Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Эффект действия гравитационной разгрузки 10
1.2 Собственные механические свойства клеток 11
1.4 Механочувствительность и механосенсоры 16
1.4.1. Внеклеточный матрикс и мембранные белки 16
1.4.2. Механочувствительные ионные каналы 17
1.4.3. Подмембранный цитоскелет 18
1.4.4. Внутриклеточные структуры 20
1.4.5. Передача механического сигнала в ядро 22
1.4.6. Величина силы, приводящей к запуску клеточного ответа
1.5 Математическое моделирование в биологии 25
1.6 Реакция мышечных клеток на изменение внешних механических условий
1.6.1. Жёсткость мышечных клеток 29
1.6.2. Содержание белков 30
1.6.3. Клеточное дыхание 33
ГЛАВА 2. Математическая модель 36
2.1 Постановка задачи 36
2.2 Внешние воздействия 42
ГЛАВА 3. Материалы, методы и экспериментальные подходы 44
3.1. Объект исследования 44
3.2. Экспериментальные подходы
3.2.1. Антиортостатическое вывешивание грызунов 45
3.2.2. Инъекции фосфатидилхолинов 46
3.3. Методы исследования 46
3.3.1. Атомная силовая микроскопия 46
3.3.2. Метод полярографии для определения скорости клеточного дыхания 47
3.3.3. Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле с последующим иммуноблоттингом на нитроцеллюлозной мембране 48
3.3.4. Полимеразная цепная реакция 49
3.3.5.Иммуногистохимическое определение альфа-актинина-4 51 3.3.6. Определение уровня кортикостерона в сыворотке крови 51
3.4. Экспериментальные группы и обработка результатов 51
ГЛАВА 4. Результаты 53
4.1. Эксперимент по исследованию динамики развития клеточного ответа на ранних этапах
антиортостатического вывешивания 53
4.1.1. Уровень стресса у крыс (Таблица 1) после кратковременной гравитационной разгрузки. 53
4.1.2. Поперечная жесткость 53
4.1.3. Клеточное дыхание 56
4.1.4. Относительное содержание белков 57
4.1.5. Содержание мРНК генов белков в цитоплазме
4.2. Численный эксперимент 63
4.3. Влияние инъекций смеси фосфатидилхолинов на механочувствиетльность мышечных волокон камбаловидной мышцы в условиях гравитационной разгрузки .
4.3.1. Поперечная жёсткость 65
4.3.2. Относительное содержание белков 66
4.3.3. Содержание мРНК генов белков в цитоплазме 68
4.3.4. Иммуногистохимическое окрашивание 70
ГЛАВА 5. Обсуждение 72
6. Выводы 92
7. Список литературы: 94
- Собственные механические свойства клеток
- Внешние воздействия
- Атомная силовая микроскопия
- Влияние инъекций смеси фосфатидилхолинов на механочувствиетльность мышечных волокон камбаловидной мышцы в условиях гравитационной разгрузки
Собственные механические свойства клеток
При рассмотрении живых клеток с точки зрения механики чаще всего говорят об их упругих свойствах, в частности о жсткости. Жсткость наиболее подходящий параметр для описания механических свойств клеток, когда нет возможности применить модуль Юнга в силу неоднородности объекта. Вместе с тем, жсткость является важным параметром, позволяющим учным делать далекоидущие выводы. В литературе присутствуют данные об использовании изменения жсткости как онкомаркере, свидетельствующем о раковом перерождении клетки. Так же большое число работ посвящено механическим свойствам фокально-адгезивного комплекса, выполняющего важную роль в работе как отдельной клетки, так и многоклеточного организма. Относительно недавно I.V.Ogneva с коллегами разработала метод определения поперечной жсткости мышечных волокон и доказала е связь с состоянием кортикального цитоскелета [12,21].
Изучение поверхности или упругих свойств образцов при помощи атомно силовой микроскопии (АСМ) основано на взаимодействии зонда атомно-силового микроскопа и образца. Зонд представляет собой конус или коническую иглу, расположенную на конце длинной балки, кантилевера. Причм балка с обратной стороны покрыта отражающим материалом, например золотом. При взаимодействии зонда с образцом канилевер отклоняется, его отклонение регистрируется по отклонению отражнного от его обработанной золотом поверхности лазерного луча при помощи четырхсекционного фотокатода. Так как известны механические свойства зонда и кантилевера, а также смещение последнего, то можно определить силу взаимодейсвтия зонда с поверхностью.
