Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 8
I.I. Идентификация мезенхимных стромальных клеток 8
I.2. Мультипотентность МСК 10
I.3. Гетерогенность МСК 10
I.4. Функции МСК
I.4.I. Участие в росте и регенерации тканей 11
I.4.2. Участие в регуляции гемопоэза 12
I.4.3. Участие в регуляции локальных иммунных ответов
I.5. Ионные каналы в МСК человека 14
I.6. Ионные каналы, устанавливающие потенциал покоя 15
I.7. K+ каналы с двумя поровыми доменами (K2P) 16
I.8. Свойства и функции TREK1-канала 19
I.9. Ca2+-активируемые K+ каналы 23
Глава II. Материалы и методы 26
II.I. Выделение МСК из жировой ткани человека и их культивирование 26
II.2. Подготовка клеток к эксперименту 27
II.3. Электрофизиология 27
II.4. Микрофотометрия (Ca2+-imaging) 28
II.5. ОТ-ПЦР 29
Глава III. Результаты исследования 30
III.I. Потенциал покоя и проводимость плазмолеммы МСК 30
III.2. Классификация МСК по кинетике и потенциал-зависимости интегральных клеточных токов 31
III.3. K+ каналы K2P типа, функционирующие в МСК 42
III.3.I. Одиночные каналы на фрагментах мембран МСК в конфигурациях cell-attached и inside-out 44
III.3.2. Характеристика токов одиночных каналов с flickery-burst кинетикой на изолированных фрагментах мембран МСК 47
III.3.3. Идентификация каналов с flickery-burst кинетикой на фрагментах мембран 50
III.3.4. Идентификация активности TREK1 каналов на уровне интегральных токов 62
III.4. Ca2+-активириуемые K+ каналы в МСК 69
Обсуждение 79
Гетерогенность ионных токов в популяции МСК 79
TREK1-каналы в МСК человека 81
Са2+-активируемые К+ каналы в МСК человека 84
Заключение 87
Выводы 91
Список использованных сокращений
- Мультипотентность МСК
- Подготовка клеток к эксперименту
- Классификация МСК по кинетике и потенциал-зависимости интегральных клеточных токов
- Идентификация активности TREK1 каналов на уровне интегральных токов
Введение к работе
Актуальность проблемы
Мезенхимные стромальные клетки (МСК) – это недифференцированные клетки, локализованные в периваскулярном пространстве практически всех органов взрослого организма (Crisan et al., 2008; Corselli et al., 2010). Они участвуют в разнообразных биологических процессах, таких как поддержание гемопоэтических стволовых клеток, регенерация тканей и регуляция локальных иммунных ответов. Эти биологические функции МСК обеспечиваются тем, что популяция этих клеток способна самоподдерживаться путем пролиферации и дифференцироваться в адипоциты, остеобласты, хондроциты и другие клетки. Кроме того, в недифференцированном состоянии МСК могут экспрессировать широкий спектр молекул адгезии, секретировать цитокины и факторы роста и мигрировать в сайты повреждения тканей в ответ на выбрасываемые ими факторы (Kalinina et al., 2011; Nombela-Arieta et al., 2011; Sohni, Verfaillie, 2013; Ma et al., 2014).
Исследования МСК ведутся уже более 40 лет. Подавляющее большинство работ в данной области имеют прикладную направленность и, прежде всего, касаются разработки вопросов, связанных с использованием МСК с целью коррекции нейродегенеративных заболеваний и восстановления поврежденных органов. На сегодняшний день имеются лишь немногочисленные работы в области молекулярной биологии, биофизики и физиологии МСК, особенно на уровне одиночных клеток. В целом выполненные исследования формируют довольно общие и поверхностные представления о рецепторных механизмах, механизмах внутриклеточной сигнализации и электрогенеза, транспортных и регуляторных системах МСК, которые детерминируют фундаментальные физиологические процессы в этих клетках (Ye, 2010; Sun et al., 2007; Sohni, Verfaillie, 2013; Li et al., 2011).
