности Wnt/–катенин сигнального пути с
пролиферативной активностью клеток амелобластомы по белку Ki–67.
4. Установить взаимосвязь между активностью Wnt/–катенин сигнального
пути и наличием плюрипотентных стволовых клеток SOX2+ в
амелобластоме.
5. Установить роль Wnt/–катенин сигнального пути в формировании
рецидивов амелобластомы.
Научная новизна:
Впервые показано наличие основных элементов Wnt– сигнального пути в различных морфологических типах амелобластомы.
Впервые выявлены, положительные корреляционные связи между внутриядерной локализацией –катенина в клетках амелобластомы с их пролиферативной активностью Ki–67, и наличием плюрипотентных клеток SOX2.
Впервые иммуногистохимическим методом показано, что ядерная локализация –катенина в клетках характеризует агрессивное клиническое течение различных морфологических типов амелобластомы и формирование рецидивов.
Теоретическая и практическая значимость
Проведенное исследование доказывает участие канонического Wnt/–
катенин сигнального пути в механизмах формирования и роста
амелобластомы. Полученные результаты позволяют прогнозировать
клиническое течение амелобластомы и выявить наиболее агрессивные морфологические типы, к которым следует отнести плексиформный и базальноклеточный. Результаты исследования позволяют прогнозировать
развитие рецидивов амелобластомы и содержат рекомендации к выбору тактики лечения амелобластомы различных морфологических типов. Полученные данные раскрывают перспективы лечения агрессивных форм амелобластомы с использованием препаратов, блокирующих Wnt– сигнальный путь.
Методология и методы исследования
Выборка настоящего исследования состояла из 76 случаев
амелобластомы из архива лаборатории патологической анатомии ФГБУ
«ЦНИИС и ЧЛХ» за 1997 – 2017 годы. Образцы подвергали стандартной
обработке для гистологического исследования. В настоящем исследовании
иммуногистохимическим методом были изучены корреляционные
взаимоотношения между наличием рецидивов, клиническими и
морфологическими показателями, к последним относились морфологический тип амелобластомы, пролиферативная активность клеток, наличие плюрипотентных стволовых клеток и локализация основного эффекторного белка Wnt–сигнального пути – –катенина.
Положения, выносимые на защиту:
-
Установлено, что в основе формирования амелобластомы принимает участие каскад молекул канонического Wnt– сигнального пути.
-
Установлено, что базальноклеточный тип амелобластомы, для которого характерна ядерная локализация –катенина является клинически агрессивным морфологическим типом амелобластомы.
-
Доказано, что между ядерной локализацией в клетках амелобластомы –катенина, наличием плюрипотентных стволовых клеток (SOX2) и пролиферативной активностью опухолевых клеток (Ki–67) существует достоверная умеренная положительная корреляционная связь.
-
Установлено, что между ядерной локализацией –катенина в клетках амелобластомы и формированием рецидивов опухоли существует достоверная умеренная положительная корреляционная связь.
Степень достоверности
Результаты исследования получены на большом клиническом материале 76-ти случаев амелобластомы за период с 1997 по 2017 годы. Обработка клинического материала проведена с использованием современного иммуногистохимического метода в автоматическом режиме на аппарате Autostainer 360 фирмы Thermo Fisher Scientific (USA). Препараты исследовали под микроскопом (Axioplan 2 imaging, Karl Zeis) с фотофиксацией (AxioCam ERc 5s). Статистическая обработка выполнена с применением непараметрических методов программного обеспечения Statistica 10.0.
