Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 17
1.1 Последовательная полиионная адсорбция 17
1.2 Полимерные микрокапсулы 20
1.3 Инкапсуляция биологически активных веществ 23
1.4 Визуализация и контроль распределения полимерных носителей в живых системах 25
1.5 Методы визуализации движения форменных элементов крови 31
Глава 2. PIV анализ сосудистых микропотоков крови 40
2.1 Введение 40
2.2 Материалы и методы 42
2.2.1 Экспериментальная установка 42
2.2.2 Объект исследований 43
2.2.3 Измерение скорости крови 43
2.3 Результаты и обсуждение 47
2.4 Выводы 52
Глава 3. In vitro и in vivo адресация магнитных микрокапсул при помощи магнитного пинцета 53
3.1 Введение 53
3.2 Материалы и методы 54
3.2.1 Протокол синтеза наночастиц 54
3.2.2 Получение RITC-конъюгированного BSA 55
3.2.3 Приготовление микрокапсул 55
3.2.4 Конфокальная микроскопия 56
3.2.5 Сканирующая электронная микроскопия (SEM) 56
3.2.6 Флуоресцентная визуализация микрокапсул 56
3.2.7 Системы магнитной адресации микрокапсул 57
3.2.8 Эксперименты in vitro 59
3.2.9 Эксперименты in vivo 59
3.2.10 Гистологический анализ 60
3.3 Результаты и обсуждение 61
3.4 Синтез микрокапсул 61
3.5 In vitro магнитный захват микрокапсул 62
3.6 In vivo магнитная адресация магнитных микрокапсул в брыжейке крысы 66
3.7 Анализ динамики кровотока до и после введения микрокапсул методами PIV 71
3.8 Выводы 72
Глава 4. Формирование клеточной колонии в потоке жидкости под действие внешнего магнитного поля 74
4.1 Введение 74
4.2 Материалы и методы 75
4.2.1 Клеточная линия 75
4.2.2 Колориметрическая оценка метаболической активности клеток 75
4.2.3 Визуализация динамики микропотоков клеточной суспензии 76
4.3 Результаты и обсуждение 77
4.3.1 Интернализация магнитных микрокапсул 77
4.3.2 In vitro магнитная адресация клеток в стеклянном канале 81
4.3.3 Выводы к главе 85
Глава 5. Оптоптоволоконная активация полимерной трёхмерной микроструктурированной плёнки 86
5.1 Введение 86
5.2 Материалы и методы 87
5.2.1 Микропечать полимерных трёхмерных микроносителей 87
5.2.2 Cистема лазерной ИК активации полимерных контейнеров оптическим волокном 89
5.3 Результаты и обсуждение 91
5.3.1 Лазерная ИК активация полимерных трёхмерных микроструктурированных плёнок при помощи оптического волокна 91
5.4 Выводы 101
Глава 6. In situ опосредованная ИК-лазерная адресация биологически активных веществ для экспрессии зелёного флуоресцентного белка у единичных клеток на основе биосовместимых полимерных трёхмерных микроструктурированных плёнок 103
6.1 Введение 103
6.2 Материалы и методы 106
6.2.1 Изготовление полимерной трёхмерной микроструктурированной плёнки 106
6.2.2 Клеточная линия миобластов С2С12 107
6.2.3 Культивация миобластов С2С12 на внешней поверхности полимерной тёхмерной микроструктурированной плёнки 108
6.2.4 Окрашивание клеток С2С12 108
6.2.5 Хорактеризация полимерной тёхмерной микроструктурированной плёнки 109
6.2.6 Визуализация 109
6.3 Результаты и обсуждение 111
6.3.1 Фототермическая активация 111
6.3.2 Лазерная адресация 112
6.4 Выводы 118
Заключение 119
Список литературы 121
Список рисунков 141
- Визуализация и контроль распределения полимерных носителей в живых системах
- In vitro магнитный захват микрокапсул
- Лазерная ИК активация полимерных трёхмерных микроструктурированных плёнок при помощи оптического волокна
- Лазерная адресация
Введение к работе
Актуальность работы. Одной из актуальных задач современной медицины XXI века является развитие персонализированных методов профилактики, диагностики и лечения патологических состояний. Задачи персонализированной медицины неразрывно связаны с развитием различных полимерных интеллектуальных систем доставки биологически активных веществ. В настоящее время полимерные носители широко используются в биомедицинских приложениях, таких как адресная доставка лекарственных средств, репродуктивная и регенеративная медицина, антибактериальная и противораковая терапия, тканевая инженерия, а также для задач контроля экспрессии генов клеточных культур. Существует широкий спектр целевых систем доставки биологически активных веществ таких, как визикулы гидрогеля, полимерные или липосомальные микрокапсулы для адрессации действующих агентов в проблемные зоны биологических тканей (зоны воспаления, злокачественные новообразования и т.д.), позволяющие не только контролируемо высвобождать инкапсулированные агенты посредствам лазерного, электрического, магнитного, ультрозвукового или биохимического воздействия, но и визуализировать целевые участки биологических тканей.