Имеющиеся экспериментальные факты свидетельствуют о значительной роли ионных каналов в регуляции ряда клеточных функций, которые представляются ключевыми в физиологии МСК, такие, как пролиферация, дифференцировка, миграция клеток и трансдукция химических и механических стимулов (Prevarskaya et al., 2007; Pla, Gkikka, 2013; Urrego et al., 2014; Bose et al., 2015). Вполне вероятно, что ионные каналы, функционирующие в МСК, могут играть существенную роль в клеточном гомеостазе и поддержании их плюрипотентности. Между тем, мало что известно о спектре и свойствах ионных каналов, активных в покое и активирующихся при стимуляции этих клеток. Лишь единичные работы были посвящены изучению электрической активности МСК (Heubach et al., 2003; Li
et al., 2011). С другой стороны, в результате многолетних работ в области биофизики и фармакологии ионных каналов в различных дифференцированных клетках и модельных экспрессионных системах в литературе накоплен огромный объем данных о свойствах большинства существующих в природе ионных каналов (Kurachi, North, 2004). Самые разнообразные клетки используют десятки функциональных подтипов ионных каналов, молекулярная природа которых еще более разнообразна, поскольку ионный канал – это обычно мультиолигомерный комплекс субъединиц, часто кодируемых множественными генами. Отсюда ясно, что анализ молекулярных механизмов электрогенеза в МСК – это актуальная и сложная фундаментальная задача в рамках физиологии МСК. Учитывая, что в последнее десятилетие выявлена существенная роль нарушений в структуре и функции ионных каналов в этиологии определенных клеточных и тканевых патологий, исследование ионных каналов МСК несомненно важно и в прикладном отношении. Данная работа представляет собой определенный шаг в направлении расширения существующих представлений о системах ионного транспорта в МСК.
Цели и задачи исследования
Целью данной работы было идентифицировать и исследовать ионные каналы, активные в покоящихся МСК и активирующиеся в ответ на их стимуляцию, на примере K+ каналов с двумя поровыми доменами и Са2+-активируемых K+ каналов.
Решались следующие основные задачи:
-
Оценить базовые электрофизиологические характеристики МСК, включая потенциал покоя, входное сопротивление и потенциал-зависимость ионной проницаемости плазматической мембраны.
-
Идентифицировать ионные каналы, принимающие участие в установлении потенциала покоя в МСК, и, в частности, оценить вклад K+-каналов с двумя поровыми доменами (K2P).
-
Идентифицировать ионные каналы, активируемые при повышении Cа2+ в цитоплазме МСК - внутриклеточного события, инициируемого различными агонистами - и, в частности, изучить Са2+-активируемые K+ каналы.
Научная новизна
В настоящей работе впервые проанализированы базовые электрические характеристики МСК на уровне статистически репрезентативной популяции одиночных клеток. Полученные данные свидетельствуют о функциональной
гетерогенности популяции МСК, которые по своим электрофизиологическим свойствам могут быть отнесены к 4-м группам.
В МСК впервые идентифицированы К+ каналы TREK-1 типа и показано, что они участвуют в установлении потенциала покоя. Изучена активность TREK-1 каналов в различных условиях, в том числе, на уровне одиночных каналов. В частности, установлено, что в МСК поддерживается мода низкой активности TREK-1 каналов.
Впервые обнаружено, что арахидоновая кислота - универсальный вторичный медиатор - вызывает гиперполяризацию практически всех МСК путем активации TREK-1 каналов.
В МСК идентифицированы Са2+-активируемые К+ каналы BK-типа и IK-типа и оценен их вклад в сопряжение внутриклеточных Са2+ сигналов с поляризацией мембраны. Впервые в МСК продемонстрирована активация BK-каналов в ответ на природные агонисты на примере пуринергического агониста АТФ.
Научно-практическая значимость работы
Полученные в работе данные существенно расширяют существующие представления об электрофизиологических характеристиках МСК и о ионных каналах, функционирующих в этих клетках. Модуляторы активности ионных каналов, функционирующих в МСК, могут составить новый пул физиологически активных веществ, способных влиять на их способность к пролиферации, дифференцировке и миграции.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены и обсуждены на 18-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2014) и на Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2015).
По материалам диссертации опубликовано 2 тезиса докладов на международных конференциях и 2 научные статьи в рецензируемых журналах.
Структура и объем диссертации.
Диссертационная работа содержит введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение, заключение, выводы, список использованных сокращений, список литературы и приложение. Работа изложена на 106 страницах, содержит 26 рисунков и 2 таблицы. Список литературы включает 114 источников отечественной и зарубежной литературы.