Апробация работы
Основные положения работы доложены на: Международной научной конференции «SCIENCE HEALTH» 2016 12 – 15 апреля 2016 года; Международной научной конференции «Эволюция научного знания», Россия, Москва (28 – 29 ноября 2016 г.); Научно–практической конференции «Государственная программа профилактики стоматологических заболеваний – основа системы оказания стоматологической помощи» в рамках XVIII Ежегодного научного форума «Стоматология 2016» (7 декабря 2016 г.); Научно–практической конференции «Медицина и фармакология: научные приоритеты ученых» (25 ноября 2016 г., г. Пермь); XIV международной научно–практической конференции «Достижения и проблемы современной науки» (4 декабря 2016 г.); заседании кафедры патологической анатомии Медицинского института ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» (06.03.2018 г.).
Публикации
По результатам диссертационного исследования опубликовано 11 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, из которых одна – в журнале, включенном в БД Scopus и одна в журнале БД Web of Science.
Внедрение результатов исследования:
Полученные Н.С. Цимбалист данные позволяют выделить критерии, характерные для морфологических типов амелобластомы с агрессивным клиническим течением, что способствует более эффективно решать задачи по составлению прогноза развития рецидива и определения сроков реконструктивно–восстановительной операции. Результаты диссертационной работы Н.С Цимбалист в 2016–2018г. внедрены в работу лаборатории патологической анатомии ФГБУ «ЦНИИС и ЧЛХ» Минздрава России.
Полученные результаты диссертационной работы Н.С Цимбалист в 2016–2017 уч.г. внедрены в учебный процесс кафедры патологической анатомии медицинского института ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» и используются преподавателями кафедры на лабораторных занятиях при изучении студентами 3 курса дисциплин «Патологическая анатомия» и «Патологическая анатомия головы и шеи».
Объем и структура работы
Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста. Включает введение, обзор литературы, материал и методы исследования, результаты исследования, обсуждение и заключение, выводы, практические рекомендации, список сокращений и условных обозначений, 51 рисунок, 7 таблиц, список литературы содержит – 141 библиографических источников, из них российских – 23 и зарубежных – 118.
Лечение амелобластомы
По настоящее время лечение амелобластомы остается преимущественно хирургическим [Milman T., 2016]. Эффективных, разрешенных для применения в клинике химиотерапевтических препаратов для лечения амелобластом в Standard Treatment Guidelines – 2014 не выявлено. Радиотерапия амелобластом не нашла широкого применения в лечении ввиду множества побочных эффектов, таких как постлучевая саркома, остеорадионекроз и патологический перелом [Kim S.G. et al., 2001]. Хирургическое лечение амелобластом делят на две большие группы – консервативное (кюретаж) – включающее в себя вылущивание, марсупиализацию, выскабливание, в том числе в сочетании с прижиганием химическим раствором Карной или криотерапией на область кости и радикальное, под которым подразумевается краевая, сегментарная резекция челюсти и гемимандибулоэктомия. [Vedtofte P. et al., 1978; Ghandhi D. et al., 2006; Ony N.N., 2012; Catunda I.S. et al., 2013].
Консервативный подход в хирургическом лечении имеет ряд преимуществ – требует минимальных затрат времени и технического оснащения, сохраняет целостность костей, однако, в литературных источниках имеется колоссальное количество сообщений о возникновении рецидивов с большей частотой, чем при радикальных операциях. Предположительная причина возникновения рецидива – остающиеся отростки опухоли в кости после ее удаления при первичном хирургическом лечении. [Cranin A.N. et al., 1987]. При проведении цистотомии рецидив амелобластомы возникает в 90 – 100% случаев из–за внедрения опухолевых элементов в окружающие ткани на 0,5 – 1,0 см [Калакуцкий Н.В. с соавт., 2012].
Частота рецидивов, которую приводит A. Laborde, при анализе случаев за 22 года, при консервативном лечении составила 50 – 90%, что намного превышает показатель при радикальной операции – 9,1% [Laborde A. et al., 2017].
