Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Роль цитостатической терапии в лечении гемобластозов 14
1.1.1. Механизмы действия цитостатических препаратов, входящих в схему CHOP 15
1.2. Механизмы множественной лекарственной устойчивости опухолей 19
1.2.1. Роль Р-гликопротеина в формировании множественной лекарственной устойчивости 20
1.2.2. Роль нарушения апоптоза в развитии множественной лекарственной устойчивости 25
1.3. Токсическое поражение органов цитостатиками при терапии опухолевого процесса 32
1.4. Токсическое поражение печени противоопухолевыми препаратами 37
1.5. Роль лекарственных транспортеров в защите печени от токсического повреждения 43
Глава 2. Материалы и методы 48
2.1. Лабораторные животные и опухолевые модели 48
2.1.1. Описание исходных субштаммов лимфосарком LS и RLS 48
2.1 .2. Селекция высокорезистентной клеточной линии RLS40 49
2.2. Экспериментальная часть 51
2.2.1. Проведение полихимиотерапии по схеме CHOP мышам с лимфосаркомой RLS40 51
2.2.1.1. Экспериментальная модель №1 51
2.2.1.2. Экспериментальная модель №2 53
2.3. Материалы, использованные в работе 56
2.3.1. Реактивы и препараты 56
2.3.2. Оборудование 56
2.3.3. Буферы, использованные в работе 57
2.3.4. Олигонуклеотиды 58
2.4. Методы, использованные в работе 59
2.4.1. Оценка эффективности ПХТ 59
2.4.2. Морфологические методы исследования 59
2.4.3. Молекулярно-биологические методы исследования 61
2.4.3.1. Получение первичной культуры клеток из солидной опухоли 61
2.4.3.2. Выделение суммарной клеточной РНК 62
2.4.3.3. Определение уровня экспрессии генов в опухолевых клетках методом ОТ-ПЦР 63
2.4.3.3.1. Обратная транскрипция 63
2.4.3.3.2. ПЦР 63
2.4.3.4. Определение чувствительности опухолевых клеток к цитостатикам (МТТ-тест) 64
2.4.4. Статистический анализ 65
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение 66
3.1. Влияние ПХТ на рост перевиваемой лимфосаркомы мыши RLS4o и продолжительность жизни животных-опухоленосителей 68
3.2. Особенности гистологического строения лимфосаркомы RLS4o в зависимости от числа курсов ПХТ, воздействовавших на опухоль 75
3.3. Исследование чувствительности клеток лимфосаркомы RLS40 к цитостатикам после нескольких курсов ПХТ 87
3.4. Определение уровней экспрессии генов, участвующих в формировании МЛУ, в клетках лимфосаркомы мыши RLS40 после нескольких курсов ПХТ 91
3.5. Исследование экспрессии Р-гликопротеина в клетках лимфосаркомы мыши RLS4o без лечения и при проведении ПХТ 97
3.6. Структурные изменения в печени животных-опухоленосителей при пассировании лимфосаркомы RLS40 без лечения и при проведении ПХТ ... 101
3.6.1. Патоморфологические изменения в печени мышей с лимфосаркомой RLS40 при пассировании опухоли без введения цитостатиков (контрольная группа) 103
3.6.2. Патоморфологические изменения в печени мышей с лимфосаркомой RLS4o при пассировании опухоли с последующим проведением ПХТ (экспериментальная группа) 112
3.7. Структурные изменения в печени при проведении многокурсовой ПХТ мышам без опухоли и с перевиваемой лимфосаркомой RLS40 122
3.7.1. Патоморфологические изменения в печени мышей без опухоли при проведении трех курсов ПХТ 124
3.7.2. Патоморфологические изменения в печени мышей с перевиваемой лимфосаркомой RLS4o при проведении трех курсов ПХТ 129
3.8. Исследование экспрессии Р-гликопротеина в печени мышей с лимфосаркомой RLS40 без лечения и при проведении ПХТ 136
Заключение 144
Выводы 149
Литература 151
- Роль Р-гликопротеина в формировании множественной лекарственной устойчивости
- Проведение полихимиотерапии по схеме CHOP мышам с лимфосаркомой RLS40
- Особенности гистологического строения лимфосаркомы RLS4o в зависимости от числа курсов ПХТ, воздействовавших на опухоль
- Структурные изменения в печени животных-опухоленосителей при пассировании лимфосаркомы RLS40 без лечения и при проведении ПХТ
Введение к работе
Актуальность проблемы. Противоопухолевая терапия гемобластозов (опухолевых заболеваний крови) за последние десятилетия достигла значительных успехов: повысилось число полных ремиссий, увеличилась безрецидивная выживаемость больных, описаны случаи выздоровления (Поспелова Т.И. и др., 2004). Это связано с использованием эффективных программ полихимиотерапии (ПХТ), в которых используются определенные сочетания противоопухолевых препаратов с различным механизмом действия и токсическим профилем (King P., Perry М., 2001), а также с внедрением молекулярно-биологических методов верификации опухолевого клона, что делает возможным проведение направленного лечения (Ляхович В.В. и др., 2004; Имянитов Е.Н., Моисеенко В.М., 2008).