Мультипотентность МСК
Мезенхимные стромальные клетки (МСК) были открыты в костном мозге вскоре после доказательства существования там гемопоэтических стволовых клеток (Becker et al., 1963). В пионерских исследованиях Фриденштейна на мышах было обнаружено, что при гетеротопической трансплантации строма костного мозга может генерировать клетки костной, хрящевой и жировой тканей, а также ретикулярные клетки (Friedenstein et al.., 1966). Позже было показано, что предшественниками этих дифференцированных клеток в костном мозге являются клетки, морфологически сходные с фибробластами и поэтому названные фибробластными колониеформирующими единицами (Friedenstein et al., 1970). Дальнейшие исследования продемонстрировали, что колонии, полученные из одиночных фибробластных колониеформирующих единиц, способны в условиях культуры пролиферировать, сохраняя способность дифференцироваться в остеобласты, адипоциты и хондроциты (Pittenger et al., 1999). На основе того, что самообновление и мультипотентность — это главные критерии стволовых клеток, а также ввиду способности вновь открытых клеток дифференцироваться в клетки мезенхимного происхождения они были названы мезенхимными стволовыми клетками (mesenchymal stem cells) (Caplan., 1991; Prockop, 1997).
Исследование МСК непосредственно в тканях имеет значительные методологические ограничения (Kalinina et al., 2011). Поэтому основные сведения об этих клетках получены в исследованиях популяций клеток, которые изолируются из различных тканей (костный мозг, подкожная жировая клетчатка, пуповинная вена, Вартанов студень (da Silva Meirelles et al., 2006)) на основе их способности прилипать к пластиковым поверхностям и длительное время сохранять жизнеспособность и пролиферировать в стандартных условиях культивирования (5% СO2, 37 C) (Friedenstein et al., 1970). Принадлежность полученных таким образом клеточных популяций к МСК-типу определяется на основе следующих критериев. Продемонстрированная гистохимическими методами способность этих популяций дифференцироваться в остеобласты, адипоциты и хондроциты (мультипотентность) под действием определенных веществ in vitro. Экспрессия подавляющим большинством клеток данных популяций ( 98%) маркерных антигенов CD105, CD90, CD73 и практически полное отсутствие ( 2%) клеток, обладающих антигенами дифференцированных и гемопоэтических клеток СD45, CD34, CD14 или СD11b, CD79a или СD19, HLA-DR. Последний факт должен быть продемонстрирован методом проточной цитометрии (Dominici et al., 2006).
Между тем, было отмечено, что свойства МСК в культурах сильно варьируют в зависимости от источника и метода выделения и условий культивирования. В частности, было показано, что МСК, изолированные из пуповинной вены, претерпевают постепенную потерю мультипотентности в культуре (Muraglia et al., 2000). Это поставило под сомнение возможность автоматической экстраполяции свойств МСК, поддерживаемых в культуре, на эти клетки в составе ткани. Как следствие этого обстоятельства, для упорядоченья терминологии Международное Сообщество Клеточной Терапии (The International Society of Cell Therapy, ISCT (Vancouver, Canada)) предложило культуральные клетки называть мезенхимными стромальными (МСК), а клетки, идентифицированные в тканях, - мезенхимными стволовыми (Horwitz et al., 2005).
Маркеры, строго специфичные для мезенхимных стволовых клеток, пока не выявлены. Это ограничивает возможность их идентификации в условиях in situ. Лишь в исследованиях последнего десятилетия были предложены подходы для идентификации мезенхимных стволовых клеток в тканях. Было показано, что в костном мозге мыши клетки, экспрессирующие антиген стволовых клеток-1 (Sca-1) и рецептор тромбоцитарного фактора роста- (PDGFR-), удовлетворяют критериям МСК при перенесении их в условия культуры (Morikawa et al., 2009). То же подтверждено относительно клеток, экспрессирующих нестин. Идентификация мезенхимных стволовых клеток по маркерным антигенам CD146, Sca-1 и PDGFR- позволила установить, что эти клетки аккумулируются в непосредственной близости от кровеносных сосудов в костном мозге, коже, поджелудочной железе, сердце и легких (Crisan et al., 2008).
