Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Основные представления о межклеточном транспорте воды в растениях 12
1.1 .Классификация и строение растительных тканей и клеток 12
1.2. Регуляция межклеточного транспорта воды в растениях 15
1.2.1. Роль апопласта 16
1.2.2. Плазмодесмы — регуляторы симпластного пути 17
1.2.3. Трансклеточный путь 20
1.3. Движение цитоплазмы растительной клетки 25
1.4.Неинвазивные методы ЯМР исследования динамических характеристик воды в растениях 28
1.4.1. ЯМР-релаксометрия 28
1.4.2. Диффузометрия 34
1.4.3. Методы анализа корреляции ЯМР-релаксации и диффузии 38
1.4.4. Методы оценки проницаемости мембран 39
1.4.5. Магнитно-резонансная томография 42
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 43
2.1 .Объекты исследования 43
2.1.1. Паренхима плода яблони Malus domestica 43
2.1.2. Корнеплод моркови Daucus carota 45
2.1.3. Корни проса Pennisetum americanum и кукурузы Zea mays 48
2.2. ЯМР-релаксометрия и диффузиметрия 49
2.3.Магнитно-резонансная томография 53
2.4.Математическое моделирование результатов ЯМР-диффузометрии 57
ГЛАВА 3. Водный перенос на уровне клетки. гидродинамические параметры компартментов клетки 61
3.1. Математическое моделирование результатов ЯМР- диффузометрии в растительной клетке 61
3.2.Спин-спиновая релаксация воды в компартментах клеток паренхимы яблока 67
3.3. Корреляция времен спин-спиновой и спин-решеточной релаксации для воды в клетках паренхимы яблока 70
3.4.Исследование трансляционной подвижности воды по компартментам клетки 72
3.5.Определение структурных характеристик клетки по данным ЯМР-диффузометрии 80
3.6.Оценка проницаемости межклеточных водных транспортных путей клетки 82
3.7.Оценка скорости движения воды в цитоплазме 84
3.8.Краткие выводы по главе 86
ГЛАВА 4. Межклеточный водный транспорт в тканях корня по данным магнитно-резонансной томографии 88
4.1 .ЯМР-микроскопия корнеплода моркови 88
4.2. Диффузионный контраст тканей 92
4.3. Проницаемость межклеточных водных транспортных путей в тканях корнеплода 94
4.3.1. Анализ по выделенным областям 95
4.3.2. Анализ в каждой точке матрицы 102
4.3.3. Сравнение методов анализа 105
4.4.Краткие выводы по главе 108
ГЛАВА 5. Проницаемость радиальных водных транспортных путей. сравнительный анализ корней проса и кукурузы 109
5.1.Спин-спиновая релаксация воды в тканях корней кукурузы и проса 109
5.2.Диффузия воды в тканях корней кукурузы и проса 113
5.3 .Влияние осмотического стресса на диффузионную проницаемость межклеточных водных транспортных путей 116
5.4.Температурная зависимость проницаемости межклеточных транспортных путей в тканях корней кукурузы и проса 119
5.5.Сравнение межклеточных транспортных путей в корнях кукурузы и проса по диффузионной проницаемости 121
5.6.Краткие выводы по главе 129
Заключение 131
Выводы 134
Литература 135
- Регуляция межклеточного транспорта воды в растениях
- ЯМР-релаксометрия и диффузиметрия
- Корреляция времен спин-спиновой и спин-решеточной релаксации для воды в клетках паренхимы яблока
- Проницаемость межклеточных водных транспортных путей в тканях корнеплода
Введение к работе
Постановка проблемы и ее актуальность.
