Содержание к диссертации
Введение
1. Структурно-функциональные характеристики КАТФ канального комплекса 17
1.1. Стехиометрия и тканевое распределение КАТФ каналов 17
1.2. Вопрос о неспецифической структуризации КАТФ канальных комплексов 19
1.3. Фармакологическая регуляция КАТФ каналов 21
1.4. Kir6.2 субъединица отвечает за АТФ-зависимое блокирование КАТФ каналов 22
1.5. SUR – каталитический модуль КАТФ канального комплекса 24
2. Биомедицинское значение КАТФ каналов 29
2.1. КАТФ каналы в панкреатических -клетках связывают метаболизм глюкозы с секрецией инсулина 29
2.2. КАТФ каналы в гипоталамусе регулируют глюкозо-чувствительные нейроны 30
2.3. Роль КАТФ каналов в других возбудимых тканях 32
2.4. Роль КАТФ каналов в поперечно-полосатых мышцах 35
2.4.1. КАТФ каналы в скелетных мышцах 35
2.4.2. КАТФ каналы в сердечных мышцах 37
3. Парадоксы функции КАТФ каналов 46
Результаты и обсуждение 54
4. Молекулярные механизмы управления КАТФ каналами 54
4.1. Лиганд-нечувствительные состояния КАТФ каналов 55
4.2. Дискретные состояния би-функционального Kir6.2/SUR2A канального комплекса 59
4.3. АТФазный цикл SUR2A и регуляция КАТФ каналов КСО 63
4.4. Связь между клеточными метаболическими потоками и каталитическим циклом КАТФ канального комплекса 65
4.5. Кооперативный вклад NBD1 и NBD2 в регуляцию КАТФ каналов 67
4.6. ED-домен – общий структурный компонент аллостерической регуляции КАТФ к анального комплекса 73
4.7. Роль АТФазной активности в регуляции КАТФ каналов 80
4.8. Заключение к разделу 4 86
5. КАТФ каналы в условиях компартментации внутриклеточного пространства 89
5.1. Диффузионный барьер – новый аспект клеточной сигнализации 92
5.2. Энергетический обмен в условиях клеточной компартментации 100
5.3. Свойства АК в компартментализованном пространстве 104
5.4. Свойства КК в компартментированном клеточном пространстве 107
5.5. Интеграция АК и КК в клеточную сигнальную систему 111
5.6. Декодирование КАТФ каналами нуклеотидных сигналов передаваемых КК и АК системами 114
5.7. Заключение к разделу 5 118
6. КАТФ каналы оптимизируют мышечное энергопотребление и термогенез 123
6.1. Недостаток функции КАТФ каналов увеличивает энергопотребление организма 124
6.2. КАТФ каналы определяют мышечные энергозатраты и энергетические запасы организма 127
6.3. Дефицит функции КАТФ каналов ограничивает рост веса тела 132
6.4. Неэффективность энергетики при дефиците КАТФ каналов снижает показатели физической активности 135
6.5. Ткане-специфичное ограничение экспрессии КАТФ каналов увеличивает мышечный термогенез 139
6.6. Гиперметаболическое состояние при дефиците КАТФ каналов и ожидаемое время жизни 143
6.7. Механизмы оптимизации энергозатрат и мышечного термогенеза КАТФ каналами 148
6.8. Обратимость АТФазной функции КАТФ канальных комплексов 155
6.9. Ограничения и методологические проблемы подтверждения синтетической функции КАТФ каналов 164
7. Заключение 171
7.1. Обобщённая гомеостатическая роль КАТФ каналов 171
7.2. Выводы 176
8. Методы 180
8.1. Плазмидные векторы и экспрессия канальных белков 180
8.2. Выделение миоцитов 181
8.2.1. Кардиомиоциты 181
8.2.2. Миоциты скелетной мышцы. 181
8.3. Patch-clamp эксперименты 182
8.3.1. Регистрация в Inside-out mode (от изолированных участков мембран) 182
8.3.2. Анализ кинетики КАТФ каналов 183
8.3.3. Cell-attached mode (регистрация от мембранного участка целой клетки) 185
8.3.4. Open Сell-attached mode (регистрация от участков мембран целой клетки с доступом к внутриклеточному содержанию) 186