Метод последовательной адсорбции (ПА) альтернативно заряженных полиэлектролитных
слоёв широко применяется для синтеза полимерных функциональных самоорганизующихся
систем таких, как многослойные плёнки и многослойные микрокапсулы. Метод
последовательной адсорбции позволяет варьировать в широком диапазоне толщину (жёсткость
и проницаемость) и состав, стенки полимерных носителей, а также функционализировать
многослойные системы, флуоресцентными красителями, флуоресцентными (квантовые и
карбоновые точки) и металлическими наночастицами (золото, серебро). В результате,
достигается возможность управлять физико-химическими свойствами полимерных
многослойных систем посредствам внешних электромагнитных полей.
Суспензионные микроносители имеют ряд ограничений, связанных с проблемами контроля распределение микроносителей в живых системах. Однако, применение магнитных наночастиц, для функционализации оболочки микрокапсул, позволяет неинвазивно концентрировать магнитные микрокапсулы в целевой области биологической ткани in vivo, под действием внешнего градиентного магнитного поля. Клетки способны интернализировать полимерные микрокапсулы посредствам эндоцитоза, что открывает возможность для контроля перемещения клеточных носителей функционализированных магнитными микрокапсулыми, при помощи градиентного магнитного поля.
В 2007 году, Sylvain Martel и др. продемонстрировал возможность контролировать перемещение металлической сферы, диаметром 1,5 мм, в пределах сегмента сонной артерии свиньи in vivo, при помощи градиентных катушек МРТ системы.
В 2014 году, Pierre Pouponneau и др. продемонстрировал адресацию крупных (50 мкм) биополимерных магнитных микрокапсул в печени кролика, при помощи градиентных катушек МРТ системы, для задач трансартериальной химиоэмболизации (инкапсулированный доксирубицин). Капсулы вводились через катетер в печёночную артерию, после чего при помощи градиентного магнитного поля задавалось направление потока магнитных биополимерных капсул в левую или правую ветвь печёночной артерии, в результате чего капсулы возможно было локализовать либо в левой, либо в правой печёночной доле. Тем не менее, пространственная разрешающая способность градиентных МРТ катушек не позволяет концентрировать магнитные микрокапсулы локально, в пределах сосудистого сегмента, а подобные размеры микрокапсул не позволяют их вводить в системный кровоток, так как это может привести к закупорке сосудов (эмболия).
Микроциркуляторное русло является транспортной системой, отвечающей за своевременную доставку питательных вещества и кислорода к тканям через кровь, с последующим удаление побочных продуктов метаболизма. Анормальный кровоток и модификация гемореологических характеристик крови в соответствии с конфигурацией кровеносных сосудов имеют критическое значение для диагностики сосудистых патологических состояний, на их ранних стадиях. На сегодняшний день существует запрос не только на качественную визуализацию полимерных микроносителей в сосудистых сетях, но и на количественную оценку реакции кровеносных сосудов на введение инородных тел (микроносителей).