Вместе с тем, имеется ряд проблем, сдерживающих полноценное и максимально эффективное использование программной ПХТ: во-первых, это выраженная токсичность многокурсовой химиотерапии (Sanderson Н. et al., 2004); во-вторых, это формирование в опухоли множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) - приобретение опухолевыми клетками перекрестной резистентности к цитостатикам с разными механизмами действия и внутриклеточными мишенями (Ставровская А.А., 2000). Эти две проблемы могут усугублять друг друга и значительно снижать эффективность лечения.
Резистентность опухолевых клеток к химиотерапии может быть следствием разнообразных процессов: от снижения внутриклеточной концентрации противоопухолевого препарата, обусловленного активным выведением вещества в межклеточную среду АТФ-зависимым трансмембранным белком Р-гликопротеином (P-gp), являющимся продуктом гена MDR1, до нарушения механизмов апоптоза в самих опухолевых клетках (мутация или снижение экспрессии гена р53, нарушающие его
8 проапоптотическую функцию и/или гиперэкспрессия гена bcl-2, вызывающая нечувствительность клеток к индукции апоптоза) (Filipits М., 2004).
Основные механизмы возникновения МЛУ достаточно подробно изучены и описаны в литературе, однако эти обширные знания еще в полной мере не нашли применения в практической онкологии, в частности в лечении гемобластозов - опухолей, для которых цитостатическая терапия является приоритетной. Как правило, течение лейкозов и лимфом характеризуется наличием рецидивов, что предполагает проведение повторных курсов высокодозной полихимиотерапии, осложняющихся прогрессированием и модификацией процессов множественной лекарственной устойчивости, детальные механизмы которых до конца не ясны. Попытка перенести ситуацию, зачастую происходящую в клинике, в экспериментальные условия в определенной степени поможет переосмыслить подходы к терапии гемобластозов.
В настоящее время при лечении лейкозов и лимфом, как правило, используют не один цитостатик, а комбинацию химиотерапевтических агентов. При этом веским аргументом в пользу полихимиотерапии считается возможность суммации терапевтического действия используемых препаратов на опухоль при распределении их токсических эффектов по разным органам и снижении за счет этого общетоксического влияния на организм опухоленосителя (Поддубная И.В., 2002; Гольдберг В.Е., Матяш М.Г., 2004). Исследование фармакокинетики противоопухолевых препаратов свидетельствует о том, что они, как и большинство лекарственных средств, подвергаются биотрансформации в печени с образованием токсических метаболитов, которые могут вызвать повреждение гепатоцитов (Jaeschke Н. et al., 2002). Поражение печени является одним из основных лимитирующих факторов, ограничивающих проведение программной ПХТ в полном объеме, поскольку развитие постцитостатических осложнений в этом органе может быть причиной смертельных исходов у больных в период химиотерапевтического лечения.
В настоящее время в литературе широко представлены экспериментальные исследования, в которых производится однократное введение химиотерапевтических препаратов интактным животным в режиме монотерапии. Тогда как даже стандартный курс ПХТ подразумевает длительное и многократное введение комбинации цитостатических препаратов. При этом встречается мало исследований, в которых бы исследовалось влияние многократного воздействия комплекса цитостатиков на организм не только интактного животного, но и животного с опухолью, обладающей нарастающей резистентностью к химиотерапии.
Все это обуславливает необходимость изучения морфофункциональных изменений в печени при многократном введении комплекса противоопухолевых препаратов при наличии факторов, усугубляющих токсическое влияние ПХТ на печень (например, прогрессирование опухолевого процесса и нарастание резистентности опухоли к цитостатической терапии).
Мембранный транспортер Р-гликопротеин обнаруживается в клетках органов, участвующих в метаболизме и выведении лекарственных препаратов, в том числе и в печени. Изменение в печени экспрессии Р-гликопротеина и соответственно кодирующего его гена MDR1 развивается в ответ на воздействие различных повреждающих факторов: воспаление, эндотоксикоз (Hartmann М. et al., 2001), экзогенные токсические агенты (Fardel О. et al., 1998). Данное обстоятельство может изменять процессы метаболизма и распределения цитостатиков как в самой опухоли, так и в органах и тканях, и, соответственно, влиять на эффективность лечения и токсичность химиотерапии.