Проблема транспорта воды в растениях включает в себя вопросы идентификации путей переноса воды и определения условий их переключения, механизмов движущих сил, транспортных характеристик барьерно-регуляторных структур (клеточные стенки, мембраны, плазмодесмы, цитоскелет, сосудистая система), стоящих на пути движения воды. Решение этих вопросов позволит определить механизмы, обеспечивающие устойчивость растений к условиям водного дефицита — фактору, оказывающему наибольшее влияние на рост и продуктивность растений (Kramer, 1983). Наряду с этим, выявление механизмов регуляции водного транспорта позволит повысить эффективность обезвоживания растительных тканей в процессах переработки и хранения биологической продукции. Однако решение этих вопросов осложняется тем, что вода в растительной ткани движется по различным путям, взаимосвязанным между собой и регулируемым в зависимости от характера движущих сил (Steudle, 2002). Многофакторность проблемы транспорта воды, в свою очередь, определяет повышенные требования к методам исследования, задачам и объекту. При этом следует учитывать, что для экспериментального изучения транспорта воды необходимы методы, работающие на атомно-молекулярном уровне и ненарушающие функционирование водных транспортных каналов, в идеале работающие на интактных растениях. К числу немногих адекватных методов относятся импульсные методы ядерного магнитного резонанса (ЯМР), которые занимают особое место благодаря своей высокой чувствительности и возможности неразрушающего прямого контроля переноса воды и структурных параметров клеток (Анисимов и Раткович, 1992; Van As, 2007). До настоящего времени в большинстве экспериментов применительно к исследованию растений импульсные методы ЯМР используются как «брутто-методы» - в эксперименте регистрируется полный сигнал от всех молекул воды образца. Это приводит к вынужденному игнорированию различий клеток в разных областях образца ткани, в частности, по размеру, форме и степени вакуолизации. В свою очередь, эти параметры определяют время гидравлической релаксации клеток, эффективную трансклеточную проводимость, скорость релаксации ядерной намагниченности воды в компартментах клетки. Таким образом, применение «брутто-метода» приводит к усреднению экспериментально измеряемых характеристик по объему образца ткани, что допустимо только для однородных объектов, а в противном случае — зачастую приводит к многовариантности при интерпретации данных.
Пространственное разрешение сигнала ядерной намагниченности, ставшее возможным с применением магнитно-резонансной томографии (МРТ), снимает, в определенной степени, проблему усреднения. Однако использование техники МРТ сопряжено с рядом трудностей, связанных с широким спектром гетерогенности растительных тканей, как по структурным, так и функциональным параметрам. При исследовании транспорта воды ситуация усложняется динамичностью процессов водного переноса. В результате, на сегодняшний день методам МРТ при исследовании большинства тканей не хватает пространственного разрешения для достижения клеточного уровня и временного разрешения для фиксации быстро меняющихся процессов водного переноса. И, наконец, ограниченная доступность специализированной для исследования растений техники МРТ и, как следствие, недостаточное развитие методик обработки данных диффузионно-взвешенной МРТ усложняет интерпретацию полученных результатов на уровне физиологии растений.
Таким образом, наряду с техникой МРТ необходимо развивать селективные методы ЯМР для контроля водного переноса в тканях. С одной стороны, это расширит возможности метода МРТ применительно к растительным объектам. С другой стороны, позволит на более простом и доступном по сравнению с МРТ оборудовании решать широкий круг задач на клеточном и субклеточном уровнях.
Цель и задачи исследования.
Целью работы являлось: селективное исследование гидродинамических параметров в отдельных компартментах растительных тканей импульсным методом ЯМР.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
Разработка методов исследования гидродинамических и структурных параметров компартментов клетки и межклеточных транспортных путей в растительных тканях на основе импульсных методов ЯМР.
Определение методом математического моделирования условий применимости метода ЯМР-диффузометрии для измерения диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей в растительной ткани.
Селективное исследование методом ЯМР-диффузометрии трансляционной подвижности воды в компартментах вакуолизированной клетки.
Исследование анизотропии диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей в тканях корнеплода моркови (Daucus car ota).
Проведение сравнительного анализа температурной зависимости диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей в корнях растений (Pennisetum americanum и Zea mays), различающихся по устойчивости к водному стрессу, в норме и в условиях осмотического стресса.
Научная новизна работы.
Предложено уравнение, позволяющее в общем случае описать зависимость коэффициента диффузии воды от времени диффузии в пористых (био-)системах и определить параметры, необходимые для расчета диффузионной проницаемости. Продемонстрирована возможность формализации процесса обработки экспериментальных данных ЯМР-диффузометрии, что необходимо для исследования диффузионной проницаемости методом МРТ и для серийных исследований.
Предложен метод оценки скорости потока воды в цитоплазме вакуолизированной клетки с использованием ЯМР-диффузометрии. Определена скорость потока воды в цитоплазме клеток паренхимы яблока.
Получены карты диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей в растительной ткани с использованием диффузионно-взвешенной МРТ на примере корнеплода моркови {Daucus carotd).
На основе карт диффузионной проницаемости установлено различие тканей корнеплода моркови по диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей и обнаружена анизотропия диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей.