Метод анемометрии по изображению частиц (PIV от англ. particle image velocimetry) заключается в пространственной визуализации распределения мгновенной скорости потока жидкости путем анализа двух и более последовательно зарегистрированных изображений перемещающихся частиц-трассеров. Трассеры, как правило, не различимы между собой, поэтому для оценки локальной скорости потока используется среднее смещение группы трассеров в пределах некоторой области конечного размера, именуемой «расчетная область» (РО). Наиболее распространенным способом при этом является оценка взаимной корреляционной функции изображений одной и той же расчетной области, зарегистрированных в два последовательных момента времени. Смещение максимума корреляционной функции соответствует среднему по расчетной области перемещению частиц в плоскости изображения, и, следовательно, средней скорости потока.
В контексте задач модификации таких крупных объектов, как клеточные подложки, поверхности медицинских имплантов и т.д., наиболее подходящими носителями биологически активных веществ, являются биополимерные наноплёнки. Полимерные трёхмерные микроструктурированные плёнки (ПТМП), с массивом микроконтейнеров (М) на их внешней поверхности, являются новым типом полимерных носителей, которые представляют собой полимерную наноплёнку, c массивом трёхмерных уединённых полых микроконтейнеров на её поверхности. ПТМП могут изготовляться как методами последовательной адсорбции, так и методами микролитографии, что позволяет варьировать физикохимические свойство стенок микроконтейнеров ПТМП. Также ПТМП плёнка позволяют герметично инкапсулировать как низкомолекулярные так и высокомолекулярные водорастворимые биологически активные вещества в уединённых микроконтейнеров на поверхности ПТМП плёнки. В результате достигается возможность равномерно распределять биологически активные вещества по поверхности плёнки в виде небольших одинаковых кластеров, которые возможно активировать как по одиночке так и целыми группами посредствам лазерного излучения, ультразвукового воздействия, механического воздействия или электромагнитными полями.
Наиболее перспективным методом активации процессов высвобождения
инкапсулированных биологически активных компонентов, являются лазерные
фототермические методы воздействия. Основными достоинствами лазерных оптических методов активации полимерных микроносителей является возможность селективно воздействовать на целевой полимерные микроноситель в пределах биологического окна прозрачности биоткани. С появлением биоразлогаемых оптических волокон, становится актуальными задачи не только по активации единичных полимерные микроносителей, посредствам сфокусированного лазерного излучения, но и задачи связанные с активацией групп кластеров полимерных микроносителей глубоко в биологических тканях, при помощи лазерного излучения подведённого через оптическое волокно.
Целью работы являлась разработка и апробация методов неинвазивной адресации, и активации полимерных микроносителей в живых системах. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Разработка и апробация физических методов визуализации и магнитного захвата полимерных многослойных флуоресцентных микрокапсул, функционализированных магнитными наночастицами, в разветвлённых сетях кровеносных сосудов брыжейки крысы.
-
Разработка и апробация методов магнитного захвата модельных клеток MA-104, поглотивших магнитные флуоресцентные многослойные микрокапсулы, для формирования жизнеспособной клеточной колонии в стеклянном фантоме кровеносного сосуда.
-
Разработка неинвазивных оптических методов визуализации динамики микропотоков крови разветвлённой сети сосудов методами адаптивного корреляционного PIV анализа (Particle Image Velocimetry) для визуализации и контроля движения полимерных/клеточных носителей.
-
Разработка метода фототермической лазерной активации полимерной трёхмерных микроструктурированной плёнки, с массивом микроконтейнеров на её внешней поверхности, в фантоме мягких тканей, на основе агарозного геля, при помощи оптического многомодового волокна.
-
In situ лазерная инфракрасная активация клеточной подложки, на основе полимерной трёхмерных микроструктурированных плёнки, с массивом микроконтейнеров на её внешней поверхности, для доксициулин-индуцированной активации экспрессии зелёного флуоресцентного белка (Green Fluorescence Protein) у единичных клеток.