Существуют несколько методов исследования, но во всех основную роль играет позиционирование зонда вдоль вертикальной оси. Такая тонкая регулировка осуществляется, как правило, при помощи пьезоэлектриков, напряжение на которых регулируется сигналом обратной связи, позволяющим в зависимости от задачи поддерживать постоянство силы взаимодействия или положение зонда над поверхностью образца.
Экспериментальные исследования механических характеристик различных клеток интенсифицировались при появлении методики атомной силовой микроскопии [22], прежде всего, на мышечных клетках, хотя уже в одном из первых исследований жесткость мышечных волокон сравнивали с жесткостью клеток эндотелия пупочной вены человека.
Первоочередной интерес к мышечным клеткам по мнению, Ogneva [12], был связан с тем, что эти клетки специализированы к генерации механического напряжения и их механические свойства являются определяющими в формировании развиваемого ими усилия.
Группа авторов во главе с Mathur A.B. et al. [23] получила одни из первых данных о механических характеристиках интактных мышечных волокон скелетных и сердечной мышцы в сравнении с клетками эндотелия с использованием АСМ в жидкости. Основная рабочая гипотеза исследования заключалась в том, что модуль упругости и вязкость у этих трех типов клеток будут различными из-за различной структуры и функциональной роли. Экспериментальными объектами служили волокна сердечной мышцы кролика, С2С12 миобласты взрослых мышей линии С3Н, и клетки эндотелия пупочной вены человека (HUVEC). Авторы показали, что модуль упругости эндотелиальных клеток составлял E=6.8±0.4 кПа в районе ядра, E=3.3±0.2 кПа на теле клетки и E=1.4±0.1 кПа на краю клетки. В отличие от эндотелия, в сердечной и скелетной мышце систематических изменений модуля упругости в зависимости от локализации точки контакта кантилевера с поверхностью обнаружить не удалось. Для клеток сердечной мышцы модуль Юнга составил E=100.3±10.7 кПа, а для клеток скелетных мышц E=24.7±3.5 кПа. Таким образом, наиболее жесткими, а, следовательно, устойчивыми к деформации являются волокна сердечной мышцы, что, по мнению авторов, обусловлено ее постоянной ритмической активностью.
Группа исследователей под руководством C. Reggiani [24] провела эксперименты по изучению структуры и поперечной жесткости сарколеммы полностью дифференцированных мышечных волокон в различных условиях. Эксперименты проводили на мышечных волокнах скелетных мышц мышей линии CD1. Измерения механических характеристик осуществляли в контактном режиме, причем максимальная приложенная сила к мембране волокна составляла 1нН, а глубина продавливания варьировалась от нескольких сотен до тысячи нм. Значение модуля упругости, представленное в работе, составляло E=61±5 кПа.
Внешние воздействия
Результаты большого числа исследований в условиях реальной и моделируемой гравитационной разгрузки свидетельствуют о том, что в различных органах и тканях формируются негативные изменения в результате действия микрогравитации.
Скелетные мышцы особенно подвержены действию невесомости как специализированный орган, выполняющий позные и двигательные функции. Предметом многих исследований является камбаловидная мышца, для которой показано, что длительное пребывание в микрогравитационных условиях приводит к существенному снижению ее массы, атрофическим изменениям волокон [100, 101, 102]. Кроме того, имеет место снижение функциональных возможностей как целой мышцы [103, 104], так и одиночных волокон [105]. Пребывание в условиях микрогравитации приводит к различным изменениям в сердечно-сосудистой системе у человека, в первую очередь к сдвигу жидкостных объемов тела в краниальном направлении [106, 107] и изменению ударного объема сердца [107, 108, 109, 110].