При сравнении зерновых культур (кукуруза и просо), различающихся по устойчивости к дефициту воды, в условиях осмотического стресса обнаружено различие кортикальной паренхимы первичных корней: 1) по вкладу симпластного пути в суммарный межклеточный диффузионный перенос воды; 2) по температурной зависимости суммарной диффузионной проницаемости межклеточных водных транспортных путей и диффузионной проницаемости симпластного пути.
Научно-практическая значимость работы.
Разработанные методы анализа трансляционной подвижности воды и полученные в результате исследований данные позволяют проводить исследование функционирования межклеточных водных транспортных путей на уровне ткани, группы клеток, компартментов клетки на интактных растениях. Полученные в ходе работы данные об особенностях температурной регуляции проницаемости межклеточных водных транспортных путей представляют интерес для специалистов в области биофизики и физиологии растений. Изучение реакции симпластного и трансклеточного переноса в ответ на сдвиг водного равновесного состояния осмотическим воздействием позволяет сфокусировать внимание на структурах и регуляторных ответах клеток, отвечающих за приспособляемость растений к дефициту воды. Понимание причин и следствий изменения проницаемости в ответ на изменение уровня водного дефицита создает перспективы для разработки новых технологических приемов оптимизации процесса обезвоживания при переработке и консервации биологической продукции.
Апробация работы.
Результаты диссертационной работы были представлены на 15 зарубежных и российских конференциях, в частности лично автором диссертационной работы на следующих конференциях: XIII Всероссийская конференция «Структура и динамика молекулярных систем» (Йошкар-Ола, 2006); VI съезд общества физиологов растений России (Сыктывкар, 2007); International conference "Modern developments in magnetic resonance imaging and spectroscopy in medicine" (Kazan, 2007); International Conference "Modern Development of Magnetic Resonance" (Kazan, 2007); European Magnetic Resonance Conference EUROMAR (St. Petersburg, 2008); XVI Международная конференция "Математика. Компьютер. Образование" (Пущино, 2009); итоговые конференции Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН (2004, 2006, 2008, 2009).
Публикации.
По материалам диссертационной работы опубликованы 22 работы, в том числе 3 статьи в центральных российских научных журналах и 4 статьи в рецензируемых сборниках трудов конференций.
Структура и объем.
Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. В работе представлено 6 таблиц и 50 рисунков. Список литературы включает 135 источников, из них 14 — отечественных.
Регуляция межклеточного транспорта воды в растениях
От поверхности корня через клетки коры, эндодерму и перицикл вода должна дойти до сосудов ксилемы. Возможны несколько путей транспорта воды и минеральных веществ (рис. 2): 1) апопластный - через клеточные стенки и межклеточное пространство; 2) симпластный путь — через плазмодесмы; он включает в себя движение воды внутри цитоплазматического континуума; как и при транспорте через апопласт здесь не происходит пересечения мембран; 3) вакуолярный (трансклеточный) путь, который включает в себя поток воды через мембраны. Между этими путями существует быстрый обмен воды, и относительный вклад их в общий перенос воды может меняться в зависимости от условий и это носит, по-видимому, компенсаторный характер. Так, согласно модели транспорта воды и растворенных веществ, предложенной Steudle (Steudle, 1997; Steudle and Peterson, 1998), преимущественный вклад того или иного пути в общий поток воды зависит от многих факторов: типа ткани, стадии ее развития, природы движущей силы потока (осмотический или гидростатический), внешних условий. Переключение потоков воды по разным путям может играть важную роль при адаптации растения к неблагоприятным условиям среды и способствовать оптимизации водного режима в этих условиях. Не смотря на то, что средняя площадь поперечного сечения, доступная для апопластного потока воды, составляет только несколько процентов от общей площади поперечного сечения, тем не менее, апопластный поток воды имеет большое значение в тканевом транспорте воды из-за высокой гидравлической проводимости клеточных стенок (Zhu and Steudle, 1991). В корне апопластный путь имеет некоторые особенности. Когда вода, передвигающаяся в клеточных стенках, достигает эндодермы, ее дальнейшему продвижению препятствует водонепроницаемый суберин, который откладывается в клеточных стенках, образуя пояски Каспари. Эти пояски препятствуют передвижению воды по апопласту, и поэтому вода и растворенные в ней соли должны проходить через плазматическую мембрану под контролем цитоплазмы эндодермальной клетки. Полагают, что благодаря этому живые клетки могут регулировать передвижение воды и минеральных солей из почвы в ксилему. Возможно, что этот механизм служит также для защиты от проникновения токсичных веществ, патогенных грибов. Интересно отметить, что даже при плазмолизе цитоплазма эндодермальной клетки не отстает от клеточной стенки в области пояска Каспари, хотя она и сжимается в остальной части клетки.