Визуализация и контроль распределения полимерных носителей в живых системах
Развитие биомедицинских наук и биотехнологий привело к созданию нового типа упаковки биологически активных веществ, при помощи полимерных систем, для задач адресной доставки лекарственных средств в органы, ткани и клетки парентерально, через локальное или системное кровообращение, что позволяет доставлять лекарственные препараты непосредственно к целевым очагам заболеваний. Подобное селективное введение инкапсулированных лекарственных средств повышает активность терапевтических молекул в целевых местах биологических тканей, одновременно уменьшая токсические побочные эффекты на участках биологической ткани, не связанных с выбранной зоной воздействия, таким образом уменьшая системные эффекты воздействия лекарственных средств на минимальном уровне.
Однако, без применения управляемых методов контроля перемещения полимерных микроносителей в живом организме, микроносители будут свободно перемещаться по кровеносной системе [68–70], накапливаясь во внутренних органах (лёгкие, печень, почки, желудок, сердце) как показано на рисунке 1.8. На рисунке 1.8 представлено биораспределение многослойных флуоресцентных полимерных микрокапсул на основе полимолочной кислоты и декстран сульфата (PLA/DS), функционализированных карбоно-выми нанотрубками, в тканях крысы. Суспензия микрокапсул вводилась в хвостовую вену и далее их распределение регистрировалось при помощи метода in vivo биолюминисцентной визуализации, в течение 72 часов. Наглядно показано, что в первые 5 минут капсулы, вместе с кровью разносятся по всем тканям, преимущественно накапливаясь в грудном отделе. Рисунок 1.8 демонстрирует, что через 1 час после введения капсул в системный кровоток, флуоресцентный сигнал, в основном, сохраняется в области расположения внутренних органов, где захватываются естественным способом их большая часть.
Функционализация микроносителей наночастицами редкоземельных металлов (34) позволяет неинвазивно управлять перемещением микроносителей при помощи внешних электромагнитных полей. В результате достигается возможность управлять перемещением микроносителей в живых системах . [7;32–34;71]
По сравнению с другими магнитными материалами, наночастицы 34 более предпочтительны из-за наличия состояния Fe2 +, которое может выступать в качестве донора электронов. Кроме того, не создается гистерезис, поэтому, после удаления внешнего магнитного поля, наночасти-цы 34 оставляют за собой нулевую остаточную намагниченность. Это свойство помогает избежать процессов агломерации полимерных микроносителей в крови in vivo [72].
Поверхность наночастиц 34 обладает высокой химической активностью. Также наночастицы 34 окисляются в присутствии кислорода, что может привести к значительному уменьшению их магнитных свойств, а также их диспергируемости. Поэтому наночастицы 34, как правило, не применяются в чистом виде для биофизических задач, используются для функционализации различных систем адресной доставки лекарственных средств [73].
В публикации Павлова А.М. [32] демонстрируется, что модельные клетки 293Т могут быть функционализированны магнитными микрокапсулами 34. Было показано, что клетки, поглотившие магнитные микрокапсулы (PLA/DS)3/PEI, способны предсказуемо перемещаться под действием градиентного магнитного поля. В качестве источника магнитного поля применялся прямоугольный постоянный магнит. Клетки линии 293Т высевались в 24 луночный планшет (150 000 клеток на лунку). Через 24 часа, микрокапсулы добавлялись в лунки планшета в соотношении 1:1 или 1:10 клеток на капсулу.
Далее, под каждую лунку столбцов 5 и 6, помещался небольшой прямоугольный магнит (в левой области лунки), на всё время эксперимента. Через 72 часа субстрат люциферазы добавлялся в каждую лунку клеточного планшета с последующей регистрацией свечения флуоресценции клеток. Усреднённые значение свечения флуоресценции в пределах прямоугольной области каждой лунки строки А 1.9a, представленны на столбовой диаграмме 1.9б. Данные усреднялись по каждому столбцу 24 луночного планшета (доверительный интервал). Продемонстрировано, что клетки с магнитными микрокапсулами движутся по направлению к зане расположения магнита. Согласно представленным данным, клетки, поглотившие магнитные микрокапсулы, переместились в зону расположения постоянного магнита.