8.3.5. Whole-cell mode (регистрация от целой клетки) 187
8.4. Анализ концентрационных зависимостей 188
8.5. АТФазная активность нуклеотид-связывающих доменов 188
8.6. Фотоаффинное мечение 189
8.7. Кинетика АТФазной реакции NBD2 189
8.8. Аллостерическая модель управления КАТФ каналов 192
8.9. Модели генно-модифицированных животных 194
8.10.Измерение сократительных и электрических параметров изолированных сердец 196
8.10.1.Сократимость перфузируемых сердец 196
8.10.2.Электрическая активность перфузируемых сердец 196
8.10.3.Скорость потребления кислорода перфузируемыми сердцами 196
8.11.МРТ-сканирование 197
8.12.Непрямая калориметрия 197
8.13.Телеметрия 199
8.14.Определение белков методом Western blot 200
8.15.Гистохимия и определение гликогена в тканях 201
8.16.Биохимический анализ крови 201
8.17.Произвольная физическая активность 202
8.18.Применение морфолиновых олигонуклеотидов 203
8.19.Измерение температуры поверхности тела 204
8.20.Фотометрический анализ ферментативной активности 204
8.21.Флуоресцентная микроскопия, совмещенная с измерениями методом patch-clamp. 205
8.22.Создание объединенного Kir6.2-Perceval конструкта 206
8.23.Статистика 207
Цитируемая литература 208
- SUR – каталитический модуль КАТФ канального комплекса
- Кооперативный вклад NBD1 и NBD2 в регуляцию КАТФ каналов
- Свойства КК в компартментированном клеточном пространстве
- Гиперметаболическое состояние при дефиците КАТФ каналов и ожидаемое время жизни
SUR – каталитический модуль КАТФ канального комплекса
Наиболее интригующим свойством КАТФ канального комплекса, что позволяет говорить о нем как об уникальной мембранной структуре является наличие собственной каталитической функции у модуля SUR, ассоциированного с канальным модулем Kir6.x. Действительно, стехиометрия некоторых ионных каналов подразумевает ассоциацию субъединиц разных белков, как в случае ацетилхолин-чувствительного К+ (IKAch) канала, состоящего из регулируемых G-белками 2-х Kir3.1 и 2-х Kir3.4 каналов [98]. Однако отличительной особенностью КАТФ каналов является ассоциация функционально различных белков. Структура SUR, включает в себя два гидрофобных трансмембранных домена (TMD6, Рис. 5), состоящих каждый из 6 трансмембранных -спиралей, последовательно соединенных с двумя цитоплазматичес-кими нуклеотид-связывающими доменами (NBD1 и NBD2), также известными, как АТФ-связывающие контейнеры (ABC7, Рис. 5) [99,100].
В силу этих свойств, SUR классифицируется, как член ABCC семейства АВС транспортеров [37,48] (Таблица 2), так же, как и обеспечивающий множественную лекарственную устойчивость транспортер MRP18 (ABCC1) или муковисцидозный трансмембранный регулятор проводимости CFTR9 ABCC7), также существующие в форме структурных димеров из 2-х TMD и 2-х ABC: TMD1-ABCMD2-ABC [100]. При этом SUR является одним из немногих ABC белков, имеющих дополнительный трансмембранный домен TMD0, определяющий следующую белковую структуру: TMD0MD1-ABCMD2-ABC (Рис. 5). Предполагалось, что TMD0 участвует в координации и доставке к мембране Kir6.х и его регуляции через SUR [101,102]. Действительно, полученные недавно кристаллические структуры Kir6.2/SUR1, выя-вили критическую роль TMD0 в координации поро-формирующих субъединиц в центре комплекса, а также функцию линкера L0 между TMD0 и TMD1, обеспечивающего передачу взаимодействия нуклеотидов и сульфонилмоче-винных агентов c SUR в состояния канальной поры [96,103] (Рис. 5B и 7).