С возрастом опробковение клеток эндодермы в корне часто усиливается. Это препятствует нормальному выходу воды и минеральных солей через клеточные стенки. Однако в таких стенках могут сохраняться поры в виде плазмодесм и, кроме того, остаются так называемые «пропускные» клетки, у которых не происходит добавочного утолщения стенки и через которые свободно проходит вода и растворенные вещества (Грин и др., 1999). При движении воды и растворенных веществ по симпласту, так же как и в случае апопласта, не происходит пересечения мембран. Согласно симпластической теории, перемещение веществ через корни в значительной степени происходит по плазмодесмам через цитоплазматический континуум. Плазмодесмы - межклеточные контакты растений — имеют достаточно сложную и лабильную структуру. Они представляют собой сквозные межклеточные каналы, выстланные плазматической мембраной, непрерывно переходящей из клетки в клетку (Гамалей, 1996). Средний диаметр канала равен 40-60 нм, на концах которого имеются шейные сужения. В центре канала имеется трубка - десмотубула, состоящая из мембран эндоплазматического ретикулума. Диаметр транспортного канала может меняться благодаря наличию внутри плазмодесм сфинктерного механизма (Курсанов, 1976). Возможны также структурные переходы десмотубулы из открытого состояния в сомкнутое (Гамалей, 1997), что наблюдается под влиянием различных условий.
В настоящее время существует неопределенность относительно гидросопротивления плазмодесм поскольку действительная площадь поперечного сечения доступная для транспорта внутри поры неизвестна. Известна способность плазмодесм изменять свою проницаемость в ответ на изменения тургорного давления. По всей видимости, регуляция проницаемости плазмодесм в ответ на изменения тургора клетки предусмотрена для приспособления растения к физиологическим травмам в результате воздействия стресса или механических повреждений (Roberts and Oparka, 2003). У клеток Nicotiana clevelandii перепад давления между смежными клетками более чем на 200 кПа приводит к прекращению транспорта люциферина (Oparka and Prior, 1992), введенного в клетку микроинъекцией. Однако при меньшей разнице давления частицы красителя продолжают перемещаться между соседними клетками. Перекрывание плазмодесм происходит относительно медленно, по меньшей мере в течение 10 минут, и эффект сохраняется в течение некоторого времени, возможно постоянно. У водоросли Chora corallina разница давления так же приводит к закрыванию плазмодесм, предотвращая дальнейший межклеточный обмен (Ding and Tazawa, 1989; Reid and Overall, 1992). Напротив, у корневых волосков Arabidopsis увеличение тургорного давления за счет микроинъекции масляных капель не вызывает изменений в электрической связи клеток, вероятно свидетельствуя о том, что плазмодесмы закрываются не полностью (Lew 1996). Было показано, что усиление осмотического стресса в тканях так же приводит к изменению проницаемости плазмодесм. Schulz (1995) показал, что увеличение концентрации маннитола приводит к тому, что сокращенное в обычном состоянии шейное сужение плазмодесм расширяется примерно до диаметра центрального участка поры. В листьях Egeria densa площадь сечения шейного сужения плазмодесм так же увеличена в течение 20 часов после плазмолиза (Erwee and Goodwin, 1984). Приведенные выше результаты предполагают, что
ЯМР-релаксометрия и диффузиметрия
Измерения проводились на ЯМР спектрометре с резонансной частотой на протонах 30 МГц под управлением MARAN Ultra console (Resonance Instruments Ltd, Oxfordshire, UK) в поле постоянного магнита. Длительность 90 РЧ-импульса составляла около 15 мкс, время парализации приемника - 20 мкс, максимальное значение градиента магнитного поля в импульсе - 1 Т/м. Релаксационные измерения корней проса и кукурузы проведены так же на ЯМР спектрометре с резонансной частотой на протонах 16 МГц в поле электромагнита. Для измерения времен спин-спиновой релаксации Т2 использовалась стандартная импульсная последовательность Карра-Парселла-Мейбума-Гилла (КПМГ) (Carr and Purcell, 1954; Meiboom and Gill, 1958). Длительность интервала между 180 РЧ-импульсами 2тх устанавливалась равной 200 мкс. Для высушенного образца паренхимы яблока длительность межимпульсного интервала 2ТХ устанавливалась равной 100 мкс, что позволило более точно определить времена Т2 быстрорелаксирующих компонент. Для исследования корреляции Тг-диффузия (RDCOSY) использовалась модифицированная последовательность Стимулированное Эхо (рис. 11 A) (van Dusschoten et al., 1996).