По данным исследования в университете Неаполя за период 1989 – 1999 частота возникновения рецидива при консервативном лечении достигала 55– 90%, тогда как при радикальном лечении процент рецидива значительно ниже, однако операции отягощаются снижением качества жизни пациентов в случае нарушения функции жевания и с возникающими косметическими дефектами [Sammartino G. et al., 2007]. К осложнениям операции относят патологический перелом, инфицирование, остеорадионекроз (если использовалась радиотерапия) [Sammartino G. et al., 2007; Chukwuneke F.N. et al., 2010]. Особый интерес вызывает тенденция амелобластомы к рецидивированию: остается открытым вопрос о точной причине возникновения рецидива, кроме вида произведенной операции – по мнению одних авторов речь идет о глубокой инвазии опухоли в кость, других – о необходимости учитывать особенности гистологического строения амелобластомы в каждом случае. Упоминания о поисках объяснения появления рецидива в литературе отмечены с 1976 г. I. Smith информирует о сложности оценки степени инвазии опухоли при ее удалении, а также о проведении хирургического лечения амелобластом только после микроскопической верификации диагноза [Smith I., 1976]. Возникновение рецидивов отмечают с интервалом в 7,2 года с медианой в 5 лет, с максимумом через 33 года [Reichart P.A. et al., 1995]. Более 50% всех рецидивов возникают в течение первых 5 лет после хирургического вмешательства. При этом, заметной разницы между частотой рецидивов при радикальном лечении и консервативным не выявлено, однако, время возникновения рецидива после радикального вмешательства составило 11,1 лет по сравнению с 4,8 лет при консервативном лечении (кюретаже). По данным трудов H.P. Philipsen рецидивы амелобластомы возникают не из-за агрессивного характера опухоли, а свидетельствуют о неполном удалении исходного очага [Philipsen H.P. et al., 2001]. Подобные заключения приводит и G. Sammartino о диагностике рецидивов амелобластомы в течение первых 5 лет после первичной операции [Sammartino G. et al., 2007]. В 2011 R. Dandriyal сообщает о рецидивах опухоли в послеоперационном периоде – 60% после проведения кюретажа и 10 % – после радикальной операции (резекции челюсти) [Dandriyal R. et al., 2011].
Учитывая вероятность развития рецидива у пациентов, ученые рекомендуют обязательное ежегодное наблюдение за больными после лечения продолжительностью 5 лет, а затем каждые 2 года в течение 25 лет [Suma M.S. et al., 2013]. По данным работ отечественных ученых при проведении цистотомии рецидив амелобластомы возникает в 90–100% случаев из–за внедрения опухолевых элементов в окружающие ткани на 0,5–1,0 см [Калакуцкий Н.В. с соавт., 2012]. Таким образом, долговременное наблюдение пациентов после лечения необходимо, так как в литературе есть данные о спорадических случаях возникновения заболевания спустя 20, 30 и 45 лет после оперативных вмешательств [Chae M.P. et al., 2015].
С целью снижения риска рецидива амелобластомы в послеоперационном периоде, некоторые авторы рекомендуют проводить резекцию челюсти с отступом, выходящим за пределы рентгенологических границ роста опухоли [Becelli R. et al, 2011]. Рекомендация Американской ассоциации челюстно–лицевых хирургов к границам резекции – запас в 1,0 см за пределами видимой границы роста [Vayvada H. et al., 2006]. По мнению других авторов, величина отступа зависит от морфологического строения опухоли [Suma M.S. et al., 2013]. Для гарантии удаления «дочерних микрокист» солидной и мультикистозной амелобластомы рекомендован отступ в 1,5–2,0 см выше границ, определяемых рентгенологически. Выбор операции также зависит от морфологического типа – при фолликулярной и плексиформной амелобластоме предлагают проводить радикальную операцию с запасом 1,5 и 3,0 см, а для монокистозного типа выбрать консервативную тактику [Gardner D.G. et al.,1980; Frana L.J. et al., 2012].
