Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Методика гигантского комбинационного рассеяния и ее биомедицинское применение. Обзор литературы 17
1.1 Комбинационное рассеяние света как эффективный метод решения биофизических задач. Гигантское комбинационное рассеяние света 17
1.1.1 Платформы для гигантского комбинационного рассеяния 22
1.1.2 Гигантское комбинационное рассеяние света в клетках, в ткани и in vivo 28
1.2 Методы передвижения объектов in vitro и in vivo. 31
1.2.1 Методика оптического пинцета и ее применение в биологии и медицине 31
1.2.2 Перемещение в градиенте магнитного поля 34
1.2.3 Акустические методы передвижения объектов 38
1.3 Клеточная инженерия. Матриксы для тканевой инженерии, их свойства и характеризация с помощью комбинационной спектроскопии 42
Выводы 48
Глава 2 Создание платформ для гигантского комбинационного рассеяния на основе структур «ядро-оболочка» 51
2.1 Материалы 51
2.2 Измерения дзета-потенциала 53
2.3 Получение микросфер карбоната кальция 53
2.4 Получение микросфер карбоната кальция, содержащего наночастицы магнетита 53
2.5 Формирование нанокомпозитных оболочек, содержащих АНКУ 54
2.6 Методика исследования образцов методом сканирующей электронной микроскопии 55
2.7 Методика исследования образцов методом спектроскопии комбинационного рассеяния 56 2.8 Методика исследования образцов методом энергодисперсионного анализа 56
2.9 Методика кристаллографического анализа 2.10 Методика оптического пинцета 57
2.11 Методика получения композитных волокон методом электроформования59
2.12 Методика культивирования клеток 60
2.13 Методика измерения жизнеспособности клеток 60
Выводы 61
Глава 3 Платформы гигантского комбинационного рассеяния света для исследования матриксов для инжиниринга тканей и биологически активных веществ 62
3.1 Влияние числа циклов адсорбции АНКУ на морфологию поверхности структур «ядро-оболочка» 69
3.2 Влияние концентрации АНКУ на спектры комбинационного рассеяния структур «ядро-оболочка» 70
3.3 Результаты тестирования платформ для гигантского комбинационного рассеяния на веществах, используемых для получения матриксов 77
3.4 Детектирование гиалуроновой кислоты с помощью платформ гигантского комбинационного рассеяния света, содержащих АНКУ 79
Выводы 80
Глава 4 Платформы гигантского комбинационного рассеяния света для исследования клеток in vitro 81
4.1 Исследование цитотоксичности платформ гигантского комбинационного рассеяния с помощью МТТ теста. 81
4.2 Влияние состава ядра и металлического покрытия платформы гигантского комбинационного рассеяния на возможность передвижения с помощью оптического пинцета в культуральной среде 83
4.3 Взаимодействие структур «ядро-оболочка» с культурой клеток линии L929. 89 4.4 Результаты исследования мышиных фибробластов с помощью методики
гигантского комбинационного рассеяния света 90
Выводы 92
Глава 5 Управление взаимным расположением структур «ядро-оболочка» под воздействием постоянного магнитного поля и их применение для создания тканеинженерных конструкций 94
5.1 Влияние концентрации магнетита на скорость передвижения структур «ядро-оболочка» 101
5.2 Исследование цитотоксичности платформ гигантского комбинационного рассеяния света 104
5.3 Формирование композитных волокон, содержащих платформы гигантского комбинационного рассеяния света
5.3.1 Характеризация волокон, содержащих платформы гигантского комбинационного рассеяния света, методом сканирующей электронной микроскопии 107
5.3.2 Исследование цитотоксичности волокон, используемых в качестве матрикса. 108
5.3.3 Характеризация волокон, содержащих платформы гигантского комбинационного рассеяния света, с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния света 109
Выводы 112
Заключение 113
Список использованных источников 115
- Гигантское комбинационное рассеяние света в клетках, в ткани и in vivo
- Получение микросфер карбоната кальция
- Влияние концентрации АНКУ на спектры комбинационного рассеяния структур «ядро-оболочка»
- Влияние состава ядра и металлического покрытия платформы гигантского комбинационного рассеяния на возможность передвижения с помощью оптического пинцета в культуральной среде
Гигантское комбинационное рассеяние света в клетках, в ткани и in vivo
Прогресс в области применения ГКР в медицине и биологии связан с развитием синтеза и оптической характеризации новых наноструктурированных материалов в качестве платформ для получения ГКР. Эффект ГКР появляется, когда аналит помещен непосредственно на или около поверхности металлической наноструктурированной платформы, где величина электромагнитного поля существенно выше [24]. Вклад поверхностной шероховатости в усиление сигнала комбинационного рассеяния областей был подтвержден вскоре после первых работ, посвященных ГКР. А после первых публикаций по детектированию одной молекулы вещества с помощью ГКР роль формы наноструктур или шероховатости поверхности микроструктур, используемых в качестве ГКР платформ, в этом явлении была полностью признана.