Концепция мультипотентности МСК утвердилась на основе опытов, которые продемонстрировали способность этих клеток дифференцироваться в остеобласты, адипоциты и хондроциты in vitro (Pittenger, 1999), давать начало костной и хрящевой тканям при эктопической имплантации in vivo (Haynesworth et al., 1992; Ashton et al., 1980) и делать вклад в регенерацию костной ткани у лабораторных животных с генетическими заболеваниями костей (Li et al., 2010). В соответствии с рядом работ, МСК способны дифференцироваться во множество других клеточных типов как мезодермального, так и немезодермального происхождения: эндотелиоциты (Oswald et al., 2004), кардиомиоциты (Makino et al., 1999), гепатоциты (Snykers et al., 2009) и нейроны (Arthur et al., 2008; Phinney, Prockop, 2007). Однако концепция, приписывающая МСК клеткам такой широкий диапазон дифференционного потенциала, на данный момент полностью не принята (Nombela-Arrieta et al., 2011). К тому же есть исследования демонстрирующие, что МСК могут интегрироваться в специализированные ткани не только посредством дифференцировки, но и по механизму слияния с дифференцированными клетками (Alvarez-Dolado et al., 2003).
Подготовка клеток к эксперименту
МСК человека выделялись из подкожной жировой клетчатки здоровых доноров (возраст от 31 до 50 лет, n = 18) сотрудниками кафедры Биохимии и молекулярной медицины факультета Фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова. Жировую ткань измельчали и смешивали с растворами ферментов коллагеназы I типа (200 ед/мл) (Worthington, США) и диспазы (40 ед/мл) (Sigma, США) в соотношении объема ткани к объему ферментативного раствора 1:2. Суспензию инкубировали при 37С в течение 30–60 мин, периодически встряхивали. Затем к полученной суспензии добавляли равный объем среды Basal Medium for Undifferentiated Human Mesenchymal Stem Cell (HyClone, США), содержащей 10% Advance Stem Supplement (HyClone) для инактивации ферментов, и центрифугировали при 200g 10 мин. Супернатант и фракцию адипоцитов удаляли. Осадок ресуспендировали и лизировали эритроциты. Полученную суспензию фильтровали через нейлоновые фильтры с размером пор 100 мкм (BD Bioscience, США). Клетки ресуспендировали в среде роста (см. ниже), высаживали в чашки Петри в количестве 100 тыс. клеток/мл и инкубировали при 37С, 5% СО2. На следующий день в чашках меняли среду для удаления неприкрепленных клеток. Выделенные МСК культивировали на пластиковых чашках Петри (Corning, США) и/или в 12-луночном планшете в среде Advance Stem (HyClone) с 10% Advance Stem Supplement (HyClone), 100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина. При достижении 80% монослоя клетки пассировали. Клетки обрабатывали раствором Версена (Sigma) и HyQTase Cell Detachment Solution (HyClone), а затем рассаживали в соотношении 1:4. В экспериментах использовали МСК 2–4 пассажей.
Для подтверждения того, что исследуемые клетки - это мезенхимные стромальные клетки, проводился ОТ-ПЦР анализ экспрессии маркерных генов в РНК, выделенной из популяции исследуемых клеток. Проверялась экспрессия маркера плюрипотентных эмбриональных клеток Sox2, маркера плюрипотентных прогенеторных клеток MCAM и маркеров мезенхимных стволовых клеток: СD73, CD90, CD105. Ампликоны ожидаемого размера не обнаружены для Sox2 (рис. Приложение 1). Таким образом, было доказано, что исследуемые клетки являются плюрипотентными прогенеторными мезенхимными стромальными клетками.
Перед экспериментом клетки культивировались в среде (см. выше) без антибиотика в течение 12 ч. Затем клетки двукратно промывались раствором Версена (Sigma). Для отделения от субстрата клетки инкубировались 3–5 мин в 200 мкл фермента HyQTase (HyClone). Фермент ингибировался добавлением 800 мкл полной ростовой среды и клетки ресуспендировались. Далее клеточная суспензия пипеткой переносилась в электрофизиологическую камеру (Kolesnikov, Margolskee, 1998) с базовых экстраклеточным раствором (см. ниже), инкубировалась там 10 минут для осаждения клеток на стекло. После этого проводились электрофизиологические опыты.