В настоящее время большое внимание уделяется также технике проведения оперативных вмешательств – постоянно ведутся поиски новых методов и алгоритмов операций. В отечественной литературе описаны случаи успешного восстановления нормальной структуры костной ткани после операций по поводу амелобластом по типу расширенной биопсии с краевой резекцией [Сёмкин В. А. c соавт., 2012]. Разработаны методы проведения сложных реконструктивно – восстановительных операций с использованием аутотрансплантатов и применением ВМТ технологий, производимых одномоментно с резекцией челюсти у больных с амелобластомой [Буцан С.Б. c соавт., 2013]. За рубежом также вполне успешно проводятся реконструктивные операции с использованием микрососудистой техники для наложения сосудистых анастомозов при использовании костного аутотрансплантата малоберцовой кости, ребра, лопатки, гребня подвздошной кости, более подходящего для точной реконструкции из-за его естественной кривизны [Dandriyal R. et al., 2011; Nkenke E., 2013]. Ассоциация пластических хирургов сообщила о 96% из 26 пациентов довольных своим внешним видом после проведения реконструктивных операций после резекции челюсти [Ooi A. et al., 2014]. Созданный при помощи стереолитографической техники, применение которой ведется с начала 1990–х годов, шаблон, может послужить биомоделью для изготовления индивидуального титанового эндопротеза, а в последующем и высокоточной анатомической ориентации протеза на месте дефекта после удаления опухоли, что поможет избежать косметические и функциональные проблемы в послеоперационном периоде [Lee J.W. et al., 2007; Кириченко Е. Н., 2014; Медведев Ю. с соавт, 2012].
Выбор тактики хирургического лечения амелобластомы является объектом дискуссии в связи с отсутствием общепринятых стандартов. Это связано с разнообразным клиническим течением опухоли, с полиморфизмом структуры и тенденциям к многократным рецидивам даже после радикальных операций.
Так, в отечественной литературе имеются множество сообщений о необходимости патоморфологической верификации диагноза у пациентов для выбора алгоритма лечения [Калакуцкий Н.В. с соавт., 2012], а также на необходимость проведения иммуногистохимического исследования для прогноза опухолевого роста и выбора хирургической тактики для каждого отдельного случая [Сёмкин В.А. с соавт., 2012].
В зарубежных источниках акцентируют на зависимость хирургической тактики от размеров очага поражения, типа, локализации амелобластомы и состояния пациента [Frana L.J. et al., в 2012]. Также указывают на выбор лечебной тактики в зависимости от гистологического исследования [Escande C. et al., 2009; Chacko V. et al., 2011; Laborde A. et al., 2017]. Возраст пациента выделяют также как еще один фактор влияния, касающийся выбора терапии: пациентам пожилого возраста не обязательно проводить радикальную операцию [Reichart P.A. et al.,1995]. В настоящее время высказывается надежда, что понимание молекулярных механизмов роста одонтогенных опухолей, в том числе амелобластомы, поможет спрогнозировать их течение и приведет к разработке новых терапевтических концепций для лечения. Активно ведется поиск молекулярных и генетических изменений, связанных с развитием и прогрессированием одонтогенных опухолей: онкогенов, онковирусов, генов опухолевых супрессоров, факторов роста и апоптоза, регуляторов клеточного цикла. Большое внимание уделяется изучению механизмам развития зубов, изучению белков и молекул клеточной адгезии и цитокинов [Kumamoto H., 2006].
Иммуногистохимическое исследование белков Wnt/– катенин сигнального пути в амелобластоме
Основными компонентами Wnt/–катенин сигнального пути являются лиганд Wnt–1, сигнал с которого передается на рецепторный белок Frizzled, расположенный на цитоплазматической мембране и эффекторный белок – катенин, который в активной фазе не подвергающийся деградации, осуществляет передачу сигнала в ядро клетки с последующим запуском транскрипции. Wnt/– катенин сигнальный путь был рассмотрен в различных морфологических типах амелобластомы. С образцами амелобластомы было проведено иммуногистохимическое исследование с антителами к белкам Wnt–1, Frizzled–8, –катенин, Lef–1, которые являются компонентами Wnt/–катенин сигнального пути.