Отличительной чертой всех ABC белков является наличие собственной АТФазной активности в одном или каждом NBD, которая является определяющей для транспортной или иной функции АВС белков [104]. NBD1 и NBD2 содержат высоко консервативные в ABC белках Walker A мотив (-GххGхGKS/T-, x – производная аминокислота) (Рис. 8А), Walker В мотив (-hhhhD-, h – любая гидрофобная аминокислота), и линкеры, связывающие Walker мотивы: -LSGGQ- в NBD1, и -FSGGQ- в NBD2 [104,105]. Исследования кристаллической структуры гомологичных белков показали, что -аминокислота и/или аминогруппа основной цепи невариативного лизина в Walker A мотиве участвуют в связывании - и -фосфата АТФ, в то время, как аспартат в Walker В мотиве координирует Mg2+, используя водородную связь с молекулой воды (Рис. 8В) [106,107]. Вместе с гистидиновым H-контуром, который, как предполагается, поляризует ассоциированную молекулу воды для реакции гидролиза, а также с глютаминовым Q-контуром, который взаимодействует с -фосфатом АТФ через молекулу воды, Walker мотивы формируют центры для связывания нуклеотидов и их гидролиза в SUR канальном модуле [16].
Изучение свойств нуклеотидного связывания с SUR с использованием фотоаффинного мечения выявило, что NBD1 может быть маркирован 8-азидо[-32P]-АТФ даже в отсутствии Mg2+ [108]. Это означает, что в противоположность некоторым АВС белкам, NBD1 в SUR по-видимому не гидроли-зует АТФ, обладая относительно стабильным АТФ связыванием. В силу этого свойства, в присутствии Mg2+, NBD1, но не NBD2, может быть маркирован 8-азидо[-32P]-АТФ. Это указывает на то, что в NBD2 имеет место по крайней мере один акт гидролиза, приводящий к потере меченого -32P, продукции и, вероятно, ковалентному связыванию немеченого 8-азидо-АДФ [108,109]. В свою очередь, наличие гидролитической активности способствует тому, что NBD2 может быть маркирован 8-азидо[-32P]АТФ [109–111]. Асимметричность взаимодействия нуклеотидов с NBD1 и NBD2 коррелирует с различиями в структурной гомологии между этими доменами. В сердечном и скелетно-мышечном типе КАТФ каналов NBD1 и NBD2 в SUR2 идентичны лишь на 28%, в то время, как каждый из них гомологичен соответствующим доменам в CFTR на 40% [16]. NBD2 в наиболее структурно близких к SUR белках, MRP1 и CFTR, также обладает более выраженной АТФазной активностью [110–112].
В ранних работах нам удалось впервые измерить скорость каталитической реакции непосредственно в иммуннопреципитированных образцах SUR2A и в очищенных NBD1 и NBD2 белковых фрагментах, присоединенных к мальтозо-связывающему белку, MBP10. Продукция меченого [32P]Pi, вследствие гидролиза -меченного [32P]АТФ, была обнаружена нами главным образом в MBP-NBD2 и в меньшей степени в MBP-NBD1, что подтверждало преимущественную каталитическую активность NBD2 [113]. Скорость АТФ-азной реакции MBP-NBD2 при этом была схожей со скоростью реакции, измеренной в других АВС белках [111,112]. АТФазная активность NBD2 была нечувствительна к ингибиторам других известных АТФаз и фосфотаз, таким, как оуабаин, олигомицин, тапсигаргин или левамизол, однако отсутствие в среде ионов Mg2+, являющихся ко-фактором многих гидролитических реакций, значительно подавляло скорость гидролиза АТФ в NBD2 [108,109,113]. Специфичность измеренной активности подтверждена мутациями аминокислот, ответственных за координацию гидролизуемого АТФ, Mg2+ и молекулы воды (Рис. 8В), которые значительно уменьшали скорость АТФазной реакции в NBD2. К похожим результатам пришла и группа Френсис Ашкрофт (F.M. Ashcroft) из Оксфордского университета, анализируя каталитическую активность NBD, выделенных из SUR1 [114]. Таким образом, наличие внутренней АТФазной активности в регуляторной SUR субъединице квалифицирует КАТФ каналы, как уникальный би-функциональный белковый комплекс, сочетающий в себе каталитическую и ион-проводящую функции [115,116].