После предварительного диффузионного кодирования сигнала в течение времени td - А - 5/Ъ, где 8 — длительность импульсного градиента G, следует серия рефокусирующих 180 РЧ-импульсов позволяющая измерить релаксацию поперечной намагниченности стимулированного эхо-сигнала. Длительность интервала между 180 РЧ-импульсами 2ТХ устанавливалась равной 800 мкс. При измерении времен спин-решеточной релаксации Г/ использовался нуль-метод (Carr and Purcell, 1954) и методика полного восстановления намагниченности (ПВН). Импульсная последовательность ИВ-КПМГ (Рис. 11 Б) позволяет измерить поперечное затухание намагниченности восстановившегося за время Т сигнала. Для получения продольного затухания намагниченности и определения корреляции времен релаксации ТГТ2 (RRCOSY) использовалось 22 шага значения Т. При измерении времен спин-решеточной релаксации нуль-методом подбирали такое время Т, при котором намагниченность одной из компонент проходит через нуль и не вносит вклад в наблюдаемое релаксационное затухание намагниченности (РЗ). Для измерения коэффициентов самодиффузии с селективным подавлением сигнала от воды в вакуоли использовалась последовательность, аналогичная СТЭ-КПМГ, но с добавлением 180 РЧ-импульса перед всей последовательностью (рис. 11 В). Таким образом, в начале последовательности производилось инвертирование намагниченности. Время Т0 после 180 РЧ-импульса устанавливалось так, чтобы намагниченность протонов воды вакуоли к моменту действия первого 90 РЧ-импульса проходила через нуль. Тогда эта компонента не дает вклада при диффузионных измерениях. Между 2-ым и 3-им 90 РЧ-импульсами в последовательностях СТЭ-КПМГ и ИВ-СТЭ-КПМГ применялся дополнительный импульсный градиент Gcmsh = 25 мТл длительностью 2 мс для подавления сигнала паразитных эхо. На полезный сигнал стимулированного эха импульсный градиент Gcnisi, не оказывает влияние.
В последовательности ИВ-КПМГ импульсный градиент Gcrush применялся для расфазировки сигнала ССИ, возникающего при неточной установке длительности инвертирующего импульса. Разложение РЗ производилось с помощью двух программных продуктов: SplMod и Contin (Provencher, 1982а,б), которые широко применяются для анализа экспериментальных зависимостей (Lens et al., 1997,1999). Программа SplMod, используя модифицированный метод наименьших квадратов Гаусса-Ньютона, выделяет из РЗ задаваемое количество экспонент (до 4-ех). Программа Contin использует обратное Лаплас преобразование и определяет распределение амплитуды сигнала по временам релаксации (Т2-спектр) в задаваемом интервале времен релаксации (в предположении Лоренцевой формы зависимости сигнала от времени для каждого времени релаксации). Карты корреляции времен Т2 и Т\ (RRCOSY) и времени Т2 и КСД (RDCOSY) были получены по результатам измерений методом ИВ-КПМГ и СТЭ-КПМГ соответственно путем двухмерного обратного преобразования Лапласа (Song et al., 2002; Htirlimann et al., 2002). При определении коэффициентов самодиффузии использовались следующие процедуры: 1) Серия релаксационных затуханий, полученных при различных значениях импульсного градиента G, обрабатывалась совместно программой SplMod в представлении, что наблюдаемые времена релаксации Т2 компонент не изменяются при увеличении градиента.
Для каждой Т2-компоненты по зависимости амплитуды сигнала, полученной в ходе разложения РЗ, от значения импульсного градиента магнитного поля определялся коэффициент самодиффузии этой релаксационной компоненты. 2) Релаксационные затухания, полученные при различных значениях импульсного градиента G, обрабатывалась независимо программой Contin. Полученные спектры времен 7г разделялись на две компоненты: медленнорелаксирующий пик и сумма быстрорелаксирующих пиков. Амплитуда компонент определялась по площади пика или сумме площадей нескольких пиков соответственно. Из полученных зависимостей амплитуды от величины градиента G для каждой компоненты определялся соответствующий ей коэффициент диффузии.