В настоящее время разработаны различные виды ГКР платформ. Однако разработка более широкого разнообразия улучшенных платформ для усиления сигнала комбинационного рассеяния света остается одной из самых критических проблем сегодня. Существует несколько подходов для создания ГКР-платформ: в виде твердых тонких пленок [6] и коллоидов (серебряные и золотые наночастицы в форме сфер, призм, звезд и нитей). [25]
Существуют различные методы получения платформ ГКР, с помощью которых возможно сформировать шероховатую металлическую поверхность. Эти методы включают огрубление поверхности с помощью окислительно-восстановительных циклов [26], металлических коллоидных гидрозолей [27], лазерной абляции металлов мощными лазерными импульсами [28], химического травления [29], реагентами Толлена [30], фотоосаждения серебряных пленок на TiO2 [30] и осаждением металлических пленок из газовой фазы. [31–33] В то время как большинство работ по методам получения платформ сфокусированы на проблеме достижения наибольшего усиления сигнала КР, другие требования, такие как генерация воспроизводимого и равномерного сигнала, стабильный срок хранения и возможность простого изготовления рассматриваются не так часто. В настоящее время существует несколько методов получения платформ, с помощью которых потенциально возможно сформировать платформы, удовлетворяющие этим требованиям: электронно-лучевая литография, наносферная литография, метод штампования, гибридный метод и осаждение при угле скольжения. Метод электронно-лучевой литографии является идеальным способом для получения однородных и воспроизводимых платформ ГКР. [34–38] Однако, производство таких платформ в большом количестве очень дорого, если технология электроннолучевой литографии не объединена с наноимпринтной литографией. [39] В наносферной литографии - методе, введенным впервые Ван Дуином [32,40–43], используется металлическое напыление на предварительно сформированную нанопористую маску из коллоидных частиц, которые впоследствии удаляются, оставляя только металл, осажденный в промежутках. Таким образом удается сформировать металлические наночастицы, однородно распределенные на поверхности. В шаблонном методе используются массивы частиц, наподобие нанотрубок, таких как анодированный Al2O3, используемых в качестве маски, в каналы которой электрохимическим напылением наносят серебряные или золотые наностержни [44–49]. С помощью гибридных методик получают ГКР платформы нанесением металлических частиц на нанопористую матрицу, которой является, например, пористый кремний или массивы наностержней. [50–56] Метод осаждения при угле скольжения основан на конденсации вещества из газовой фазы и может использоваться для изготовления упорядоченных массивов металлических наностержней на большой площади поверхности. [57,58] Для перпендикулярного осаждения наностержней поверхность подложки в вакуумной ячейке помещается под большим углом относительно направления источника ( 75). Эта конфигурация осаждения приводит к так называемому геометрическому эффекту затенения (экранирования), который приводит к желаемому росту наностержней на подложке в направлении осаждения. Наностержни растут соосно, под наклоном на подложке как показано на рисунке 1.2а. Также исследовалась зависимость фактора усиления от размеров, используемых наностержней (рисунок 1.2в).
СЭМ изображения ГКР-платформ, состоящих из массива серебряных наностержней на стеклянной подложке: а – вид сверху, б – изображение поперечного сечения массива (размерный отрезок равен 2 мкм); в значения фактора усиления ГКР в зависимости от длины используемых наностержней [57] Коллоидные растворы, по сравнению с пленками, более универсальны в применении. К тому же коллоиды могут использоваться для получения тонких пленок. С другой стороны, коллоидная и оптическая стабильность растворов, как правило, утрачивается в течение долгого времени, что приводит к нестабильности получаемого ГКР-сигнала. Их размер также ограничивает применимость коллоидов, например, в клетках, для исследования которых необходимы микрочастицы [59], наличие которых в клетке визуализируется методом оптической микроскопии.