По сравнению с постоянными магнитами, электромагнитные системы обладают рядом ключевых преимуществ. 1) Электромагнитные системы позволяют управляемо активировать или деактивировать магнитное поле. 2) Электромагнитные системы позволяют контролировать силы, действующие на магнитные микрокапсулы, что может применяться для анализа жёсткости клеточных мембран [34]. 3) Электромагнитные системы позволяют концентрировать электромагнитное поле в некотором объёме, что позволяет управлять движением магнитных носителей с высоким пространственным разрешением.
Магнитным системам доставки биологически активных веществ, уделяется повышенное внимание научного сообщества, однако проблема концентрации магнитных микроносителей в живых системах остаётся открытой. В 2007 году, Martel et all. продемонстрировали принцип трёхмерной навигации стальной сферы, размерами 1,5 мм (0,0136 г.) в сонной артерии живой свиньи in vivo, используя градиентные катушки МРТ системы [35], при величине магнитной индукции B0=1,5 Тл. Сфера вводилась в артерию свиньи при помощи катетера. Визуализация артерии производилась при помощи рентгеноконтрастной ангиографии. Далее сфера перемещалась градиентным магнитным полем МРТ системы, между участками артерии 1,2 и 3, в прямом и обратном направлении 1.10.
В 2011 году была проведена попытка контроля распределения магнитных микроносителей in vivo в более мелких кровеносных сосудах, при помощи градиентных электромагнитных катушек МРТ систем, для задач трансартериальной химиоэмболизации [33; 74]. Для этого применялись микрокапсулы, на основе полигликолиевой и полимолочной кислот (PLGA), 30% объёма которых составляли наночастицы 34. Разммер микрокапсул составлял 50 мкм. В качестве противоопухолевого агента применялся докси-рубицин (DOX), инкапсулированный в данные микрокапсулы. За первые 5 минут, данные капсулы выпускают 25% DOX и ещё порядка 50% DOX за последующие 3 дня [74]. Полимерные микрокапсулы вводились кролику, в артерию почки, через катетер. Кровеносная сеть почки кролика визуализировалась при помощи метода рентгеноконтрастной ангиографии 1.11.
In vitro магнитный захват микрокапсул
Первые эксперименты были посвящены исследованиям in vitro, чтобы подтвердить возможность визуализации микрокапсул в потоке цельной крови, а также проверить возможность их адресации при помощи внешнего магнитного поля.
На рисунке 3.6 представлены флуоресцентные изображения микрокапсул в стеклянном капилляре прямоугольного сечения до и после активации магнитного поля. Возбуждение флуоресценции производилось при помощи равномерного освещения капилляра лазером на длине волны 532 нм. Белая стрелка обозначает направление кровотока. Белые пятна во всей области потока соответствуют свечению микрокапсул. Большое белое пятно на капиллярной стенке соответствует агрегату микрокапсул, образованному капсулами, захваченными магнитным полем. Накопление капсул вблизи магнитного наконечника является явным свидетельством их отклика на внешнее магнитное поле. Согласно измеренному поперечному распределению магнитного поля внутри капилляра (Рисунок 3.5) капсулы аккумулируются точно в области с наибольшей магнитной индукцией [115–117], которое достигает значения 200 мТл.
Кроме того, количество захваченных капсул может контролироваться магнитным полем, как это показано на флуоресцентных изображениях рисунка 3.6. Эти данные позволяют нам оценить приблизительное количе ство захваченных капсул и следовательно динамику их накопление. Согласно СЭМ-изображениям средний размер капсулы составляет около 3 мкм, что соответствует площади 7 мкм2. В свою очередь, площадь агрегатов капсул может быть представлена как сумма прямоугольников и прямоугольных треугольников. Таким образом, можно вычислить, что около 2700 капсул были захвачены за первые 30 секунд, а затем около 2800 капсул за 60 с и далее около 4500 капсул за 90 секунд магнитного воздействия (рисунок 3.7).
После удаления магнита, капсулы почти полностью вымывались из пристеночной области своей первичной локализации (рисунок 3.6д,е и рисунок 3.7). Однако, после удаления магнита, некоторые отдельные капсулы и их агрегаты могут оставаться на стенке.