В плексиформном типе амелобластомы наблюдалась положительная реакция с белками Frizzled, выполняющими рецепторную функцию в сигнальном пути. На рисунке 10 видно окрашивание цитоплазмы клеток в коричневый цвет.
Wnt–1 был также определен в плексиформном и фолликулярном типе и имел цитоплазматическую локализацию (Рисунки 11 и 12). В зернистоклеточном типе Wnt/–катенин сигнальный путь активен как в центральной части – в зернистых клетках, так и в периферической. На рисунке 13 предствлен зернистоклеточный тип амелобластомы с Frizzled, с хорошо выраженной реакцией в зернистом компоненте и на рисунке 14 реакция с Wnt–1.
Wnt/–катенин сигнальный путь также активен в акантоматозном, базальноклеточном, десмопластическом и периферическом типе. Реакция с белками Frizzled представлена на Рисунках 15,16 и 17.
При сохранении –катенина в цитоплазме сигнал передается к факторам транскрипции Tcf/Lef–1. Маркер транскрипционного фактора Lef–1 был также визуализирован в ядрах клеток амелоблатомы.
На рисунке 18 представлена выраженная иммуногистохимическая реакция с Lef–1 при плексиформном типе амелобластомы, яркая коричневая окраска ядер в центральной и периферической части анастомозирующих тяжей эпителиального компонента. В фолликулярном типе (Рисунок 19) как в центральной, так и в периферической части отровков отмечается единичная положительная реакция с маркером, что может указывать на слабую активность сигнального пути. В зернистоклеточном типе (Рисунок 20) яркая окраска ядер наблюдается в периферической части островков, в зернистоклеточном компоненте окрашивание ядер единично или отсутствует. На Рисунке 21 микрофотография иммуногистохимической реакции с Lef–1 при акантоматозном типе: окрашивание ядер равномерно отмечается в центре островков и в периферической части в клетках с вытянутыми ядрами. При базальноклеточном типе амелобластомы на рисунке 22 отмечается положительная реакция практически во всех ядрах клеток, однако, окраска неяркая. В монокистозном (Рисунок 23), десмопластическом (Рисунок 24) и периферическом (Рисунок 25) типе положительная иммуногистохимическая реакция с Lef–1 отмечалась в отдельных ядрах клеток опухоли.
Во всех исследованных морфологических типах амелобластомы были выявлены белки Wnt–1, Frizzled, -катенин, Lef–1, что свидетельствует об участии Wnt/- катенин сигнального пути в метаболизме клеток амелобластомы.
Статистический анализ случаев рецидивирования амелобластомы
Из 76 амелобластом настоящего исследования в 49 случаях отмечался рецидив заболевания, что составило 64,5%. Средний возраст больных с рецидивом амелобластомы составил 46,6 ± 15,3 лет, а с отсутствием рецидива – 46,9 ± 17,6, что соответствует среднему возрастному периоду. По критерию Манна–Уитни установлено, что средний возраст больных статистически значимо не различался между больными с наличием и отсутствием рецидива (р=0,938), что свидетельствует об однородности выборки. Из 76 пациентов 36 были мужского пола и 40–женского. Рецидив наблюдался у 24 пациентов – мужчин и 25 пациентов–женщин, данные представлены в таблице 1 и были проанализированы с помощью критерия 2, который показал статистически незначимые различия.
Как было показано в разделе 3.1, количество случаев амелобластомы с локализацией в верхней челюсти составило 8, в нижней челюсти – 65, и, периферической –3 случая. Из них в 7 случаях с локализацией опухоли в верхней челюсти были рецидивы (87,5%), 42 случая– в нижней челюсти (64,6%). Рецидивов периферической амелобластомы в настоящей выборке не отмечено.