Изучение взаимосвязи морфофункциональных изменений в печени и процессов прогрессирования множественной лекарственной устойчивости в опухоли, возникающих после воздействия нескольких курсов ПХТ представляет интерес, как для клинической, так и для экспериментальной
10 медицины. Указанные обстоятельства определили цель и задачи настоящего исследования.
Цель исследования: Изучить особенности патоморфологических изменений в опухоли и печени мышей в условиях прогрессирования множественной лекарственной устойчивости перевиваемой лимфосаркомы RLS40 в процессе полихимиотерапии.
Задачи исследования:
Изучить влияние многокурсовой полихимиотерапии на динамику роста перевиваемой лимфосаркомы мыши RLS40 и продолжительность жизни животных-опухоленосителей.
Исследовать чувствительность клеток перевиваемой лимфосаркомы мыши RLS4o к цитостатикам без лечения и после нескольких курсов полихимиотерапии.
Определить уровни экспрессии генов, участвующих в формировании множественной лекарственной устойчивости (mdrla, mdrlb) и реализации программы апоптоза (р53, bcl-2), в клетках перевиваемой лимфосаркомы мыши RLS4o без лечения и после нескольких курсов полихимиотерапии.
Изучить морфологические изменения и экспрессию Р-гликопротеина в опухоли в зависимости от числа курсов полихимиотерапии.
Сравнить морфологические изменения и уровень экспрессии Р-гликопротеина в печени мышей при проведении многокурсовой полихимиотерапии животным-опухоленосителям и животным без опухолевого процесса.
Изучить морфологические изменения и уровень экспрессии Р-гликопротеина в печени мышей с лимфосаркомой RLS40 без лечения и при проведении полихимиотерапии с использованием различных схем селекции лекарственно-устойчивых опухолевых клонов.
Научная новизна исследования: Впервые показано, что проведение многокурсовой ПХТ сопровождается прогрессированием лекарственной резистентности в клетках мышиной лимфосаркомы RLS40, изначально проявляющей фенотип множественной лекарственной устойчивости, с дополнительным снижением чувствительности опухолевых клеток к доксорубицину и винкристину, нарастанием экспрессии гена mdrlb и увеличением экспрессии Р-гликопротеина на мембране опухолевых клеток.
Доказано, что повторные циклы введения цитостатиков вызывают нарушение механизмов апоптоза в клетках лимфосаркомы RLS4o, выражающееся в снижении объемной плотности опухолевой ткани в состоянии апоптотического распада, гиперэкспрессии гена bcl-2 и изменении уровня экспрессии гена р53.
Впервые выявлено, что клональная селекция клеток опухоли с нарастанием их лекарственной устойчивости обусловливает повышение токсической нагрузки на печень, выражающееся в нарастании деструктивных изменений, снижении процессов репаративной регенерации и увеличении экспрессии Р-гликопротеина на мембране гепатоцитов.
Впервые установлено, что проведение полихимиотерапии вызывает нарастание деструктивных изменений и увеличение уровня Р-гликопротеина в печени у безопухолевых животных, и более значительное - у мышей с лимфосаркомой RLS40 параллельно с нарастанием МЛУ в клетках опухоли.
Научно-практическая значимость работы: Разработаны две экспериментальные модели формирования МЛУ. Достоинством модели с пассированием опухоли является возможность проводить неограниченное количество курсов ПХТ для изучения влияния многократного цитостатического воздействия на клетки опухоли. Преимуществом второй модели с проведением последовательных курсов химиотерапии является ее адекватность естественному процессу развития МЛУ.
Полученные результаты исследования дополнили новыми сведениями генетические механизмы прогрессирования МЛУ в результате воздействия нескольких курсов химиотерапии на опухоль, изначально резистентную к ряду цитостатических препаратов, что нередко встречается при лимфомах высокой степени злокачественности у человека.
Данное исследование выявило морфологические особенности поражения и динамику экспрессии Р-гликопротеина в печени в условиях многокурсовой ПХТ с нарастанием лекарственной резистентности опухоли, что может приводить к изменению процессов метаболизма лекарственных препаратов и должно учитываться при выборе подходов к лечению опухолевого процесса и методов терапии сопровождения.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Проведение повторных курсов полихимиотерапии мышам с перевиваемой лимфосаркомой RLS4o, изначально имеющей фенотип множественной лекарственной устойчивости, сопровождается замедлением регрессии опухолевого узла под действием противоопухолевой терапии, снижением чувствительности опухолевых клеток к цитостатикам, увеличением экспрессии генов, участвующих в формировании множественной лекарственной устойчивости, а также повышением устойчивости опухолевых клеток к индукции апоптоза под действием цитостатических препаратов.