Кооперативный вклад NBD1 и NBD2 в регуляцию КАТФ каналов
В то время, как нам удалось охарактеризовать дискретные конформации SUR [292], связанные с АТФазным циклом в NBD2, вклад NBD1, обладающий низкой каталитической активностью, если обладает ей вообще [108,109,113], в регуляцию КАТФ каналов остается неизвестным. Являясь членом семейства АВСС транспортеров, КАТФ канал содержит два нуклеотид-связывающих домена [36,48,294], NBD1 и NBD2, которые абсолютно необходимы для специфической функции АВС белков [257,295]. Отсутствие одного домена, как правило, приводит к нарушению функции другого, а также и к нарушению активности АВС белка в целом, указывая на взаимозависимость NBD1 и NBD2 [258,296]. Было установлено, что мутирование консервативного WA в NBD1 препятствовало как связыванию АТФ с обоими NBD [297]18 так и стимулирующему эффекту регуляторов КАТФ каналов, действующих через NBD2 [72,77,87,113,289,298,299]. Верно и обратное, наличие MgАДФ в NBD2 способствовало стабилизации нуклеотидов в NBD1, подчеркивая ко-оперативность взаимодействия NBD в SUR субъединице КАТФ канала [300].
Экспериментальная схема, выявляющая кооперативное связывание нук-леотидов с NBD1 и NBD2 в SUR показана на Рис. 31 [109]. В основе этого подхода, разработанного доктором Казумитсу Уеда и его коллегами, лежит возможность расщепить молекулу SUR на фрагменты, содержащие NBD1 и NBD2, используя слабую протеолитическую обработку трипсином [108,109]. Таким образом было оценено стабильное связывание нуклеотидов в каждом из фрагментов, со дер жащем NBD1 (35 кДа) и NBD2 (65 кДа), применяя фотаффинную маркировку с 8-азидо-[-32P]ATP или 8-азидо-[-32P]ATP, как описывалось в главе 1.5. А именно, мембранные ф р а к ц и и из COS-7 клеток, экспрес-сирующих разные изоформы SUR, инкубировались с 50 мкМ 8-азидо-[-32P]ATP (Рис. 31). После отмыва избытком буфера, при температуре около 0оС (технически, смесь лёд-вода имеет температуру +4оС), 8-азидо-[-32P]ATP остаётся связанным с NBD1, но диссоциирует от NBD2, что выявляется ультрафиолетовым (УФ) облучением, следующим немедленно после отмыва (обозначено на схеме, как условие 1). Если же после отмыва мембранные фракции инкубировались (постинкубация) в течение 15 мин при 37оС в отсутствии Mg2+, NBD1 быстро терял связанный 8-азидо-[-32P]ATP, и не маркировался УФ облучением (Рис. 31, условие 2). Если мембраны постин-кубировались 15 мин при 37оС в присутствии Mg2+, но без нуклеотидов, NBD1 постепенно терял маркировку 8-азидо-[-32P]ATP [300]. Однако, 8-азидо-[-32P]АТФ оставался связанным с NBD1 и после 15 мин постинкубации при 37оС в присутствии АТФ (или АДФ), который в этих условиях, взаимодействует и/или гидролизуется в NBD2 (Рис. 31, условие 3).
Таким образом, эти эксперименты показали, что взаимодействие нук-леотидов с NBD в SUR субъединице КАТФ канала требует кооперации нукле-отид-связывающих доменов, что, в свою очередь, должно определять регуляцию канальной активности. Действительно, способность -фосфатных аналогов фиксировать работу КАТФ канала в различных состояниях через стабилизацию дискретных каталитических конформаций, с одной стороны, и необходимость АТФазной реакции в NBD2 или её продукта для стабилизации нуклеотидов в NBD1 с другой, ставит вопрос о зависимости работы КАТФ канала от целостности нуклеотидного взаимодействия c NBD1. Мы показали, что, согласно выдвинутой концепции кооперативного взаимодействия двух NBD, не только нарушение АТФазной реакции в NBD2, вызванное заменой АТФ на негидролизуемые аналоги или мутацией D1470N (Рис. 25, 27), но и мутация в NBD1 (K708A, Рис. 8В), критичны для действия -фосфатных аналогов (Рис. 32) [301].
Сложность в экспериментальном демонстрации необходимости стабилизации АТФ в NBD1 для NBD2-зависимой регуляции КАТФ каналов связана с тем, что в отсутствии -фосфатных аналогов время жизни MgАДФ-связанных конформаций NBD2 остается коротким вследствие относительно быстрой диссоциации продукта гидролиза [109,300]. Чтобы снизить скорость АТФаз-ной реакции и продлить время жизни MgАДФ в каталитическом центре, мы использовали экспериментальный подход, подобный представленному на Рис. 31, применив глубокое охлаждение мембранных пэтчей во время регистрации активности КАТФ каналов [301].