Однако не менее существенной проблемой, стоящей на пути освоения человеком космического пространства, в частности полета на Марс, является ранний период реадаптации к силе тяжести. Особенно важным представляется восстановление функциональных возможностей скелетных мышц и миокарда, ускорение которого невозможно без понимания механизма развития реадаптационных изменений. Согласно имеющимся немногочисленным литературным данным, относительно реакции клеток скелетных мышц на гравитационную разгрузку, одним из первых событий является показанное для камбаловидной мышцы накопление ионов кальция уже через двое суток антиортостатического вывешивания задних конечностей у мышей [111, 112]. Ранее I.V.Ogneva с коллегами показала, что максимум накопления ионов кальция в волокнах камбаловидной мышцы крысы и монгольской песчанки происходит уже через сутки гравитационной разгрузки, а для медиальной головки икроножной мышцы и передней большеберцовой этот максимум отмечался несколько позднее – к седьмым суткам антиортостатического вывешивания [113]. Увеличение базального уровня ионов кальция может приводить к активации кальпаинов [114, 115] и последующему разрушению структуры мышечного волокна. Однако пути этого накопления остаются неизвестными. Возможно, это происходит через L-каналы, но не исключено, что в этом могут принимать участие и механочувствительные каналы, например семейства TRP. В любом случае, функционирование встроенных в мембрану каналов зависит от состояния самой сарколеммы и связанного с ней цитоскелета. Более того, можно полагать, что механические характеристики кардиомиоцитов будут меняться иначе, нежели волокон скелетных мышц, поскольку нагрузка на сердечную мышцу в условиях
микрогравитации возрастает, а на скелетные мышцы задних конечностей -снижается.
Провести прямую оценку нативного состояния подмембранного цитоскелета мышечных волокон весьма затруднительно. Но определение его механических характеристик, а именно поперечной жесткости, может помочь в анализе его структурных изменений. Кроме того, сложная саркомерная организация мышечного волокна позволяет предполагать, что поперечная жесткость различных участков сарколеммы и сократительного аппарата, а именно Z-диска, М-линии и участка между ними, будет отличаться друг от друга. Дифференциация значений жесткости представляет особый интерес в связи, например, с сигнальной ролью различных белков костамера, зависящей, возможно от его структуры [12].
Разработанная методика позволяла определять поперечную жесткость как сократительного аппарата, так и мембраны с кортикальным цитоскелетом [21].
Было показано, что у волокон камбаловидной мышцы поперечная жесткость различных участков сократительного аппарата в расслабленном, активированном кальцием и ригор-состояниях снижается в ходе гравитационной разгрузки, у волокон икроножной мышцы практически не меняется, а передней большеберцовой - возрастает [21, 113]. При этом поперечная жесткость сарколеммы с кортикальным цитоскелетом в расслабленном состоянии снижается во всех мышцах в динамике антиортостатического вывешивания, причем уже в первые сутки вывешивания (для волокон камбаловидной мышцы с 3.05±0.03 pN/nm по 1.25±0.07 pN/nm; для волокон передней большеберцовой мышцы с 3.56±0.28 pN/nm по 2.46±0.13 pN/nm; для волокон медиальной головки икроножной мышцы с 2.87±0.12 pN/nm по 2.21±0.08 pN/nm), что может быть связано с непосредственным изменением вектора силы тяжести как внешнего механического фактора, меняющего напряжения на мембране [21].
Атомная силовая микроскопия
Для решения поставленных задач было проведено два последовательных эксперимента. Объектом исследования являлись половозрелые самцы крыс породы Вистар (Wistar) массой 180-230г. Исследовались волокна камбаловидной мышцы, левого желудочка сердца и сыворотка крови.
В первом эксперименте животных случайным образом разбили на шесть групп: группы с применением антиортостатического вывешивания на 6, 12, 18, 24 и 72 часа и группа контроля, обозначенные соответсвенно «6h», «12h», «18h», «24h», «72h» и «C». Для исследования у животных выделялись камбаловидные мышцы обеих задних конечностей, левый желудочек сердца, а также сыворотка крови для оценки уровня стресса животных вызванного ультра-короткими сроками вывешивания. Экспериментальные образцы получали после декапитации животных без применения наркоза.
Во втором эксперименте участвовали две группы животных: группа вывешивания на 6 часов и контрольная группа. Животным делались инъекции в задние конечности: в правую - инъекции растворенного лецитина, в левую – эквивалентный объм растворителя. У животных, после эвтаназии передозировкой раствора Авертина, выделялись камбаловидные мышцы. Исследуемые образцы, таким образом, оказались разбиты на 4 группы: группы без инъекций лецитина вывешивания «HS» и котрольная «С», и соответсвующие группы с инъекциями лецитина вывешивания «HS+L» и контроля «C+L».