2. Нарастание лекарственной резистентности перевиваемой лимфосаркомы RLS4o под действием полихимиотерапии вызывает повышение токсической нагрузки на печень, выражающееся в нарастании деструктивных изменений в паренхиме печени, снижении в ней репаративной регенерации, увеличении экспрессии Р-гликопротеина на мембране гепатоцитов.
13 Апробация работы: Материалы исследования были представлены на III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2007), на конкурс-конференции студентов и молодых ученых НГМУ «Авиценна» (Новосибирск, 2008), на Всероссийской юбилейной научно-практической конференции патологоанатомов с международным участием к 100-летию профессора П. Г. Подзолкова «Актуальные вопросы современной патологии» (Красноярск, 2008), на научной конференции «Фундаментальные науки — медицине» (Новосибирск, 2008), на IV Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в онкогематологии» (Новосибирск, 2008), на III съезде Российского общества патологоанатомов «Актуальные вопросы патологической анатомии» (Самара, 2009), на научной конференции «Медицинская геномика и протеомика» (Новосибирск, 2009).
Роль Р-гликопротеина в формировании множественной лекарственной устойчивости
Установлено, что активный АТФ-зависимый транспорт веществ в межклеточную среду является основным механизмом формирования МЛУ (Robert J., 1999), в котором главная роль принадлежит АВС-транспортерам (ATP-binding Cassette Transporters, АТФ-зависимые транспортеры) (Stavrovskaya А.А., Stromskaya Т.Р., 2008). Данная группа объединяет трансмембранные протеины, связывающие АТФ и использующие энергию ее гидролиза для транспортировки различных молекул через все виды клеточных мембран. Ключевую роль в процессах лекарственной устойчивости органов и тканей к действию токсических агентов играют MDR-, MRP- и BCRP- транспортеры (Choudhuri S., Klaassen CD., 2006).
Одним из важнейших транспортеров является белок плазматической мембраны Р-гликопротеин (P-gp), который имеет молекулярную массу 170 кД и является продуктом гена MDR1 человека, локализованного на длинном плече 7-ой хромосомы (7q21) (Stouch T.R., Gudmundsson О., 2002). Молекула белка состоит из 1280 аминокислотных остатков и имеет внутри- и внеклеточный компонент, каждый из которых включает шесть гидрофобных трансмембранных участков, а также два сайта связывания АТФ. Это позволяет считать, что молекула P-gp 12 раз пересекает цитоплазматическую мембрану клетки (рисунок 1). Его основной функцией является энергозависимый эффлюкс веществ за пределы клетки и уменьшение внутриклеточной концентрации разнообразных ксенобиотиков, в том числе лекарственных препаратов (рисунок 2) (Stouch T.R., Gudmundsson О., 2002; Aszalos А., 2007).
В нормальных тканях, как человека, так и грызунов высокие уровни экспрессии мРНК и белка гена MDR1 были выявлены в надпочечниках, почках, печени, тонком и толстом кишечнике, поджелудочной железе, предстательной железе, эндотелии капилляров головного мозга, яичек и яичников - органах, в которых экспрессированы механизмы защиты клетки от повреждающих воздействий (Fojo А.Т. et al., 1987; Ambudkar S.V. et al., 2003). P-gp также участвует в экскреции ксенобиотиков с желчью и мочой.
Одной из самых интересных характеристик P-gp/MDRl-опосредованного механизма является многообразие его субстратов по структуре и функции: от малых молекул, таких как органические катионы и аминокислоты, до макромолекул, таких как полисахариды и белки.
В последнее время были открыты и охарактеризованы более 28 однонуклеотидных замен в 27 позициях гена MDR1. Подобный полиморфизм гена ассоциируется с изменением биодоступности субстратов Р-гликопротеина, предрасположенностью человека к ряду опухолевых заболеваний и лекарственной резистентностью (Горева О.Б. и др., 2003; Zhou S.F., 2008).
Как было сказано выше, P-gp кодируется геном MDR1, который принадлежит к семейству MDR. Семейство MDR включает два гена человека (MDR1 и MDR2) (Chin J.C. et al., 1989) и три гена грызунов mdrl (mdrlb), mdr2, mdr3 (mdrla) (Croop J.M. et al., 1989; Ng W.F. et al., 1989). С помощью метода трансфекции показано, что лишь один ген человека (MDR1) и два гена грызунов {mdrla и mdrlb) семейства MDR имеют отношение к МЛУ и активируются в ответ на различные повреждающие воздействия (Devault А., GrosP., 1990).
