Введение к работе
Актуальность проблемы. Несмотря на то, что биолюминесценция была открыта более 100 лет назад, интерес ученых к изучению этого явления не только не ослабевает, но и возрастает. Главным образом это обусловлено тем, что в настоящее время биолюминесцентные белки нашли широкое аналитическое применение в различных областях. Поскольку свет с помощью современных регистрирующих приборов может быть измерен с высокой чувствительностью, методы с использованием биолюминесцентных белков позволяют измерять вещества даже ниже 10"18 моля.
Биолюминесценция - явление, широко представленное в природе и присущее многим организмам в различных филогенетических ветвях: от бактерий до рыб. Широко распространены виды, использующие в качестве субстрата биолюминесцентной реакции целентеразин: это мягкий коралл Renilla, креветки Oplophorus, медузы Periphylla, коиеподы Gaussia и Metridia, остракоды Conchoecia, цефалоподы Vampyroteuthis и другие. Наиболее изученными белками, использующими целентеразин в качестве субстрата, являются Са2+-регулируемые фотопротеины, ответственные за свечение ряда морских кишечнополостных организмов.
Все Са2+-регулируемые фотопротеины, исследованные к настоящему времени, демонстрируют высокую степень гомологии как аминокислотных последовательностей, так и пространственных структур. Фотопротеины являются односубъединичными белками (~22 кДа), содержащими три Са2+-связывающих центра «EF-hand» типа. Фотопротеины представляют собой стабильный фермент-субстратный комплекс, состоящий из апофотопротеина, и молекулы органического субстрата - преактивированного кислородом целентеразина (2-гидропероксицелентеразина), который прочно, но нековалентно связан с белком. Связывание ионов кальция с фотопротеином, приводящее к изменению конформации белка, запускает реакцию декарбоксилирования 2-гидропероксицелентеразина, в результате которой образуется целентерамид в возбужденном состоянии и С02. Переход целентерамида из возбужденного состояния в основное сопровождается излучением кванта света.
Предыдущие исследования фотопротеинов были направлены в основном на изучение механизма биолюминесценции, и в данной области был достигнут значительный прогресс. Однако, несмотря на широкое применение рекомби-нантных фотопротеинов, процесс формирования активного фермент-субстратного комплекса из апофотопротеина, целентеразина и кислорода все
еще очень слабо изучен, и его молекулярный механизм по-прежнему остается загадкой.
Выяснение молекулярного механизма формирования активного фотопротеинового комплекса, безусловно, имеет и фундаментальное, и прикладное значение, так как является необходимым шагом в понимании механизма биолюминесценции и, в перспективе, будет способствовать существенному повышению эффективности аналитического применения фотопротеинов, в особенности при их использовании в качестве репортерных молекул in vivo. Цель и задачи исследования. Целью представленной работы являлось исследование процесса образования активного Са2+-регулируемого фотопротеина из апобелка, целентеразина и кислорода, а также функциональной роли отдельных аминокислотных остатков активного центра фотопротеинов в этом процессе. Выполнение данного исследования требовало:
Исследовать кинетические характеристики образования активного фотопротеинового комплекса на примере формирования активного обелина и акворина из апобелка, целентеразина и молекулярного кислорода и разработать математическую модель, описывающую этот процесс.
Для выявления функциональной роли аминокислот целентеразин-связывающей полости в формировании активного фотопротеина методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза получить мутанты обелина и акворина с заменами His 175, Тгр179 и Тугі 90 на остатки с различными донорно-акцепторными свойствами боковых цепей, выделить мутантные белки в гомогенном виде и изучить их основные физико-химические свойства.
При решении поставленных задач были получены новые результаты, которые выносятся на защиту:
Образование активного фотопротеинового комплекса является двухста-дийным процессом, в котором первый этап соответствует формированию комплекса между апофотопротеином и целентеразином и занимает миллисекунды. Вторая стадия соответствует конвертации связанного целентеразина в 2-гидропероксицелентеразин и занимает от нескольких десятков минут до нескольких часов в зависимости от состояния апобелка и условий инкубации с субстратом, что свидетельствует о том, что данная стадия является лимитирующей в образовании активного фотопротеина.
Согласно предложенному механизму образования активного фотопротеинового комплекса, Hisl75 выполняет функцию переносчика протона
от Ы7-атома азота на С2-атом углерода целентеразина, а Туг138 обеспечивает позиционирование молекулы кислорода возле протонированного С2-атома углерода, необходимое для образования 2-гидропероксицелентеразина. Научная новизна и практическая ценность работы. Все результаты, представленные в данной работе, получены впервые и имеют фундаментальный характер, поскольку добавляют новую информацию к пониманию механизма образования активного фотопротеинового комплекса. Кроме того, полученные результаты могут найти применение в прикладных исследованиях. К примеру, возможность управлять процессом образования активного фотопротеинового комплекса чрезвычайно важна для использования фотопротеинов в качестве репортерных молекул in vivo, так как фотопротеины экспрессируются внутри клетки-мишени в форме апобелков и там же конвертируются в форму активного фотопротеина инкубацией с экзогенным целентеразином. Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались на Международных симпозиумах по Биолюминесценции и Хемилюминесценции (Сан-Диего, США, 2006; Шанхай, Китай, 2008; Лион, Франция, 2010), на семинарах лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН, департамента биохимии Университета Вагенингена (Вагенинген, Нидерланды) и Национальной лаборатории Биомакромолекул Института биофизики Китайской академии наук (Пекин, Китай).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ. Структура и объем работы. Работа изложена на 121 странице машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, описание методов исследования, изложение результатов исследования, заключение, выводы и список цитируемой литературы (115 источников). Диссертационная работа проиллюстрирована 35 рисунками, содержит 8 таблиц.