Следует отметить, что немаловажным фактором является форма используемых микро- и наноструктур и морфологии микрочастиц в наноразмерном масштабе. Так, например, в сильно рассеивающих средах более эффективны шарообразные сенсоры. Причем использование анизотропных наночастиц приводит к негомогенному распределению локальных поверхностей плазмонного резонанса по всей поверхности частицы, что вызывает увеличение плотности электромагнитных полей в определенных областях частицы. Недавние теоретические и экспериментальные исследования доказали, что для еще большего усиления эффекта ГКР важно присутствие на платформе специфических промежутков между плазмонными частицами [18], которые часто называют “горячими точками”. С помощью периодических наноструктур могут быть достигнуты высокая чувствительность и воспроизводимость. Периодические структуры часто получают нанометровой литографией. Однако, как говорилось выше, данная техника требует достаточно больших денежных и временных затрат. Поэтому становится распространенным применение Ag и Au микроструктур с наноструктурированной поверхностью в качестве ГКР платформ. Особенно эффективны в применении сферы с шероховатыми поверхностями, серебряные микросферы "цветки" и Au микросферы “морские ежи”. Во многих работах говорится о наибольшем ГКР эффекте, полученном на серебряных платформах. Например, в работе [60] использовались массивы серебряных полусфер, имеющие высокий фактор усиления сигнала КР и высокую воспроизводимость. Однако, если рассматривать стабильность платформ, то золотые наночастицы являются намного более стойкими к окислению, чем серебряные и, таким образом, дольше сохраняют сигнал ГКР.[61]
Получение микросфер карбоната кальция
Для наблюдения эффекта ГКР необходимо сформировать на поверхности структур «ядро-оболочка» металлическое покрытие. Для создания серебрянного покрытия использовалась следующая методика. В тщательно отмытый стеклянный флакон налили 800 мкл воды, далее туда добавили 200 мкл водной дисперсии ядер, 10 мкл раствора 10 мМ AgNO3, 50 мкл раствора 0,1 М аскорбиновой кислоты. После добавления каждого реагента смесь тщательно перемешивали встряхиванием примерно 10 секунд. Далее, после перемешивания добавляли ещё 50 мкл AgNO3. По окончании процесса нанесения ядра осаждали центрифугированием при 3000 об/мин, концентрировали в 1 мл объема и промывали 5 раз от остатков реагентов и побочных продуктов реакции. Для формирования золотого покрытия использовалась реакция химического восстановления золотых наночастиц. Был приготовлен раствор 25 мг K2CO3 в 100 мл деионизованной воды. Раствор интенсивно встряхивался в течение 10 минут, и затем к нему приливалось 1,5 мл 1% раствора HAuCl4. После перемешивания в течение 30 минут в 4 мл полученного бесцветного раствора добавляли 200 мкл дисперсии микросфер. Затем к полученной смеси добавляли 10 мкл 1% раствора Л-аскорбиновой кислоты. После того, как бесцветный раствор менял цвет на синий, а затем на фиолетовый, что свидетельствует о росте золотых наночастиц на поверхности ГКР-платформ. В конце полученные платформы осаждали центрифугированием при 3000 об/мин, добавляли 1 мл деионизованной воды и промывали 5 раз от остатков реагентов и побочных продуктов реакции. Хранили образцы в деионизованной воде при 4С.
Характер распределения металлических наночастиц и рельеф полученных ГКР платформ устанавливался с помощью сканирующей электронной микроскопии. Структуры «ядро-оболочка» исследовались на сканирующем электронном микроскопе Mira\\LMU с приставкой X-Stream и программным обеспечением INCA ENERGY, позволявшей определить элементный состав нанокомпозитных микрокапсул путем сопоставления интенсивности рентгеновского излучения элементов с их характеристической энергией. Образцы исследовались при величине ускоряющего напряжения электронов 20 кВ.
Полученные и промытые структуры «ядро-оболочка» переносились на стеклянную подложку и исследовались с помощью нанолаборатории «ИНТЕГРА-СПЕКТРА» (НТ МДТ, Зеленоград). Спектры КР были получены при облучении полученных структур лазером с длинной волны 473 нм. Сигнал регистрировался CCD матрицей.
Также в работе был использован конфокальный микроскоп комбинационного рассеяния (CRM200, WITec, Ulm, Германия), оборудованный пьезосканером (P-500, Physik Instrumente, Karlsruhe, Германия) и диодным ИК лазером (Toptica Photonics AG, Graefelfing, Germany) с длиной волны 785 нм. Лазерный луч был сфокусирован с помощью водно-иммерсионного объектива 60х (Nikon, NA = 1.0). Спектры были получены с помощью CCD матрицы (DU401ABV, Andor, Великобритания), дисперсионной решетки 300 линий/мм спектрометра (Acton, Princeton Instruments Inc., Trenton, NJ, США) с разрешением 6 cм-1. Для обработки спектров использовалось программное обеспечение ScanCtrlSpectroscopyPlus (версия 1.38, Witec) и WITec Project Plus (версия 2.02, Witec).