Для регистрации мембранных ионных токов в клетках мы использовали методику patch clamp с применением усилителя Axopatch 200B, ЦАП-АЦП конвертера Digidata 1322A и пакета лицензионных программ pClamp 8.0 (все Axon Instruments, США). Для регистрации интегральных клеточных токов мы использовали конфигурацию Amphotericin B perforated patch. Базовый экстраклеточный раствор, мМ: 135 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES-NaOH, pH 7.4. Базовый пипеточный раствор, мМ: 140 KCl, 1 MgCl2, 0.1 EGTA-NaOH, 10 HEPES-NaOH, Amphotericin B (400 мкг/мл), pH 7.3.
В безнатриевом внешнем растворе 135 мМ NaCl заменялись на 135 мМ NMDGCl. В бесхлорном внешнем растворе 135 NaCl заменялись на 135 мМ NaSO3CH3. Внешние растворы с повышенными концентрациями K+ (KCl, мM: 32, 59, 113) получены путем смешения в соответствующих пропорциях двух экстраклеточных растворов (2 мМ СаСl2) в одном из которых было 140 мМ KCl, а в другом - 140 мМ NaCl, поэтому осмомолярность конечных растворов остается неизменной.
Регистрация токов одиночных каналов проводилась в конфигурациях cell-attached и inside-out в симметричных K+ условиях: 140 мМ [KCl]i / 140 мМ [KCl]o, или ассиметричных K+ условиях: 140 мМ [KCl]i / 5 мМ [KCl]o (условия указаны в тексте). В конфигурации cell-attached электрофизиологическая камера заполнялась базовым экстраклеточным раствором (состав см. выше), а регистрирующая пипетка была заполнена следующими растворами, мМ: 140 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES-NaOH, pH 7.4, или (в ассиметричных K+ условиях) 140 мМ KCl заменялись на 135 мМ NaCl и 5 мМ KCl. В конфигурации inside-out регистрирующая пипетка была заполнена тем же раствором что и в конфигурации cell-attached, а в электрофизиологической камере (то есть с цитоплазматической стороны изолированного фрагмента мембраны) был следующий раствор, мМ: 140 KCl, 1 MgCl2, 0.1 EGTA-NаOH, 10 HEPES-NaOH, pH 7.3.
Для регистрации токов одиночных K+ каналов с двумя поровыми доменами (K2P) в регистрирующую пипетку добавлялся ибериотоксин (IbTX, 250 нM): селективный блокатор Ca2+-активируемых K+ каналов большой проводимости (BK). В опытах в конфигурации inside-out с пониженным pH раствора в камере 0.1 мМ EGTA-NaOH в этом растворе заменялся на 0.1 мМ BAPTA-NaOH. Для повышения концентрации Ca2+ с цитоплазматической стороны мембраны в inside-out использовалась комбинация, мМ: 0.1 EGTA-NaOH, 0.1 СаCl2 (концентрация свободного Са2+ равна 3 мкМ).
Классификация МСК по кинетике и потенциал-зависимости интегральных клеточных токов
Разнообразие типов ионных токов, наблюдаемых в МСК, крайне велико. С целью определенной систематизации этого «хаоса», мы предприняли попытку классификации МСК на основе кинетики интегральных мембранных токов и их потенциал-зависимости.
На первом этапе классификации были выделены следующие группы клеток: клетки с моментально активирующимися токами выходящего выпрямления (обозначение OR) (32 из 68 клеток, 47,0%) (рис. 2a), клетки с потенциал-независимыми токами (обозначение VI) (15 из 68 клеток, 22,0% клеток) (рис. 3a, б, в), клетки с K+ токами задержанного выпрямления (обозначение DR) (13 из 68 клеток, 19,1%) (рис. 4а, б), клетки c K+ токами входящего выпрямления (обозначение IR) (6 из 68 клеток, 8,8%) (рис. 5a, б), клетки с К+ токами задержанного выпрямления и K+ токами входящего выпрямления (обозначение DR and IR) (2 из 68 клеток, 2,9%) (рис. 6a, б).