Активация экспрессии гена MDR1, а, следовательно, и гиперэкспрессия P-gp может происходить в ответ на разнообразные воздействия: тепловой шок, рентгеновское и ультрафиолетовое излучение, белковое голодание, а также в ответ на обработку клеток химиотерапевтическими агентами (Зубова С.Г. и др., 2000; Stein U. et al., 1999). Чаще всего МЛУ развивается в клетках, переживших воздействие химиопрепаратов, более того, активация гена MDR1 возрастает с увеличением их концентрации (Chaudhary P.M., Roninson LB., 1993).
Данные относительно множественности и взаимозаменяемости элементов, регулирующих активность MDRl/P-gp (фосфолипаза С, протеинкиназы С и А, мобилизация внутриклеточного Са ), свидетельствуют о том, что эта защитная система жизненно важна для клетки, и поэтому ее регуляция неоднократно продублирована (Shtil А.А., Azare J., 2005). Наряду с многообразием и взаимным перекрыванием сигнальных путей, регулирующих активацию MDRl/P-gp, многочисленные возможности инициации транскрипции обуславливают важнейшую особенность функционирования гена MDR1 - способность активации многими стимулами (Штиль А.А., 2001). Такое многообразие регуляторных механизмов затрудняет разработку методов специфической профилактики и преодоления уже сформировавшейся МЛУ.
Проведение полихимиотерапии по схеме CHOP мышам с лимфосаркомой RLS40
Суспензию клеток опухоли RLS40 в физиологическом растворе (5x106 кл/мл) объёмом 0,1 мл трансплантировали мышам внутримышечно в правую заднюю лапку для формирования солидной опухоли (первый пассаж) (рисунок 6). На 7-ой день опухолевого роста мышей делили на две группы по 15 особей в каждой. Первой группе вводили стандартную комбинацию цитостатиков (схема CHOP), второй группе животных не вводили лекарственных препаратов (контроль). Препараты растворяли в физиологическом растворе непосредственно перед использованием и вводили в дозировках, рассчитанных методом графического пробит-анализа, составивших 1/5 ЛД5о: циклофосфан - 50 мг/кг, доксорубицин - 4 мг/кг, винкристин - 0,1 мг/кг однократно в хвостовую вену, преднизолон - 5 мг/кг в течение 5 дней внутрибрюшинно (Каледин В.И. и др., 2000). Контрольные животные получали инъекции физиологического раствора внутрибрюшинно. На 10-е сутки после лечения (17-е сутки роста опухоли) мышей выводили из эксперимента путем дислокации шейных позвонков под эфирным наркозом. Животное препарировали, отделяли поверхностный пласт опухолевой ткани и помещали его в физиологический раствор во льду. Затем опухолевую ткань подвергали дезинтеграции, гомогенизации и двукратной фильтрации для приготовления суспензии опухолевых клеток. В суспензии определяли количество опухолевых клеток путем подсчета в камере Горяева. Далее разводили суспензию таким образом, чтобы количество опухолевых клеток в приготовленной суспензии было идентичным количеству клеток, перевитых в начале эксперимента — 5x10 кл/мл.
Часть суспензии использовали для внутримышечной трансплантации интактным животным в количестве 5x10 кл/мл в объёме 0,1 мл (второй пассаж), а часть - для приготовления первичной культуры клеток. На 7-е сутки после имплантации опухоли, подвергавшейся ПХТ, мышам снова проводили курс ПХТ (CHOP), а контрольную группу с ростом опухоли оставляли без лечения. Всего было проведено четыре пассажа опухоли на мышах с последующим введением цитостатиков животным из соответствующей группы. Продолжительность эксперимента составила 68 дней.
Такое пассирование опухоли от одной мыши к другой делали с целью провести как можно больше курсов ПХТ, воздействующих на опухоль, что невозможно сделать, проводя несколько курсов ПХТ на одном и том же животном, из-за выраженных токсических эффектов многокурсовой химиотерапии и растущей опухоли на организм опухоленосителя.
Забор материала для молекулярно-биологического исследования производили на 7-е сутки после введения цитостатиков при первом пассаже опухоли и на 10-е сутки при проведении остальных пассажей опухоли и соответствующих курсов ПХТ. Забор материала для гистологического исследования производили на 1-е, 3-й и 7-е сутки после проведения ПХТ при первом пассаже опухоли, на 7-е и 10-е сутки после введения цитостатиков при проведении второго и третьего пассажей опухоли и на 7-е, 10-е и 14-е сутки после проведения ПХТ при четвертом пассаже опухоли.
Целью данного эксперимента было провести несколько курсов ПХТ, воздействующих на организм одного животного, для того, чтобы изучить влияние многокурсовой ПХТ как на опухоль, так и на организм животного, а также влияние наличия опухоли с возрастающей лекарственной резистентностью на переносимость и токсичность ПХТ.