Операции, проводимые пациентам можно было разделить на две большие группы. К первой группе относят ограниченную резекцию, включающую такие оперативные вмешательства, как расширенная биопсия, краевая резекция челюсти, цистэктомия с резекцией корней зубов, резекцию альвеолярного отростка челюсти. Ко второй группе относят радикальную резекцию челюсти, которую проводят одномоментно с замещением дефекта аутотрансплантатом из малоберцовой или гребешка подвздошной кости с применением титанового эндопротеза и нередко с экзартикуляцией. К радикальной резекции также относится гемимандибулоэктомия и мандибулоэктомия при обширных поражениях.
В сводной таблице (Таблица 2) представлены оперативные вмешательства, проведенные пациентам до момента рецидива. Из таблицы видно, что после операции в объеме резекции челюсти амелобластома рецидивировала только в 6 случаях, тогда как при проведении ограниченной резекции в 43 случаях. При анализе данных по критерию Хи–квадрат были получены достоверные отличия.
Прежде всего следует отметить, что ЦНИИС и ЧЛХ является головной организацией Минздрава РФ в области ЧЛХ и в него поступают пациенты из различных регионов страны для дальнейшего лечения после выявления рецидива амелобластомы.
В амелобластомах различных морфологических типов была рассмотрена также частота встречаемости рецидива [Цимбалист Н.С. с соавт, 2017]. Количество случаев амелобластом с рецидивом и без него представлены по каждому морфологическому типу в таблице (Таблица 3)
На диаграмме (Рисунок 47) показано, что большее количество рецидивов встречались в случаях с базальноклеточным (Б) типом амелобластомы (75,0%), плексиформным (П) (75,0%), фолликулярным (Ф) (77,8%). Рецидивы также отмечены в монокистозном (М) (33,3%), акантоматозном (А) (67,0%) и зернистоклеточном (З) типе (60,0%). Исключения составили десмопластический (Д) и периферический (Пе) тип амелобластомы, в которых рецидивов отмечено не было.
В настоящем исследовании были проведены иммуногистохимические исследования с антигенами к белку Ki–67 и белку SOX2 [Бабиченко И.И. с соавт., 2017 (а), Бабиченко И.И. с соавт., 2018 (б)]. Уровни пролиферативной активности и количество плюрипотентных стволовых клеток были подсчитаны соответственно морфологическому типу амелобластомы. В плексиформном типе уровень пролиферативной активности достиг медианы 6,5 с нижним квартилем 4,5 и верхним 10,0, в фолликулярном 4,5 (1,0; 8,0), зернистоклеточном 3,0 (1,0; 4,0), акантоматозном 10,0 (2,0; 15,0), в базальноклеточной отмечались самые высокие показатели 21,0 (12,0; 25,0), в монокистозном 2,0 (1,0; 2,0), десмопластическом 5,0 (2,0; 10,0), в периферическом 1,0 (0,0; 4,0). Количество плюрипотентных стволовых клеток было неравномерным в различных морфологических типах опухоли: медиана уровня SOX2 в плексиформном типе составила 10,0, с нижним квартилем 0,0 и верхним 30, 0; в фолликулярном отмечалась отрицательная реакция по SOX2 0,0 (0,0;0,0), в акантоматозном 2,0 (0,0;60,0), в базальноклеточном показатели были высокими 55,0 (28,0 ;87,5), в монокистозном 6,0 (0,0;10,0), в десмопластическом отмечались несмотря на отсутствие рецидивов высокие показатели 90,0 (30,0; 95,0), а для периферического типа была отмечена отрицательная реакция 0,0 (0,0;0,0).
В амелобластомах с высокими уровнями SOX2 и высокой пролиферативной активностью отмечалась преимущественно ядерная локализация –катенина. Проведенный анализ между уровнями маркеров SOX2, Ki–67 и ядерной и внеядерной локализацией – катенина показал достоверные различия.