Мы обнаружили, что блокирование КАТФ каналов АТФ терялось вследствие кратковременного охлаждения и быстрого разогрева мембранного пэтча (Рис. 33А). В среднем, в конфигурации Inside-out, эффективность ингиби-рования КАТФ каналов АТФ была значительно понижена сдвигом IC50 от 25±1.4 мкМ к 0.7±0.1 мМ (n = 2 – 5; см. Методы 8.4) вследствие процедуры охлаждения-разогрева (Рис. 33В, верхняя панель). Аналогично, охлаждение-разогрев в конфигурации Open Cell-attached снижал чувствительность КАТФ каналов к АТФ от 270±21 мкМ до 1.6±0.2 мМ (n = 2 – 7; Рис. 33В, нижняя панель).
Согласно вкладу АТФазной активности, вызванная охлаждением активация КАТФ каналов терялась в присутствии негидролизуемого AMP-PNP (Рис. 33С) или диаденозин тетрафосфата (Ap4A; Рис. 33D). Таким образом, процедура охлаждения не нарушает внутреннюю АТФазную активность КАТФ канального комплекса, однако способствует стабилизации связывания MgАДФ [301], переводящего канал в открытое состояние. Несмотря на то, что MgАДФ может быть стабилизирован в NBD2 [292], полное поглощение АТФ активацией АДФ-регенерирующей гексокиназной системы препятствовало вызванной охлаждением активации КАТФ каналов (Рис. 33Е). Это позволяет предположить, что присутствие АТФ в NBD1 является обязательным для того, чтобы взаимодействие MgАДФ с NBD2 активировало КАТФ каналы, пора которых была блокирована АТФ. В пользу этого предположения говорит тот факт, что в этом же пэтче активация КАТФ каналов, вызванная охлаждением, снималась активацией КК, поглощающей АДФ (Рис. 33Е).
Чтобы непосредственно проверить эту гипотезу, эффект охлаждения-разогрева был тестирован на рекомбинантных (нормальном) WT и мутированном Kir6/2/SUR2A каналах. Мутации в NBD1 или NBD2 препятствовали потере АТФ чувствительности, наблюдаемой после охлаждения-разогрева Kir6.2/SUR2A каналов дикого (WT) типа (Рис. 34А). А именно, мутации в Walker мотивах NBD2 (К1349А и/или D1470N), которые подавляют внутреннюю АТФазную активность [113], ослабляли активацию КАТФ каналов охлаждением-разогревом (Рис. 34В). Временной ход этой активации был подогнан функцией Больцмана в отсутствии АТФ, Т0.5 - время достижения полу-активации, t - относительное время разогрева и к - константа скорости (наклон) временного хода. В WT Kir6.2/SUR2A каналах, параметры функции Больцмана, описывающие временной ход разогрева, имели следующие значения: lmax = 1.12 ± 0.04, Г05 = 0.60 ± 0.03 и к = 0.24 ± 0.03 (п = 3). Двойная мутация K1349A/D1470N значительно уменьшала и замедляла временной ход активации с параметрами lmax = 0.42 ± 0.04, 70.5 = 0.92 ± 0.05 и к = 0.16 ± 0.04 (п = 3; Рис. 34D). Мутация К708А, нарушающая связывание АТФ с NBD1 [297], полностью подавляла активацию КАТФ каналов процедурой охлаждение-разогрев (Рис. 34С, D). Следовательно, кооперативная стабилизация АТФ и К АДФ в NBD1 и NBD2, транслируется в открывание КАТФ канала в присутствии блокирующих концентраций АТФ. Необходимость общей структурной целостности нукле-отид-связывающих доменов указывает на то, что NBD1 и NBD2 действуют, скорее, как объединенная структура, а не отдельные независимые регуляторы канальной функции.