Мышей линии СВА делили на три группы по 50 особей в каждой. Первой и второй группе животных внутримышечно в правую заднюю лапу трансплантировали суспензию клеток лимфосаркомы RLS40 в физиологическом растворе (1x106 кл/мл) объёмом 0,1 мл для формирования солидной опухоли, третью группу оставляли без воздействия (рисунок 7). На 7-ой день опухолевого роста в соответствующих группах мышам из второй и третьей группы вводили стандартную комбинацию цитостатиков (схема CHOP) - т.е. цитостатики вводились мышам, как с перевитой опухолью, так и без опухолевого процесса. Лекарственные препараты разводили в той же концентрации и вводили аналогичным образом, что и в эксперименте №1.
На 7-е сутки после проведения первого курса ГОСТ (14-е сутки роста опухоли) часть мышей выводили из эксперимента путем дислокации шейных позвонков под эфирным наркозом. Животное препарировали, отделяли поверхностный пласт опухолевой ткани и помещали его в физиологический раствор во льду для приготовления первичной культуры. Оставшимся мышам как с перевитой опухолью, так и без опухоли проводили второй курс химиотерапии. На 7-е сутки после проведения второго курса ПХТ (21-е сутки роста опухоли) часть мышей умерщвляли с последующим приготовлением первичной культуры опухолевых клеток, а оставшимся мышам проводили третий курс ПХТ. На 7-е сутки после третьей ПХТ (28-е сутки роста опухоли) мышей умерщвляли с последующим забором материала.
Забор материала для гистологического исследования производили на 1-е, 3-й и 7-е сутки после каждого курса ПХТ. Забор материала для молекулярно-биологического исследования производили на 7-е сутки после проведения очередного курса ПХТ.
В первой группе наблюдали естественное развитие и прогрессирование опухолевого процесса без лечения, т.е. ее использовали в качестве контроля эффективности ПХТ в группе с перевитой опухолью. Забор материала для молекулярно-биологического и гистологического исследований производили в те же сроки.
Продолжительность эксперимента составила 28 дней. Таким образом, нам удалось провести только три курса ПХТ из-за гибели животных с перевитой опухолью в результате активного роста и метастазирования опухоли, особенно в группе животных-опухоленосителей, не получавших ПХТ. В группе животных без опухоли, подвергавшихся трехкратному цитостатическому воздействию, гибели не наблюдали.
Особенности гистологического строения лимфосаркомы RLS4o в зависимости от числа курсов ПХТ, воздействовавших на опухоль
У всех животных на 7-е сутки после перевивки клеток опухоли в мышцы бедра в правой задней лапке формировался солидный опухолевый узел, достигавший среднего объема 0,16±0,02см3 и увеличивающийся до 4,3±0,3 см3 к 17-м суткам роста опухоли. Макроскопически опухолевый узел имел округлую форму с четкими границами и был представлен бело-розовой опухолевой тканью (рисунок 11, 12), в центральной части которой по мере роста появлялись очаги некрозов и кровоизлияний.
При гистологическом исследовании было выявлено, что опухолевый узел построен из мономорфных атипичных лимфоидных клеток с фенотипом В-лимфоцитов и частыми митозами (рисунок 13). Клетки лимфосаркомы RLS40 имеют округлые ядра с равномерно расположенным хроматином, окруженные узким ободком цитоплазмы. Опухолевые клетки тесно контактируют друг с другом, и края клеток несколько притерты друг к другу, что говорит об активном делении опухолевых клеток. Рост опухоли инвазивный, с разрушением мышц бедра (рисунок 14). Метастазы опухоли определяются в печени, легких, почках и располагаются преимущественно периваскулярно (рисунок 15, 16, 17), также у некоторых животных метастазы опухоли были обнаружены и в тканях передней брюшной стенки. Такое обильное метастазирование говорит о генерализованном характере и выраженной агрессивности течения лимфосаркомы RLS40 Забор материала для гистологического и морфометрического исследований ткани опухоли производили на 7-е сутки после введения цитостатиков при первом пассаже опухоли и на 10-е сутки - при проведении остальных пассажей опухоли в экспериментальной модели №1 и на 7-е сутки после каждого курса ПХТ при проведении трех последовательных курсов введения цитостатиков в экспериментальной модели №2.
Особенности гистологического строения опухоли в зависимости от числа курсов ПХТ, воздействовавших на опухоль, изучали в экспериментальной модели №1, в которой производили пассирование опухоли с последующим введением цитостатиков (глава 2.2.1.1.), поскольку именно эта схема селекции лекарственно-устойчивых опухолевых клонов позволяет оценить морфологию опухоли на одни и те же сроки после введения цитостатиков при проведении разного числа курсов ПХТ, воздействующих на опухоль.