На диаграмме (Рисунок 48) показаны медианы, верхний и нижний квартили, а также минимальные и максимальные значения уровня SOX2 в амелобластомах. С помощью U критерия Манн– Уитни был проведен анализ распределения плюрипотентных стволовых клеток (SOX2+) в зависимости от внеядерной и ядерной локализации –катенина в амелобластомах, который показал наличие статистически значимых различий (U=409,0; p=0,006). На диаграмме (Рисунок 49) показаны медианы, верхний и нижний квартили, а также минимальные и максимальные значения уровня Ki–67 в амелобластомах.
С помощью U критерия Манн–Уитни был проведен анализ распределения пролиферирующих клеток (Ki–67+) в зависимости от внеядерной (1) и ядерной (2) локлизации –катенина в амелобластомах, который показал наличие статистически значимых различий (U=399,0; p=0,005).
Как показано на диаграммах, ядерная локализация – катенина отмечалась в случаях с большим количеством SOX2 и в случаях с высокой пролиферативной активностью опухоли.
Во всех 76 амелобластомах без исключения, как показали результаты проведенного ИГХ–исследования, был обнаружен –катенин. Данный факт подтверждает, что Wnt–сигнальный путь в амелобластоме активен. Однако, распределение –катенина в клеточных структурах было неравномерным, как показано в разделе микроскопия– его скопление можно было наблюдать как в ядрах клеток, так и во внеядерных структурах– в цитоплазме и на мембране. Была рассмотрена взаимосвязь ядерной и внеядерной локализации – катенина в клетках амелобластомы с различными показателями – такими как пол и возраст пациентов, с уровнем маркера пролиферативной активности Ki–67 и маркера клеток с плюрипотентными свойствами SOX2, наличие рецидива в различных морфологических типах амелобластомы.
Wnt/–катенин сигнальный путь был активен во всех 8 морфологических типах. Тем не менее, для каждого типа были характерны свои особенности распределения –катенина в клеточных структурах [Бабиченко И.И. с соавт, 2018 (в)]. В амелобластомах различных морфологических типов распределение – катенина наблюдалось как в ядрах клеток, так и вне ядра, результаты подсчетов представлены в таблице (Таблица 4) и отображены на диаграмме (Рисунок 50).
Преимущественно ядерная локализация (в 100% случаев) – катенина (на фоне цитоплазматической) отмечена в базальноклеточном и десмопластическом типе, исключительно внеядерная отмечена в периферической амелобластоме. В остальных морфологических типах отмечена как ядерная, так и внеядерная локализация –катенина: в плексиформном типе частота ядерной локализации составила 54%, в фолликулярном– 55%, в зернистоклеточном– 80%, в акантоматозном 55%, в монокистозном – ядерная 83%.
Корреляционные взаимосвязи между ядерной локализацией – катенина и показателем пролиферативной активности, количеством SOX2, наличием рецидива
Наличие взаимосвязей между ядерной локализацией –катенина и показателем пролиферативной активности, количеством SOX2, наличием рецидива было определено с помощью корреляционного анализа по Спирмену, результаты которого показаны в таблице 6.
Между индексом пролиферативной активности Ki–67 и ядерной локализацией –катенина прослеживается положительная умеренная корреляционная связь r= 0,312, и статистически значимая p=0,006. Между количеством SOX2+ и ядерной локализацией –катенина также прослеживается положительная умеренная и статистически значимая корреляционная связь r=0,312, p=0,006. Между наличием рецидива и ядерной локализацией –катенина прослеживается положительная умереная корреляционная связь r=0,332, что является статистически значимым p=0,004.
В таблице 7 представлены сводные данные по количеству случаев, в которых были выявлены рецидивы из общего числа случаев (76 амелобластом) и в которых была отмечена ядерная локализация маркера –катенина. Данные свидетельствуют о том, что распределение – катенина различно в зависимости от того первичное это заболевание или рецидив.