Магнитный захват микрокапсул in vitro был ранее показан Zebli et al. [118]. В отличии от нашего исследования капсулы захватывались в потоке клеток, а не крови. Также магнитный захват капсул не наблюдался в реальном масштабе времени. Подобные капсулы могут быть эффективно захвачены неоднородным магнитным полем в потоке крови и затем могут быть удалены из места своей локализации после удаления источника магнитного воздействия.
Лазерная ИК активация полимерных трёхмерных микроструктурированных плёнок при помощи оптического волокна
В данном разделе демонстрируется возможность лазерного фототермического вскрытия МТМП плёнок с помощью лазерного ИК воздействия через оптическое многомодовое волокно в разных средах: воздухе, деиони-зированной воде и 1% агарозном геле.
На первом этапе сухая 3трёхмерная плёнка активировалась в воздушной среде, как показано на рисунке 5.4. Трёхмерная плёнка помещалась на предметный столик инвертированного микроскопа. Затем оптическое волокно, вклеенное в изогнутую под углом 450 иглу, располагалось ортогонально к образцу на высоте 100 мкм, при помощи трёхмерного микроманипулятора. Поскольку полимерная плёнка прозрачна, то контроль положения оптического волокна возможен посредствам перефокусировки объектива микроскопа. Время экспозиции лазерного излучения во всех экспериментах составляло 0,5 с. Полная ширина на уровне половинной амплитуды лазерного пучка составляла 75 мкм на расстоянии 100 мкм от поверхности образца.
На рисунке 5.5а представлена типичная картина фототермического повреждения трёхмерной плёнки, вызванная лазерным ИК воздействием. Упорядоченный массив небольших окружностей является массив отдельных герметичных микроконтейнеров на поверхности полимерной наноплёнки. Чёрными стрелками на рисунке 5.5а, с указанием плотности мощности лазерного воздействия, указывались зоны лазерного ИК воздействия на трёхмерной плёнку, через мультимодовое оптическое волокно. В воздушной среде, при отсутствии каналов для эффективной диссипации тепла, резкое повышение температуры в пространстве вокруг золотых наночастиц приводит к плавлению полиэлектролитов. Характерное кольцо оплавленного полимера было сформировано вокруг каждой зоны, подверженной лазерному ИК воздействия, с типичной толщиной 12,7 ± 0,2 мкм.
Лазерное облучение проводилось по часовой стрелке с увеличением оптической мощности 0,56-5,68 кВт/см2. Энергии в 2,27 кВт/см2. было достаточно, чтобы образовать сквозное отверстие в полиэлектролитной плён ке. Увеличение выходной мощности лазерного пучка приводит к нелинейному увеличению зоны повреждения, как показано на рисунке 5.5b. Каждая точка на рисунке 5.5b соответствует среднему значению по 5 измеренным диаметрам соответствующего поврежденного участка полимерной трёхмерной плёнки с шагом вращения измерительного профиля на 30 градусов. Шкалы ошибок соответствуют стандартным отклонениям () измеренных значений диаметров и рассчитывались как:
На следующем этапе исследований, лазерная активация ПТМП производилась в водной среде. ПТМП помещалась на предметный столик микроскопа. Затем на поверхность ПТМП добавлялось микропипеткой 2 мл де-ионизированной воды. На поверхности трёхмерной плёнки формировался водный мениск. Оптическое волокно погружалось в водную каплю и устанавливалось на высоте 100 мкм от поверхности полимерной плёнки, под углом 600 градусов. Лазерное ИК облучение ПТМП производилось в 6 зонах с последовательным увеличением выходной лазерной мощности с 60 мВт до 290 мВт, что соответствует оптической плотности мощности 1,3-6,6 кВт/см2.
Характерные фототермические паттерны повреждения полиэлектролитной плёнки представлены на рисунке 5.7.
ИК излучением через многомодовое оптическое волокно в деионизированной воде (а) и соответствующие им СЭМ изображения (б).