В ткани опухоли как без лечения, так и после введения цитостатиков (на 7-е сутки при первом пассаже опухоли и на 10-е сутки при проведении остальных пассажей опухоли) наблюдали гибель клеток путем некроза и путем апоптоза (рисунок 18). Некротические изменения вероятнее всего имеют ишемическую природу, поскольку на определенном этапе развития опухолевый узел активно рос, достигая объема до 4,3±0,3 см3 к 17-ым суткам после перевивки, опережая рост сосудов, питающих опухоль, что приводит к развитию вторичных изменений в ткани опухоли — формированию очагов ишемии, некрозов и кровоизлияний (Струков А.И., Серов В.В., 1995).
Также некротические изменения в ткани опухоли могут формироваться в результате действия цитостатиков, поскольку в данной работе мы использовали одну из двух резистентных опухолевых линий (лимфосаркомы мыши RLS и RLS40X клетки которых в отличие от их аналога, чувствительного к индукции апоптоза цитостатиками (лимфосаркома мыши LS), гибнут не только путем апоптоза, но и путем некроза (Андреева Е.М., Шестопалова Л.В., Попова Н.А., 2006; Андреева Е.М., 2006).
В контрольной группе модели №1 при пассировании опухоли без введения цитостатических препаратов объемная плотность апоптотических телец в ткани опухоли, подсчитанная на одни и те же сутки после перевивки опухолевых клеток, не изменялась независимо от номера пассажа (рисунок 19). В то время как доля некрозов в ткани опухоли после четвертого пассажа возрастала в 2 раза по сравнению с первым пассажем опухоли.
Выявленная динамика может быть связана с более активным ростом опухолевого узла при проведении последовательных пассажей опухоли даже без введения цитостатиков, поскольку процесс перевивания опухоли сам по себе является достаточно травматичным для клеток, т.к. включает в себя ряд механических процедур по приготовлению суспензии опухолевых клеток (дезинтеграцию, гомогенизацию и двукратную фильтрацию), а также последующий инокуляции полученной суспензии в мышцы бедра. Поскольку любая популяция опухолевых клеток является гетерогенной, т.е. включает в себя как клетки, чувствительные к повреждающим воздействиям, так и более устойчивые опухолевые клоны, можно предположить, что при перевивании опухоли «приживаются» и «дают потомство», формируя впоследствии опухолевую массу, те клетки, в которых изначально экспрессированы механизмы устойчивости к повреждающим воздействиям и, соответственно, облегчен процесс «приживления» опухолевых клеток в мышцы бедра. Таким образом, в данной группе сам процесс перевивания мог способствовать клонированию более агрессивной и быстрорастущей опухоли.
Структурные изменения в печени животных-опухоленосителей при пассировании лимфосаркомы RLS40 без лечения и при проведении ПХТ
При проведении первой серии экспериментов (модель №1 - глава 2.2.1.1.) мышам линии СВА внутримышечно в правую заднюю лапку перевивали клетки лимфосаркомы RLS40. На 7-е сутки опухолевой прогрессии животные опытной группы получали ПХТ (схема CHOP), а животные контрольной группы — физиологический раствор (контроль). Далее клетки опухоли выделяли и перевивали интактным животным. Всего было проведено четыре пассажа опухоли с проведением ПХТ мышам соответствующей группы.
Печень животных-опухоленосителей как без лечения, так и после проведения ПХТ макроскопически была дряблой консистенции, с поверхности и на разрезе тусклой, светло коричневого цвета с красным крапом, визуально метастазы опухоли не определялись. Микроскопически в ткани печени имела место диффузно-очаговая инфильтрация опухолевыми клетками с формированием очаговых инфильтратов в центральных отделах печеночных долек, расположенных преимущественно периваскулярно. Также определялся диффузный рост опухолевых клеток в паренхиме печени, заполняющих и сдавливающих синусоиды (рисунок 31). В прилежащей ткани печени развивались тяжелые деструктивные и дисциркуляторные изменения: балочное строение резко нарушено, синусоиды коллабированы, значительная часть гепатоцитов в состоянии гидропической и баллонной белковой дистрофии - клетки увеличены в размерах, цитоплазма их разжижена, вакуолизирована, бледно-розового цвета, ядро расположено в центре цитозоля. В прилежащих к опухолевым инфильтратам участках и по полям печеночных долек располагаются частые моноцеллюлярные и очаговые некрозы гепатоцитов (рисунок 32). Выражено центролобулярное полнокровие.