Для подтверждения состава оболочек платформ, и состава металлосодержащих скоплений на поверхности платформ проводилось с помощью сканирующего электронного микроскопа Mira // LMU (Tescan, Чехия) с приставкой X-Stream для энергодисперсионного анализа (ЭДА) и программным обеспечением INCA Energy от Oxford Instruments. Ускоряющее напряжение для электронов составляло 20 кВ. Для калибровки уровня сигнала рентгеновского излучения использовалась стандартная процедура с эталонным образцом кобальта, с которого записывался спектр. Далее электронный пучок перемещался на исследуемый образец, с которого записывался спектр.
Данные были получены на Настольном рентгеновском дифрактометре Rigaku Miniflex 600 (Rigaku, Япония) с источником CuKa. Дальее структуры исследуемых образцов были смоделированы исходя из известных параметров структуры элементарной ячейки для кальцита, ватерита и магнетита. После этого получисленным методом Ритвельда оценивается количественный фазовый состав образцов.
Установка оптического пинцета, изображенная на рисунке 2.4, оборудована импульсно-периодическим фемтосекундным лазером ИК диапазона (Lumics LU0975M250, Германия) с длиной волны 976 нм и выходной максимальной мощностью 250 мВт. Диодный лазер с выводом из волокна, сохраняющего поляризацию проходящего излучения, и выходное изучение коллимируется асферической линзой. Для фокусировки лазерного пучка, чтобы сформировать оптическую ловушку, использовался масляный иммерсионный объектив (Olympus UPLFLN 100XOI2, Япония) с числовой апертурой 1.3 и оптическим коэффициентом пропускания приблизительно 60% при 976 нм. Для создания максимального градиента оптического поля в фокусе, а, значит, для наиболее эффективного вовлечения в ловушку микрообъектов, лазерный луч был расширен до полной апертуры объектива. Система линз, расположенных в конфокальной конфигурации, управляет положением оптической ловушки в
Влияние концентрации АНКУ на спектры комбинационного рассеяния структур «ядро-оболочка»
Таким образом, комбинация методик последовательной адсорбции полиэлектролитов и восстановления металлических наночастиц на поверхности микросфер приводит к формированию композитных микросфер, состоящих из твердого ядра карбоната кальция и оболочки из слоёв ПАА/АНКУ с включениями из серебряных наночастиц. Такие микросферы являются эффективными платформами ГКР, они стабильны и могут быть легко обнаружены благодаря усиленному сигналу КР от упорядоченных углеродных структур (АНКУ), а также с помощью оптической микроскопии благодаря их размеру. Комбинация наночастиц АНКУ и серебра увеличивает усиление сигнала КР более чем на 3 порядка. Сигнал ГКР при этом может быть получен при мощности лазера ниже 1 мВт, что находится в диапазоне мощностей, применимых для биологических объектов. С помощью сформированных платформ ГКР было получено усиление сигнала КР для веществ, используемых для создания внеклеточных матриксов, полимолочных кислот, поливинилового спирта и гиалуроновой кислоты. Таким образом, в третьей главе показано, что полученные микросферы на основе «ядро-оболочка» являются перспективными платформами ГКР для мониторинга роста клеток и разложения внеклеточного матрикса в реальном времени. Глава 4 Платформы гигантского комбинационного рассеяния света для исследования клеток in vitro
Для клеточной инженерии является актуальной и важной с точки зрения практического применения задача мониторинга роста клеток в биореакторе in situ. Возникновение такой проблемы связано с тем, что при традиционном подходе выращивание культур клеток происходит в биореакторе, где поддерживаются необходимые условия. По мере роста необходимо проводить контрольные измерения, для чего приходится нарушать оптимальные условия для роста клеток. Таким образом, комбинация технологии перемещения микрообъектов с помощью оптического пинцета с другими аналитическими методами, такими как КР, может быть применена для исследования динамики биохимических процессов, которые происходят в биообъектах.