СЭМ снимки зон лазерного воздействия (Рисунок 5.7б)) показывают, что помимо процессов плавления полимерной плёнки также присутствуют обширные термические деформации вызывающие расслоения и набухание полиэлектролитных слоёв трёхмерной плёнки. Это объясняется тем, что на грев полимерных плёнок, собранных ионным наслоением, вызывает термический фазовый переход в пластическое состояние, вызванное разрушением ионных пар с последующей релаксацией полиэлектролитных цепей. С другой стороны лазерное термическое воздействие вызывает дегидратацию полимерных плёнок и как следствие разрыв вода-полимер связей приводит к истончению и разрывам полиэлектролитной ПТМП PSS/PDADMAC. СЭМ изображения показали, что в деионизированной воде лазерное воздействие вплоть до 6,6 кВт/см2 не вызывает сквозного повреждения ПТМП. Целостность микроконтейнеров полимерной трёхмерной плёнки, после лазерного ИК облучения 0,56 кВт/см2 в демонизированной воде не обнаружено.
Третий эксперимент лазерного ИК вскрытия микроконтейнеров ПТМП производился с использованием фантома на основе агарозного геля (Рисунок 5.8). Покровное стекло с ПТМП помещалось на предметный столик микроскопа. Вокруг ПТМП, на покровное стекло помещалось пластиковое кольцо, высотой 10 мм, которое заполнялось 1% агарозным гелем, окрашенным флуоресцентным красителем FITC. Многомодовое оптическое волокно вклеивалось в медицинскую иглу и, посредствам инъекции, вводилось в 1% агарозный гель таким образом, чтобы расстояние от конца оптического волокна до поверхности микроконтейнеров ПТМП PSS/PDADMAС составляло 100 мкм.
После ИК лазерного воздействия, на поверхности ПТМП PSS/PDADMA, формировалась элиптическая зона повреждения 6,8х10-3 мм2 (Рисунок 5.9). На рисунке 5.9в,г представлены флуоресцентные изоб ражения инкапсулированного родамина Б в микроконтейнеры полимерной трёхмерной плёнки до и после лазерного ИК воздействия. Конфокальные изображения различных каналов флуоресценции, представленные на рис. 5.9д-з, где изображение (д) представляет собой флуоресценцию родамина Б. Изображение (е) представляет собой флуоресценцию красителя FITC, растворенного в 1% агарозном геле. Показано, что вне области лазерного воздействия, флуоресценция инкапсулированного родамина локализована в пределах микроконтейнеров, в то время как флуоресценция красителя FITC в пределах микроконтейнеров не наблюдается, что свидетельствует о том, что водорастворимый родамин Б упакован герметично в полимерные микроконтейнеры ПТМП. В зоне лазерного воздействия наблюдается отсутствие флуоресцентного сигнала от инкапсулированного родамина Б, что свидетельствует об успешном локальном релизе преципитата из повреждённых микроконтейнеров ПТМП. Изображение 5.9з является наложением двух каналов флуоресценции (красный и зелёный) и представляет распределение таких флуоресцентных красителей, как родамин Б и FITC. Высвобожденный родамин В полностью без остатка растворился в геле. Коэффициент диффузии в гидрогеле близок к водной среде, что усложняет задачу визуализации динамики релиза флуоресцентного красителя из повреждённых микроконтейнеров. Однако при лазерном воздействии 5,6 кВт/см2, был зарегистрирован флуоресцентный сигнал красителя родамина, вне границ облучённых микроконтейнеров.