Графически, на диаграмме (Рисунок 51) показано, что в случаях первичного заболевания частота внеядерной локализации –катенина (59,3%) была значительно выше, чем ядерной (24,5%), напротив, в случаях с рецидивом выявлена высокая частота ядерной локализации –катенина (75,5%) и низкая внеядерной (40,7%).
Под термином «рецидив» (лат. recidivus– возвращающийся) подразумевается возобновление клинических симптомов заболевания после того, как выздоровление представлялось полным. Амелобластома– не исключение. Несмотря на то, что опухоль относят к доброкачественным, она отличается высоким процентом рецидивов, в том числе многократных, что в конечном итоге приводит к снижению качества жизни пациентов. По настоящее время вопрос возникновения рецидива амелобластомы, как после ограниченной резекции, так и после радикальной операции, занимает одно из центральных положений в хирургической стоматологии. Хирургический метод– единственный, который применяется в современной практике для лечения амелобластомы. В настоящем исследовании для определения механизмов роста и развития амелобластомы мы провели иммуногистохимическое исследование, для изучения распределения основных белков Wnt/–катенин сигнального пути– Wnt–1, Frizzled, –катенин в различных морфологических типах амелобластомы. Также была исследована пролиферативная активность клеток амелобластомы и количество плюрипотентных стволовых клеток.
Прежде чем перейти к обсуждению результатов исследования Wnt– сигнального пути в амелобластоме, приведем некоторые общие характеристики настоящей выборки и сравним показатели с литературными данными. В нашем исследовании из 76 случаев в 10% опухоль локализовалась на верхней челюсти и в 86% случаев– обнаруживалась на нижней челюсти, и в 4% была диагностирована периферическая амелобластома, для которой не характерно прорастание костей челюсти. Сходную частоту встречаемости приводят и C. More [2012] – в 78.57% диагностировали амелобластому нижней челюсти, и в 14.28% – на верхней челюсти.
В настоящем исследовании средний возраст пациентов женского пола составил 44,4 ± 16,5 лет, мужчин – 49,3 ± 15,8 лет, что несколько выше, чем в работе A. Florescu et al., [2012] – 39,2 года и L.J. Frana et al., [2012], где указанный средний возраст составляет 35–45 лет. Такое различие можно обьяснить тем, что на базе настоящего исследования, амелобластомы удаляли часто уже не как опухоль, возникшую впервые, а как случаи с рецидивом, то есть средний возраст применим ко всей выборке настоящего исследования вне зависимости от того было заболевание первичным или повторным.
По данным Nagao Y. et al., [1999] фолликулярный подтип наряду с плексиформным являются наиболее распространенными типами и часто рецидивирующими. В нашем исследовании по частоте встречаемости морфологических типов также выделяются плексиформный и фолликулярный типы, их доля в выборке была выше остальных типов и составила 31,6% и 23,7% случаев соответственно. Доля остальных типов в общей выборке составила для зернистоклеточного 6,7%–, 11,8%– для акантоматозного, 10,5% – базальноклеточного 7,7%– монокистозного, 4%– десмопластического и 4% периферического.
В гистогенезе амелобластомы формируются из зубного зачатка и из одонтогенных кист, в частности, зубосодержащей кисты [Meleti M., 2013, Kumamoto H., 2006, Juuri E., 2013], это подтверждают и наши исследования, в которых показано, что и в зачатке зуба и в фолликулярной кисте и в амелобластоме наблюдается активация Wnt/–катенин сигнального пути: так, в зачатке зуба отмечается внеядерное распределение –катенина в цитоплазме одонтобластов, мембране и в области ядерной оболочки, а также в ядрах как адамантобластов, так и одонтобластов, а в фолликулярной кисте положительная иммуногистохимическая реакция была отмечена в ядрах, мембране и цитоплазме клеток базального слоя эпителия, а в остальных слоях на мембране и цитоплазме клеток.