В синусоидах встречались единичные нейтрофилы, лимфоциты и макрофаги, в портальных трактах наблюдали скудную инфильтрацию аналогичного клеточного состава. В перифокальных к опухоли участках печени, а также в участках очаговых некрозов гепатоцитов наблюдали умеренную инфильтрацию нейтрофилами. Причем при проведении ПХТ воспалительной инфильтрации не наблюдали, поскольку при цитостатическом воздействии происходит угнетение костномозгового кроветворения с последующим развитием иммуносупрессии (Гольдберг Е.Д. и др., 1999; Домникова Н.П. и др., 2008).
В контрольном эксперименте модели №1 мышам трансплантировали клетки опухоли RLS40 внутримышечно в правую заднюю лапку, затем на 14-е сутки роста опухоли при проведении первого пассажа опухоли и на 17-е сутки роста при проведении остальных пассажей мышей выводили из эксперимента и производили забор ткани опухоли для приготовления суспензии опухолевых клеток. Часть суспензии использовали для приготовления первичной культуры опухолевых клеток с целью определения исходных уровней экспрессии генов, участвующих в формировании МЛУ у данной опухоли, и исходную чувствительность опухолевых клеток к цитостатикам, а часть - перевивали интактным животным. Всего было произведено четыре пассажа опухоли.
Забор материала для гистологического исследования производили на 8-е, 10-е и 14-е сутки роста опухоли при первом пассаже опухоли, на 14-е и 17-е сутки - при втором и третьем пассаже и на 14-е, 17-е и 21-е сутки роста опухоли при проведении четвертого пассажа опухоли. В контрольной группе мышей-опухоленосителей инфильтрация ткани печени клетками опухоли RLS40 сопровождалась тяжелыми альтеративными изменениями, прогрессивно нарастающими по мере роста опухоли: объемная плотность дистрофически измененных гепатоцитов и некрозов паренхимы печени суммарно составляла 19±0,9% объема паренхимы печени на 8-е сутки после перевивки опухоли при первом пассаже опухоли, 34,4±1,5 - на 10-е сутки и 35,2±1,2 на 14-е сутки (таблица 7). Причем на начальных этапах роста опухоли альтеративные изменения в печени были представлены преимущественно дистрофически измененными гепатоцитами, а в более поздние сроки преобладала доля некрозов паренхимы печени.
При втором пассаже опухоли без введения цитостатиков объемные плотности дистрофически измененных гепатоцитов, некрозов паренхимы печени и суммарных альтеративных изменений, подсчитанные на 14-е сутки после трансплантации опухоли, не отличались от аналогичных показателей при первом пассаже опухоли (таблица 7). На 17-е сутки роста опухоли суммарные деструктивные изменения, подсчитанные при втором пассаже опухоли, составляли 47,3±1,3%. На 21-е сутки роста опухоли суммарные деструктивные изменения в ткани печени, подсчитанные при четвертом пассаже опухоли, составили 54,2±1,3% паренхимы печени, из которых 34,4±1,3% были представлены некрозами гепатоцитов и только 19,8±1% -дистрофически измененными гепатоцитами. Таким образом, по мере роста опухоли деструктивные изменения в печени животных-опухоленосителей прогрессивно нарастали преимущественно за счет увеличения объемной плотности некрозов паренхимы печени.
При пассировании опухоли без введения цитостатиков на 8-е сутки после перевивки опухоли численная плотность двуядерных гепатоцитов, отражающая регенераторный потенциал печени, составила 0,85±0,15 при проведении первого пассажа опухоли (таблица 7). На 10-е, 14-е и 17-е сутки роста опухоли данный показатель составил 1±0,2, 1±0,15 и 0,9±0,15, соответственно. На 21-е сутки после перевивки опухоли количество двуядерных гепатоцитов снизилось до 0,55±0,1. Данная тенденция свидетельствует о снижении репаративнои регенерации в печени при прогрессировании опухолевого процесса.
Выраженное повреждающее действие опухолевого процесса на печень связано как с инвазивным ростом клеток опухоли, сдавливающих и/или заполняющих синусоиды и нарушающих микроциркуляцию, а, следовательно, и трофику клеток печени, так и с опосредованным действием растущей опухоли на организм опухоленосителя через развитие синдрома эндогенной интоксикации (СЭИ), вызывая деструктивные изменения (дистрофии и некрозы) и нарушение процессов репаративнои регенерации в печени (Лосева М.И. и др., 2005). Развивающийся при онкопроцессах СЭИ многие авторы связывают с общей тканевой гипоксией, повышением уровней активности ряда лизосомальных ферментов в сыворотке крови (Поспелова Т.И, Нечунаева И.Н, 2004), активацией процессов ПОЛ и депрессией антиоксидантной системы (Лосева М.И., Поспелова Т.И., 1999).