Корреляция времен спин-спиновой и спин-решеточной релаксации для воды в клетках паренхимы яблока
Для конкретизации соотнесения релаксационных компонент и соотнесения времен обмена со шкалой наблюдаемых времен релаксации проведен анализ корреляции между временами релаксации Т\ и Г2. На рис. 20 представлен двухмерный график корреляции времен Т\ и Т2, полученный на основе данных эксперимента ПВН (импульсная последовательность ИВ-КПМГ). Из графика видно, что каждая Т2-компонента характеризуется собственным временем релаксации Т\. Данный факт свидетельствует о том, что в масштабе времен Т\ и Т2 в исследуемой системе не наблюдается быстрого обмена между компонентами (а следовательно между компартментами клетки). Данные выводы согласуются с результатами Snaar and Van As (1992a). Наибольшему времени релаксации Т2, относящемуся к воде в вакуоли (компонента а), соответствует время Т\ порядка 1.7 с. При времени восстановления намагниченности Г0=1.2 с (равное Т\ 1п2, см. уравнение 1.4), в РЗ остается вклад только от быстрорелаксирующих компонент (рис. 18, кривая 2; рис. 21), а намагниченность медленнорелаксирующей компоненты а проходит в этот момент через ноль. Тогда характерные времена спин-спиновой релаксации компонент Т2-спектра и их интегральные населенности (в скобках) составляют: Ъ - 0.50 с (52%); с - 0.115 с (39%); /-0.037 с (9%). Полученные значения времени релаксации Т2 быстрорелаксирующих компонент, измеренные при селективном подавлении намагниченности воды вакуоли, хорошо согласуются с результатами анализа релаксационного затухания намагниченности полного сигнала (табл. 3). При Г0=400 мс РЗ практически моноэкспоненциальное (рис. 18, кривая 2) с наклоном, соответствующим времени релаксации Т2 компоненты а. Соответственно намагниченность быстрорелаксирующих компонент проходит через ноль. С целью определить влияние ограничений (мембран клетки) на трансляционную подвижность молекул воды проведена серия диффузионных измерений методом СТЭ-КПМГ при временах наблюдения tj от 12 мс до 4 с. При временах диффузии tj 1с ДЗ неэкспоненциальное (рис. 22). С ростом времени диффузии наклон начального участка (соответственно средний коэффициент диффузии) уменьшается. При временах диффузии более секунды в интервале измеренных амплитуд ДЗ удовлетворительно описывается как моноэкспоненциальное.
Для соотнесения компонент и определения их диффузионных характеристик была использована информация о релаксационном затухании эхо-сигнала. Диффузионные измерения проводились с меньшим отношением сигнал/шум, чем в эксперименте КПМГ. В результате с ростом td наблюдается потеря разрешения (рис. 23 А). На этом рисунке приведены Т2-спектры РЗ-ий эксперимента СТЭ-КПМГ, полученных при значении градиента в импульсе G = О и временах td от 12 мс до 4 секунд. Диффузионно-взвешенные Т2-спектры, представленные на рис. 23 Б, демонстрируют диффузионное подавление компонент за счет импульсного градиента. Положение медленно-релаксирующего пика, соответствующего воде в вакуоли, остается постоянным с центром около значения Тг = 1.25 с для всех исследованных времен td и действующих значений градиента Ь. Анализ корреляции Т2-диффузия позволил при коротких временах диффузии определить значение КСД воды для каждой Т2-компоненты (рис. 23 В). Анализ корреляции времен релаксации Т\ и Г2 подтвердил, что каждой Т2-компоненте в паренхиме яблока можно сопоставить определенный компартмент клетки. Тогда различие Т2-компонент по наблюдаемому коэффициенту диффузии воды, главным образом, связано с различной геометрией компартментов (формой, размером). Из-за низкого отношения сигнал/шум данных эксперимента СТЭ-КПМГ при больших временах диффузии по полученным Т2-спектрам и картам корреляции Т2-диффузия затруднительно точно определить КСД каждой Т2-компоненты.