Лазерная адресация
PLA может быть использован в качестве клеточного субстрата клеток C2C12 на своей поверхности, что коррелирует с более ранними исследованиями о развитии хондроцитов на PLA системы и его использованием в качестве имплантационного материала (рисунок 6.1г,д) [154]. Было обнаружено, что клетки распространяются так же, как и на стандартных клеточных ]подложках, и предпочтительно располагаются в областях между микроконтейнерами ПТМП, на плоской поверхности ПТМП (рисунок 6.1). Было обнаружено, что некоторые клетки растягиваются через микроконтейнеры ПТМП МС без существенной деформации, из-за того, что клетки значительно больше ПТМП микроконтейнеров и пространства между ними, соответственно. Данные наблюдения согласуются работами по анализу поведения клетки на подложке [155]. Важно отметить, что случайная миграция клеток C2C12 на ПТМП за 24 часа достигала 15 мкм. Эта скорость движения достаточно мала, что позволяет напрямую соотносить положение клетки с ЗФБ и положение активированного ПТМП микроконтейнера. Как и RhB, DOX может был преципитирован в микроконтейнеры ПТМП и в дальнейшем был использован в качестве модели биологически активного вещества.
При активации ПТМП микроконтейнера DOX воздействует на тетрациклин-зависимые рецепторы генетически модифицированных клеток C2C12, запуская ЗФБ экспрессию. Подобные клетки обладают высокой чувствительностью к DOX [151]. Подобная восприимчивость делает эти клетки надёжным инструментом оценки количество высвобожденных веществ и эффективности направленного воздействия биологически активных компонентов ПТМП. Известно, что подобная система контроля экспрессии генов чувствительна менее чем к 10 пг/мл DOX [151]. Таким образом высвобождение порядка 10 пг DOX из единичного микроконтейнера ПТМП является достаточным для экспрессии ЗФБ единичных клеток (рисунок 6.4 и рисунок 6.5). Клетки, демонстрирующие экспрессию ЗФБ вблизи (расстояние длины клетки) активированного микроконтейнера ПТМП, считаются «положительными», клетки без ЗФБ (на том же расстоянии от МК) считались «отрицательными». Клетки, экспрессирующие ЗФБ, в отдалении от активированных МК, сфитались «ложноположительными» (рисунок 6.5). Из-за высокой чувствительности клеток к DOX, внашем эксперименте не наблюдалось «отрицательных» клеток. 22% клеток были идентифицированы как «ложноположительные», которые, возможно, были привнесены на ПТМП дочерними клетками, содержащими ЗФБ, в их цитоплазме после деления. Клеточный отклик на DOX и, следовательно, разница между ложноположи-тельными и положительными клетками значительна (t-тест p 0,05). Крутой градиент концентрации DOX, который убывает согласно формуле 6.1, отвечает за высокую чувствительность клеток к DOX. где - локальная концентрация, 0 - концентрация источника в МК, а - расстояние от МК. В пределах одного клеточного диаметра (от 10 до 30 мкм в зависимости от диаметра ячейки) концентрация уменьшается в пределах от 2 до 10 относительных единиц. Была проведена оценена ЗФБ флуоресценции клеток ЗФБ на различных концентрации DOX (рисунок 6.5е), а также была проведена оценка относительно ожидаемого высвобождаемого объёма DOX из ПТМП микроконтейнера. Определенная минимальная концентрация DOX для экспрессии ЗФБ соответствует литературе [16;151], в которой была определена концентрация DOX для максимального ответа ЗФБ, после чего жизнеспособность клеток и, следовательно, экспрессия ЗФБ и плотность клеток уменьшались. Было отмечено, что активация МК между двумя клетками способен стимулировать экспрессию гена в обеих клетках.
Установлено, что единичный ПТМП микроконтейнер способен экс-прессировать ЗФБ по меньшей мере в одной клетке. Чтобы избежать высвобождения избыточного количества доксициклина, следует избегать активации нескольких бизлежащих микроконтейнеров и сохранять минимальное расстояние по меньшей мере двух МК друг от друга. В экспериментах активации нескольких соседних МК ПТМП приводило к экспрессии ЗФБ в нескольких не целевых клетках, в поле зрения микроскопа. Этот эффект объясняется тем, что из нескольких МК высвобождается значительное количество DOX. Другие расхождения между позицией флюоресцентных клеток и открытым МК объясняются миграцией клеток, которая может составлять до 15 мкм. Поэтому для определения концентрации экспозиции биологически активного вещества важно учитывать начальную позицию клетки, а не её текущее положение на клеточной подложке.