Несмотря на то, что понижение температуры было использовано нами лишь как средство для стабилизации кооперативного связывания нуклеоти-дов с NBD1 и NBD2 [109,301,302], обнаруженный феномен может иметь физиологическое значение. Действительно, как и в нашем исследовании [301], активация КАТФ каналов была обнаружена в сердечных миоцитах золотых рыбок, акклиматизированных к низкой температуре (7оС) [303]. Показано, что КАТФ каналы у этих животных были почти нечувствительны к АТФ, в противоположность особям, не подвергнутым холодовой адаптации. Наши данные представляют механистическую основу этим наблюдениям, связывая кооперативную стабилизацию нуклеотидов, выявленную охлаждением, с переходом КАТФ каналов в АТФ-нечувствительное состояние. Такое изменение канальной активности рассматривалось как механизм, повышающий выживаемость при низких температурах за счет фиксации потенциала покоя для поддержания ионного и энергетического гомеостаза [303]. Более того, кардио-протекторный эффект КАТФ каналов у млекопитающих, связанный с пониженной температурой, также используется в кардиоплегических процедурах [304]. Следовательно, проведённые нами исследования [113,292,301] не только определяют структурно-функциональные механизмы регуляции КАТФ каналов внутриклеточными нуклеотидами, но и указывают на некоторые биологические аспекты устойчивости к холоду [305].
Свойства КК в компартментированном клеточном пространстве
Как известно (см. главу 5.2), именно динамика КК реакции практически точно следует изменениям клеточной энергетики и поэтому является наилучшим кандидатом на роль системы, осуществляющей энергетическую связь между клеточными компартментами [22,378,380,382]. Проведенный нами анализ выявил ранее неизвестную роль КК реакции, выражающуюся в способности усиливать нуклеотидные сигналы в условиях строгих диффузионных ограничений на границах клеточных компартментов [21,23], несмотря на то, что это свойство КК реакции может показаться противоречащим тому, что КК буферизует внутриклеточный уровень АТФ.
Поток, катализируемый КК реакцией, соответствует диффузионному потоку КрФ (JКрФ) и при равновесном АТФазном потоке связан с диффузией АТФ следующим образом:
Решения уравнения (16), с данными значениями клеточных пулов Кр/КрФ и нуклеоти-дов, с учётом D и DKp, при Дх = 200 нм, показало, что как и АК, КК эффективно сглаживает градиент концентрации АТФ в широком спектре значений примембранной АТФазной активности (Рис. 56А), что способствует поддержанию КАТФ каналов в закрытом состоянии при отсутствии энергетических изменений в целой клетке. Однако, в отличие от АК, при падении уровня АТФо в общем объёме клетки, КК система не поддерживает примембранный уровень
Механизм этого эффекта связан с тем, что согласно свойствам КК реакции, в условиях строгих диффузионных ограничений, даже относительно небольшой сдвиг АТФо от 6.99 до 6.5 мМ вызовет гигантское (-23 мМ) падение уровня КрФм в примембранном слое (Рис. 57А, В) и значительно снизит ресинтез примембранного АТФм. Действительно, если предположить отсутствие КК-КрФ системы, то можно ожидать, что существующий градиент концентрации АТФ между компартментами останется неизменным при падении внутриклеточного [АТФ]о, т.е. [АТФ]м будет пассивно следовать флуктуациям концентрации в общем объёме клетки ([АТФ]м = [АТФ]о), как схематически изображено на Рис. 57С (голубой пунктир). В присутствии КК, значительный запас внутриклеточного КрФ, а значит и его поток между компартментами, позволяет поддерживать уровни нуклеотидов, сводя к 0 концентрационные градиенты (Рис. 57D, красная линия). Однако падение внутриклеточного АТФо вызовет значительное подавление потока КрФ в примембранную зону (Рис. 57А, D), что приведет к усиленному росту градиента концентрации (Рис. 57В). Например, сдвиг АТФо от 6.99 до 6.6 мМ ([АТФ]о = 0.39 мМ) при DКр = 1.5D и D = 1.510-11 см2/с, вызовет появление АТФ = [АТФ]м = 1.38 мМ (Рис. 57В), что соответствует более чем 3-х кратному усилению нуклеотидного сигнала в при-мембранной зоне (АТФм/АТФо 1; Рис. 57D, красный пунктир).
Следовательно, АК и КК системы оказывают разные эффекты на прохождение нуклеотидных сигналов из общего объёма клетки в примембранную зону, что позволяет рассматривать эти реакции как компоненты интегрированной сигнальной системы, способной модулировать нуклеотидные сигналы, сопрягая их с регуляцией КАТФ каналов.