В данной работе использованы два различных подхода для разрешения этой задачи. В первом случае для всего двумерного массива данных эксперимента СТЭ-КПМГ был проведен анализ корреляции Т2-диффузия методом SplMod в предположении дискретной суммы экспонент (до трех компонент). Этот подход предполагает, что значение Т2 не зависит от величины диффузионно-кодирующего градиента, что справедливо только для медленнорелаксирующей компоненты. Во втором случае каждое отдельно взятое релаксационное затухание из двумерного массива данных эксперимента
Проницаемость межклеточных водных транспортных путей в тканях корнеплода
Для дальнейшего анализа динамических и структурных параметров тканей корнеплода моркови возможны два пути: 1) определение средних значений структурно-динамических параметров для областей клеток корнеплода, характеризующихся близкими свойствами; 2) определение значений структурно-динамических параметров для каждой точки матрицы. В первом случае анализируется суммарное диффузионное затухание от всех точек выделенной области. За счет этого удается увеличить отношение сигнал/шум, что уменьшает погрешность определения коэффициентов диффузии. Во втором случае становится возможным получить детальную информацию о распределении структурно-динамических характеристик по сечению корнеплода. Этот подход не требует изначальных предположений о строении образца и позволяет определять локальные структурные неоднородности. Однако из-за низкого отношения сигнал/шум возрастает погрешность определения коэффициентов диффузии, особенно при больших временах диффузии. Как следствие, возрастает погрешность определяемых значений размера и проницаемости. Следует отметить, что в корнеплоде моркови значительную долю ксилемы и флоэмы составляют паренхимные клетки, окружающие соответственно сосуды и ситовидные трубки (Esau, 1940, 1965; Peterson et al., 2008). Учитывая, что разрешение карт при диффузионно-взвешенной МРТ составило 625x625x3000 мкм3 и значительно превысило размер клетки, размер клетки и проницаемость, определяемые для этих областей, в значительной степени связаны с характеристиками паренхимы и зависят от доли паренхимных клеток в интересующей области. Этот фактор следует принимать во внимание при интерпретации данных.
Используя отличие по плотности протонного сигнала, времени релаксации и значению КСД воды в тканях, на основе Т2-взвешенных и диффузионно-взвешенных карт можно выделить несколько областей корнеплода моркови (рис. 36): водонасыщенная часть ксилемы, слабооводненная часть ксилемы, зона камбиальных клеток, флоэма и кортекс. Зона камбиальных клеток была выделена как светлое кольцо на диффузионно-взвешенной карте плотности протонного сигнала при (d = 1 с и максимальном значении градиента в поперечном направлении корнеплода (рис. 34 Г). Ксилема, расположенная внутри зоны камбиальных клеток была разделена на область с высокой интенсивностью протонного сигнала и область с низкой (близкой к нулю) интенсивностью. Кортекс был выделен по карте времени Гг, как область с более длинными по сравнению с флоэмой и эпидермисом временами релаксации (рис. 33 Б) Для каждой из областей было получено суммарное диффузионное затухание, как сумма затуханий во всех точках этой области. Коэффициент диффузии для выбранной области определялся по начальному наклону суммарного затухания. Для всех областей зависимость коэффициента диффузии от времени диффузии в пределах погрешности является невозрастающей. Уменьшение наблюдаемого коэффициента диффузии свидетельствует о влиянии ограничений на трансляционную подвижность воды в тканях (рис. 37). Это ограничение оказывается в первую очередь со стороны мембран клеток. Наличие суберина в некоторых областях (поясок Каспари) ограничивает движение по апопласту. Клеточная стенка не представляет существенной преграды для диффузии воды. В дальнейшем, аппроксимируя для каждой области зависимость коэффициента диффузии от времени диффузии функцией (3.1) были определены параметры D0, D и R.
Используя уравнение (1.22), в приближении полупроницаемых параллельно-плоских пластин (мембран) была вычислена суммарная диффузионная проницаемость межклеточных водных транспортных путей (Р) (рис. 38, 39; табл. 5). Параметр D0, соответствующий коэффициенту диффузии в пределе коротких времен диффузии, для всех областей практически одинаков и несколько меньше коэффициента диффузии чистой воды (рис. 38 А, 39 А). 5E-10 Рис. 37. Зависимость коэффициента диффузии воды от времени диффузии для различных областей корнеплода моркови в продольном (А) и поперечном (Б) направлениях. На графиках приведены погрешности определения коэффициентов диффузии. 1 - водонасыщенная часть ксилемы, 2 - слабооводненная часть ксилемы, 3 - зона камбиальных клеток, 4 - флоэма, 5 — кортекс. І