До и во время всех экспериментов животные содержались в стандартных виварных условиях, получая стандартный сухой корм для грызунов и воду ad libitum. Все процедуры с животными были одобрены комиссией по биомедицинской этике кафедры Молекулярной медицины факультета Биологической и медицинской физики МФТИ.
Для опорной разгрузки у грызунов проводилось антиортостатическое вывешивание (рис. 1) по методу Ильина-Новикова в модификации Морей-Холтон [16]. Согласно этому методу животных вывешивают за хвост, предварительно обработанный асептическим раствором, таким образом, чтобы задние конечности не касались земли, что обеспечивает их разгрузку. Тело животного при этом располагается под углом 300 к полу клетки, а передними конечностями животное опирается на пол.
В качестве средства профилактики эффектов действия безопорного состояния и измененной ориентации мышц задних конечностей в поле силы тяжести использовали внутримышечные инъекции смеси фосфатидилхолинов. Инъекции представляли собой раствор пищевого лецитина в 1% растворе этилового спирта в 0,9% растворе хлорида натрия так, чтобы конечное содержание вещества оказалось равным 0,2 г/мл. Объм каждой инъекции составлял 0,5мл раствора, введение начали за 72 часа до вывешивания. Раствор вводили в камбаловидную мышцу правой конечности, в левую при этом вводили эквивалентный объм растворителя.
Из части ткани левого желудочка крысы получали кардиомиоциты согласно стандартной методике [141, 142], но без применения Triton X-100. Камбаловидную мышцу вырезали от сухожилия до сухожилия и обрабатывали согласно методике, которая ранее была описана Stevens et al. (1993). До момента проведения экспериментов пробы хранили при температуре -200С в буфере, содержащем в равных по объему долях расслабляющего раствора R (20мМ MOPS, 170мМ пропионат калия, 2,5мМ ацетат магния, 5мМ К2EGTA, 2,5мМ АТФ) и глицерина. Непосредственно перед экспериментом из пробы выделяли отдельные волокна. Для измерения поперечной жесткости выделенные волокна прикрепляли за концы к керамической подложке, которую затем устанавливали на дне жидкостной ячейки атомно-силового микроскопа Solver P47 (NT-MDT, Россия). Все манипуляции и измерения проводили в расслабляющем растворе R. Для работы в жидкости использовали мягкие кантилеверы с коэффициентом жесткости в диапазоне 0,01 – 0,08Н/м в контактном режиме, радиус острия кантилевера считали равным 10 нм. Жесткость определяли по кривым подвода отвода на глубине продавливания 150 нм.
Влияние инъекций смеси фосфатидилхолинов на механочувствиетльность мышечных волокон камбаловидной мышцы в условиях гравитационной разгрузки
Содержание мРНК генов, кодирующих основные цитоскелетные и метаболические белки. Содержание мРНК генов, кодирующих бета- и гамма-актин и бета-тубулин не отличалось достоверно до и после вывешивания в соответствующих группах (сравнивались C» и «HS», а также «C+L» и «HS+L») (Рис.11, А). Однако, имело место достоверное увеличение содержания мРНК этих генов в результате введения лецитина: содержание мРНК бета- и гамма-актина в группе «C+L» увеличилось на 200% по сравнению с группой «С», а бета-тубулина на 100%. Кроме того, содержание мРНК десмина осталось неизменным во всех экспериментальных группах.
Уровень экспрессии генов, кодирующих цитоскелетные белки в волокнах камабловидной мышцы крыс после краткосрочного антиортостатического вывешивания. А – основные цитоскелетные белки: микрофиламентов (Actb, Actg), микротрубочек (Tubb2b), промежуточных филаментов (Des); Б – микротрубочки и тубулин-связывающие белки; В – белки, связывающие актиновые мономеры; Г – белки, связывающие актиновые филаменты. Содержание мРНК генов, кодирующих тубулин и белки, связывающие микротрубочки, не отличалось от содержания мРНК гена бета-тубулина, значения до и после антиортостатического вывешивания не различались. Однако, в результате введения лецитина содержание мРНК генов Ckap5, Tcp1, Cct5 и Cct7, в группе «C+L» увеличилось на 110% (p 0,05), 50% (p 0,05), 70% (p 0,05) и 70% (p 0,05) соответственно, по сравнению с уровнем в группе «С» (Рис. 11, В).