Гиперметаболическое состояние при дефиците КАТФ каналов и ожидаемое время жизни
Предположение о том, что увеличение термогенеза через ткане-специфичное подавление КАТФ каналов может быть использовано в прикладных медико-биологических целях, например, для ограничения веса тела, требует оценки рисков прерывания КАТФ канал-зависимого энергоконтроля для всего организма. В то время как защитная роль активации КАТФ каналов в условиях метаболического стресса является общепризнанной [181,207,433,434], животные с дефицитом канальной активности, по сравнению с нормальными животными, не меняют уровень активности, не испытывают недостатка в потреблении пищи и доступности энергетических субстратов в крови, а также характеризуются одинаковым потенциалом окислительного фосфори-лирования и уровнем внутриклеточных нуклеотидов [19,117,146,170]. Однако, последствия долговременного гиперметаболического состояния организма, вызванного подавлением КАТФ каналов, остаются неясными.
В качестве интегрального параметра, позволяющего оценить долговременное состояние организма, выживаемость группы из 10 контрольных животных (линии C57BL/6, WT) сравнивалась с выживаемостью 10 животных Kir6.2-KO (Методы 8.9). Как было показано выше (глава 6.3), в возрасте до 8-12 недель WT и Kir6.2-KO мыши имеют одинаковый вес тела (Рис. 79А), несмотря на то, что суточное потребление кислорода мышами Kir6.2-KO (504.2 ± 1.6 мл/г веса, n = 19) выше, чем у животных WT (473 ± 1.7 мл/г, n = 17; P 0.05).
Это увеличение энергетических затрат, после достижения 20 недельного возраста, приводило к уменьшению веса тела мышей Kir6.2-KO, по сравнению с WT [19]. Эта тенденция сохранялась и в последующие 2 года наблюдений за этими группами животных (Рис. 79А), при их свободном доступе к воде и пище, сформированной на основе обычной диеты (PicoLab Rodent Diet 205053, глава 6.3). Несмотря на кажущуюся повышенной долю выживших мышей Kir6.2-KO по сравнению с WT, как можно видеть на диаграмме Каплана-Мейера, построенной по итогу наблюдений в течение 27 месяцев логарифмический ранговый критерий27, не выявил статистическую разницу между выживаемостью Kir6.2-KO и WT мышей (25.6 ± 0.83 против 24.3 ± 1.13 месяцев, соответственно; Р=0.229).
Чтобы определить, является ли появление избыточного веса у WT, по сравнению с Kir6.2-KO, результатом изменения регуляции глюкозного метаболизма, мы провели измерения уровня инсулина и глюкозы в крови после 8 часового голодания в течение периода наблюдений. Отношение между уровнем инсулина и глюкозы не отличалось в экспериментальных группах как в возрасте 8-12 месяцев, так и между годовалыми животными WT и Kir6.2-KO (Рис. 80А). Более того, повышенная инсулинорезистентность, характерная для мышей WT, по сравнению с Kir6.2-KO, сохранялась и с возрастом (Рис. 80В, С). Эти данные свидетельствуют о том, что склонность к повышенному весу и ожирению мышей WT, имеющих более низкий уровень метаболизма по сравнению с Kir6.2-KO, сопровождается пониженной чувствительностью к инсулину, что являются установленным риск-фактором метаболических заболеваний и повышенной смертности [5,435].
С целью оценки выживаемости в условиях увеличенной энергетической ценности пищи, 10 WT и 10 Kir6.2-KO были подвернуты высококалорийной диете (PicoLab Mouse Diet 205058) в течение 27 месяцев, аналогично протоколу, описанному в главе 6.3. Как оказалось, в этих условиях контрольные мыши WT за указанное время набирали значительный вес по сравнению с гиперметаболическими животными Кіг6.2-КО (Рис. 81А). Анализ выживаемости, проведенный по диаграммам Каплана-Мейера с этими группами животных, показал значительное удлинение ожидаемого времени жизни КІГ6.2-КО (26.9 ± 0.12 месяцев) по сравнению с мышами WT (21.7 ± 2.71 месяцев, Р = 0.021; Рис. 81В).
Таким образом, полученные данные показывают, что недостаток активности КАТФ каналов ограничивает прирост веса тела не только в период взросления экспериментальных животных [19], но и в процессе старения. Хотя и проведенное с относительно небольшой группой животных, это исследование демонстрирует, что дефицит функции КАТФ каналов не только не вызывает увеличение смертности, и даже может обеспечить продление времени жизни в условиях повышенного потребления калорий.