В данной главе описывается получение наноструктурированных сферических ГКР-платформ и показана возможность их перемещения в клеточной среде с помощью лазерного пинцета. Одним из преимуществ частиц микронных размеров является возможность использовать для наблюдения обычный оптический микроскоп. Кроме того, микрочастицы сферической формы наиболее подходят для перемещения с помощью оптического пинцета. Полученные структуры могут быть поглощены живой клеткой, что позволит провести внутриклеточный анализ и изучить состояние клетки на данный момент. Впервые было продемонстрировано, что оптический пинцет может быть использован для точной локализации ГКР платформы в различных средах, в том числе на поверхности фибробластов мыши L929.
Анализ на цитотоксичность был выполнен с помощью стандартной МТТ техники. Для этого использовалась клеточная линия L929 фибробластов мыши. Клетки L929 выращивались в питательной среде ДМЕМ, с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки в культуральном планшете (25 cm2) в инкубаторе при 37C и увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO2. После клетки инкубировались в присутствии различных платформ ГКР в течение 24 часов. Для проведения МТТ теста были подготовлены структуры, в которых в качестве ядер использовался карбонат кальция либо диоксид кремния. Также формировалась оболочка разного состава: тестировались пары ПАА/АНКУ и ПДАДМА/АНКУ с золотым или серебряным верхним покрытием. В качестве контроля использовался образец, содержащий исходные клетки L929, хранящийся в инкубаторе при тех же условиях без добавления каких-либо платформ ГКР. Жизнеспособность клеток в контрольном образце составила 100%. Культивирование клетки в присутствии платформ ГКР с различным составом оболочки и ядра не уменьшало жизнеспособность клетки (рисунок 4.1). Образцы, содержащие платформы с серебряными частицами на поверхности, демонстрируют несколько меньшую жизнеспособность по сравнению с образцами, содержащими платформы с золотыми частицами на поверхности, однако также близкую к 100% и в пределах погрешности. Таким образом, в дальнейших экспериментах использование той или иной платформы ГКР обусловлено только эффективностью получения ГКР сигнала либо наилучшей возможностью захвата с помощью оптического пинцета.
Влияние состава ядра и металлического покрытия платформы гигантского комбинационного рассеяния на возможность передвижения с помощью оптического пинцета в культуральной среде
Исследование возможности перемещения проводилось с помощью постоянного магнита. Взаимное расположение магнита и стеклянной подложки с платформами представлено на рисунке 5.8. Значения магнитной индукции, создаваемой магнитом на различных расстояниях от него, показаны на рисунке 5.9 и составляют в близи магнита 19,1 мТл ± 0,22 мТл и на расстоянии 21 мм – 0,6 Тл ± 0,22 мТл. При подведении магнита к суспензии платформ ГКР создаётся поток, перемещающихся магнитных микросфер под действием магнитного поля. Были измерены средние скорости, с которыми перемещались различные образцы платформ ГКР с магнетитом под действием магнитного поля 2 мТл ± 0,35 мТл.
Для микросфер, содержащих 0,8 % наночастиц магнетита средняя скорость составила 191,4 нм/с, для 0,4 % – 153,6 нм/с, для 0,3 % – 100,8 нм/с. График зависимости средней скорости платформ ГКР от содержания магнетита в составе ядра представлен на рисунке 5.10. Образец, содержащий наименьшее количество магнетита (0,1 %), не перемещался под воздействием максимального значения поля для данного магнита 18 мТл, т.е. содержание количества магнетита менее 0,1 % не достаточно для перемещения микросфер карбоната кальция размером 1 мкм± 0,37 мкм. Также интересно отметить, что при малых значения магнитной индукции 0,5 мТл возможно изучить более подробно поведение «магнитных» платформ в магнитном поле, благодаря малой скорости их перемещения.. Вначале микросферы слепляются между собой, образуя длинные цепочки, параллельно линиям магнитного поля, и продолжают двигаться в градиенте поля. На рисунке 5.11 представлены конфокальные изображения полученных цепочек из структур СaCO3Fe3O4/(ПАА/АНКУ)3, упорядоченных под воздействием постоянного магнитного поля. Таким образом, можно создавать так называемые «горячие точки», располагая платформы близко друг к другу, приводя их практически в соприкосновение. Такие структуры возможно использовать и после высыхания, и в жидкости в качестве ГКР-платформ.
Анализ на цитотоксичность был выполнен с помощью техники, основанной на использовании красителя аламар блю. Для эксперимента использовалась клеточная линия L929 фибробластов мыши. Полученные результаты представлены на рисунке 5.12. В качестве контроля использовался образец, содержащий исходные клетки L929, хранящийся в инкубаторе при тех же условиях без добавления каких-либо платформ ГКР. Жизнеспособность клеток в контрольном образце составила 82%. Культивирование клеток в присутствии платформ ГКР, содержащих различное количество стабилизированного и нестабилизированного магнетита, существенно не уменьшило жизнеспособность (рисунок 5.12).