Содержание мРНК генов, кодирующих белок 3 субъединицы комплекса ARP 2/3 (Arpc3) и тропомодулина 1 (Tmod1) не изменилось относительно контрольного уровня после гравитационной разгрузки (Рис. 11, С). Тем не менее, введение лецитина привело к перераспределению уровня их экспрессии; содержание мРНК Arpc3 в группе «C+L» увеличилось на 296% (p 0,05) по сравнению с группой «С», но содержание мРНК Tmod1 снизилось на 45% (p 0,05).
Похожие результаты были получены для белков, связывающих филаменты актина, супервиллина (Svil), и белка цитозоля лимфоцитов 1 (Lcp1); после антиортостатического вывешивания изменений в содержании мРНК не обнаружилось, а введение лецитина привело к перераспределению (Рис. 11, Д). Содержание мРНК Svil уменьшилось приблизительно в 5 раз (на 74%, p 0,05) в группе «C+L» по сравнению с «С», но содержание мРНК Lcp1 увеличилось примерно в 5 раз ( на 386%, p 0,05).
Содержание мРНК гена альфа-актинина-1 (Actn1), гена альфа-актинина-4 (Actn4) в группе «HS» (после 6 часов антиортостатического вывешивания) снизилось на 30% (p 0,05) и на 25% (p 0,05) соответственно по сравнению с группой «С» (Рис. 3, D). В группе «C+L» содержание мРНК генов Actn1 и Actn4 оказалось значительно выше, чем в группе «С» на 45% (p 0,05) и на 116% (p 0,05) соответственно. Более того, их содержание осталось неизменным после 6 часов разгрузки (в группе «HS+L» по сравнению с «С+L»).
Содержание мРНК генов, кодирующих глицеральдегид-3 фосфатдегидрогеназу (Gapdh), оставалось неизменным во всех группах (Рис. 12). Кроме того, содержание мРНК гена цитохрома С (Cycs) в группе «HS» уменьшилось на 30% (p 0,05) по сравнению с группой «С». В контрольной группе с введением лецитина, «C+L», содержание мРНК Cycs достоверно (p 0,05) снизилось на 80% по сравнению с группой «С». Однако, между группами «C+L» и «HS+L» достоверных отличий не было.
Иммунофлюоресцентный анализ позволил получить данные о периметре волокон (Р), толщине подмембранного цитоскелета (е ) и доле разрывов в нем относительно периметра ф). Методом атомной силовой микроскопии измеряли поперечную жесткость волокон (к). Результаты приведены в таблице 10.
Периметр волокон остатся на одном уровне во всех четырх группах. При этом доля разрывов, показывающая отношение длины разрывов в кортикальном цитоскелете волокна к его периметру, оказывается выше в группах вывешивания («HS» и «HS+L»), чем в соответствующих контрольных группах («С» и «C+L»). Однако нам не удалось обнаружить разрывов в цитоскелете в контрольной группе после введения лецитина («C+L»).
Толщина окрашенного слоя д, соответствующего подмембранному цитоскелету, не меняется в группах «С», «HS», «C+L», однако в группе «HS+L» увеличивается на 34%, 30% и 27% (р 0,05) соответственно.
Нарушения в работе опорно-двигательного аппарата у космонавтов остаются пока нерешнной проблемой. После орбитальных полтов у них наблюдается, потеря мышечной массы и снижение максимальной силы сокращения. Модельные наземные эксперименты на грызунах показали схожие результаты. В ходе исследований удалось обнаружить, что на первых этапах страдают, прежде всего, постуральные мышцы. Появление и развитие нарушений связывают с механочувствительностью клеток.
Проблема механочувствительности до сих пор остается одной из самых малоизученных проблем биофизики клетки. Наиболее сложной представляется ситуация с изменением силы тяжести, поскольку ее величина прямо пропорциональна массе объектов и, соответственно, для клеток очень мала. Еще более неоднозначной становится ситуация, когда величина силы тяжести не меняется, а меняется лишь ее направление. В то же время остатся открытым вопрос о механизме запуска клеточного ответа на изменение внешних механических условий. Поэтому определение клеточного механосенсора является крайне важной задачей.