Известно, что мыши линии C57BL/6 (WT), используемые в качестве генетической основы для Kir6.2-KO, склонны к ожирению, как при нормальной, так и при высококалорийных диетах, а также развитию с возрастом пониженной чувствительности к инсулину и глюкозотолерантности [419,420]. Поскольку вероятности возникновения желудочно-кишечных, кровотворных или лёгочных опухолей в мышах WT считаются незначительными [436], наблюдаемая в наших исследованиях увеличенная смертность животных WT, по-видимому ассоциирована с последствиями ожирения. Действительно, предрасположенность к повышенным отложениям жира у мышей WT, как известно, с возрастом может приводить к атеросклерозу [437] и к неалкогольному жировому заболеванию печени [438]. В нашем исследовании, высококалорийная диета, по сравнению с нормальной диетой, уменьшала среднее время жизни мышей WT на несколько месяцев относительно Kir6.2-KO. При этом значение медианы выживания (т.е. время вымирания половины популяции) в условиях обеих диет для WT оставалось неизменной, что означает учащение случаев смертности в условиях продолжительного потребления высококалорийной пищи, чего не наблюдалось у мышей Kir6.2-KO. Мы полагаем, что значительное продление ожидаемого времени жизни мышей Kir6.2-KO, по сравнению с WT, в условиях жировой диеты связано, скорее всего, с уменьшением риска воспалительных заболеваний, изменения уровня адипокинов и увеличения липотоксичности мышечных тканей [439], т.е. с отсутствием факторов, связанных с развитием ожирения и нарушением глюкозного метаболизма. В пользу этого предположения говорит и то, что увеличение продолжительности жизни Kir6.2-KO вряд ли согласуется с концепцией оздоровительного ограничения потребления калорий [440,441], поскольку фенотип этих животных, несмотря на уменьшенные запасы гликогена, характеризуется, по сравнению с WT, повышенным поглощением глюкозы мышцами при увеличенной общей скорости потребления углеводов [19,117,187].
Существует альтернативное предположение, что увеличение митохонд-риального метаболизма, как фармакологическими средствами, так и физической нагрузкой, может увеличивать продолжительность жизни [442,443]. В этой связи следует отметить, что гиперметаболическое состояние, вызванное дефицитом КАТФ каналов у мышей Kir6.2-KO, также связано с повышением скорости окисления субстратов и, как следствие, увеличением скорости дыхания митохондрий и общего оборота АТФ в клетках [19]. При этом, увеличение выживаемости этих животных, по сравнению с мышами WT, может быть связно c усилением аэробного ресинтеза АТФ, уменьшающим продукции активных форм кислорода [444], избыток которых снижает продолжительность жизни [445]. Проверка данной гипотезы представляется нам актуальной в плане дальнейших исследований. При этом, однако, следует иметь в виду, что ряд фактов находится в явном противоречии с выдвинутой гипотезой. В частности, нельзя исключить, что увеличение потребления глюкозы мышцами, лишенными КАТФ каналов, может напротив приводить к увеличению продукции активных форм кислорода за счёт активации немитохонд-риальных оксидаз, например, NADPH оксидазы, связанной с пентозофосфат-ным механизмом окисления углеводов [439,446]. Кроме того, показано, что КАТФ каналы участвуют в защите сердца от оксидативного стресса во время постишемической реперфузии [198,447]. Возможно, что увеличенный аэробный метаболизм, в отсутствии КАТФ каналов, может способствовать адаптивной перестройке механизмов продукции активных форм кислорода, что улучшает выживаемость Kir6.2-KO по сравнению с менее метаболически активными и склонными к ожирению животными WT [445,448]. Решением этих вопросов и противоречий может стать определение уровня активных форм кислорода в отсутствии метаболического стресса при дефиците сарко-леммальных КАТФ каналов, что предполагает цель дальнейших исследований. Следовательно, в противоположность условиям стресса и интенсивной физической нагрузки, при которых подавление КАТФ каналов может быть губительным, в отсутствии стресса и избытка энергетических запасов подавление активности КАТФ каналов не сокращает продолжительность жизни. Это наблюдение указывает на то, что ткане-специфичное прерывание функции каналов, в определённых условиях, может быть использовано в терапевтических целях для лечения ожирения, уменьшая число заболеваний и смертности, связанных с нарушениями метаболического баланса организма.