Результаты теста цитотоксичности ГКР платформ с различным содержанием стабилизированного (горизонтальная штриховка) и нестабилизированного (диагональная штриховка) магнетита на клетках линии L929 после инкубирования их в течение 24 часов Однако образцы, содержащие меньшее количество магнетита 0,75 мг/мл и 0,1 мг/мл, показали лучшие результаты теста на токсичность. Стоит отметить, что все виды ГКР платформ с магнетитом имеют лучшие показания теста на цитотоксичность, чем отдельно наночастицы магнетита (рисунок 5.13). Для наночастиц нестабилизированного магнетита жизнеспособность клеток мышиных фибробластов линии L929 составила 69%, для стабилизированного – 72%, но при встраивании магнетита в микросферы карбоната кальция выживаемость клеток повышается до 90% и 100% соответственно, что может говорить о том, что ватерит играет роль своеобразной оболочки, препятствующей возникновению токсичного эффекта магнетита.
Формирование композитных волокон, содержащих платформы гигантского комбинационного рассеяния света Были получены композитные волокна на основе поликапролактона по протоколу, описанному в пункте 2.11. Нетканые материалы, содержащие ГКР платформы на основе микросфер карбоната кальция с содержанием наночастиц магнетита, могут быть использованы в качестве многофункциональных матриксов для культивирования клеток и одновременного мониторинга роста ткани c помощью ГКР.
На СЭМ изображениях, представленных на рисунке 5.14, видно, что ГКР платформы на основе карбоната кальция равномерно распределены в объеме волокна, таким образом, для исследования волокон как матриксов для культивирования клеток легко выбрать интересующую область для исследования с помощью ГКР.
Анализ на цитотоксичность был выполнен с помощью техники, основанной на использовании красителя Аламар Блю, описанной в пункте 2.13. Для эксперимента использовалась клеточная линия L929 фибробластов мыши. Полученные результаты представлены на рисунке 5.15.
В качестве контроля использовался образец, содержащий исходные клетки L929, хранящийся в инкубаторе при тех же условиях без добавления каких-либо платформ ГКР. Жизнеспособность клеток в контрольном образце составила 84%. Жизнеспособность клеток, культивируемых в присутствии матриксов на основе нетканых материалов, содержащих «магнитные» ГКР платформы, не уменьшается так же, как и в присутствии отдельных ГКР платформ. Таким образом, такие структуры возможно использовать в качестве матриксов для культивирования клеток.
С помощью спектроскопии КР были исследованы отдельно волокна из ПКЛ и микросферы карбоната кальция, содержащие наночастицы магнетита. Спектры ПКЛ и микросферы карбоната кальция с магнетитом были получены при больших временах накопления, поэтому не вносили существенного вклада при снятии в дальнейшем спектров ГКР при временах накопления менее 1 с. Для ГКР платформ, содержащих наночастицы Fe3O4, были получены характерные пики магнетита - 680 см-1, и ватерита – 105 см-1, 114 см-1, 177 см-1, 209 см-1, 267 см-1, 300 см-1, 740 см-1, 750 см-1, 1074 см-1, 1090 см-1. Таким образом, можно сказать, что нестабилизированные наночастицы содержатся в микросферах не в окисленной форме магемита, а именно в форме магнетита. При чем наночастицы магнетита остаются неокисленными более 4 недель так же, как и ватерит не перекристаллизовывается в кальцит, что говорит о стабилизации встроенных частиц, т.е. получена стабильная форма ГКР платформ на основе микросфер карбоната кальция с включениями из наночастиц магнетита. После нанесения сенсорного слоя золотых наночастиц и встраивания полученных микросфер в волокна на основе ПКЛ была протестирована эффективность сформированных ГКР платформ в матриксе. Тестирование проводилось с модельным веществом – красителем родамином в концентрации 0,01 мг/мл, имеющим характерные пики в спектре КР. Был снят спектр высохшего родамина на подложке при времени накопления сигнала 100 с и спектр раствора родамина с поверхности ГКР платформы при времени аккумуляции сигнала 1 с (рисунок 5.16). Были получены характерные пики родамина: 613 см-1, 775 см-1, 1184 см-1, 1312 см-1, 1364 см-1. Так, для пика 1184 см-1 фактор усиления составил 4105.