На втором этапе классификации с целью обнаружить непересекающиеся подгруппы внутри вышеназванных групп мы построили в одной системе координат I-V-характеристики нормированных токов (I/Imax – V) для клеток из каждой группы по отдельности. Это позволило увидеть, что в группах клеток VI, DR и IR I-V-характеристики разделяются на подгруппы. Для каждой подгруппы были рассчитаны средние значения и стандартные отклонения нормированных токов (I/Imax) при разных потенциалах. Отсутствие пересечений между данными подгруппами видно по тому, что разбросы (средние значения ± стандартные отклонения) вольт-амперных характеристик разных подгрупп не перекрываются в отдельных областях отрицательных потенциалов (рис. 3a, 4a, 5a).
Из вольт-амперной характеристики клеток группы OR (рис. 2а) видно, что клетки этой группы имеют потенциалы реверсии в интервале от -40 до -80 мВ. Что говорит о значительной неоднородности этой группы. Однако вольт-амперные характеристики отдельных клеток данной группы не разделяются на подгруппы.
Характеристика МСК человека с моментально активирующимися токами выходящего выпрямления (группа OR). а. – I-V-характеристики клеток группы OR, n=29 (cреднее ± стандартное отклонение). На вставке – репрезентативная серия токов в ответ на серию импульсов от -100 мВ до +60 мВ при поддерживаемом потенциале -60 мВ. б. – эффект 20 мM TEA на интегральные клеточные токи данной группы клеток. Показаны I-V характеристики токов в контроле (белые кружки), на фоне 20 мM TEA (черные треугольники) и после его удаления из экстраклеточного раствора (белые квадраты); n=4 (cреднее ± стандартное отклонение). в. – эффект замены экстраклеточного Na+ (140 мM NaCl) на непроникающий NMDG+ (140 мM NMDGCl) на интегральные клеточные токи данной группы клеток. Показаны I-V-характеристики токов в контроле (белые кружки), в отсутствие экстраклеточного Na+ (черные треугольники) и после возвращения контрольных условий (белые квадраты); n=1. г. – эффект замены экстраклеточного Cl- (140 мM NaCl) на непроникающий SO3CH3 34 (метансульфонат) (140 мM NaSO3CH3) на интегральные клеточные токи данной группы. Показаны I-V-характеристики токов в контроле (белые кружки), в отсутствие экстраклеточного Сl- (черные треугольники) и после возвращения контрольных условий (белые квадраты); n=4 (cреднее ± стандартное отклонение).
Рис. 3. Характеристика МСК человека с потенциал-независимыми токами (группа VI). a – I-V-характеристики клеток 2 подгрупп (способ разделения клеток на подгруппы описан в тексте) (VI1 – черные кружки, n=5; VI2 – черные треугольники. n=10 (cреднее ± стандартное отклонение)) группы VI. б, в. – репрезентативные серии токов подгрупп VI1 (б) и VI2 (в) (протокол поляризации смотри в подписи к рис. 2). Пунктирной линией показан уровень нулевого тока. г. - эффект замены экстраклеточного Na+ (140 мM NaCl) на непроникающий NMDG+ (140 мM NMDGCl) на интегральные клеточные токи данной группы клеток. Показаны I-V-характеристики токов в контроле (белые кружки), в отсутствие экстраклеточного Na+ (черные треугольники) и после возвращения контрольных условий (белые квадраты). На вставке увеличена область отрицательных потенциалов. n=1. д. – тот же опыт с клетками подгруппы VI2. Показаны I-V характеристики клеточных токов в контроле (белые кружки), в отсутствие экстраклеточного Na+ (черные треугольники) и после возвращения контрольных условий (белые квадраты), n=6 (cреднее ± стандартное отклонение).
Чтобы оценить величины K+, катионной и анионной проводимостей, использовались соответственно блокатор K+ каналов TEA (20 мM), удаление экстраклеточного Na+ путем его замены на непроникающий ион NMDG+ и удаление экстраклеточного Cl- путем его замены на непроникающий ион CH3SO3- (метансульфонат-анион).
У OR-клеток не обнаружено анионной проводимости, так как вольт-амперные характеристика клеток в контрольных (140 мM Cl-) и опытных (140 мM CH3SO3-) условиях не отличаются (рис. 2д). Также видно, что выходящий ток содержит TEA-чувствительную K+ компоненту (рис. 2б). При удалении экстраклеточного Na+ наблюдается уменьшение входящего того и смещение потенциала реверсии влево (рис. 2в), что свидетельствует вкладе неселективной катионной проводимости в установление потенциала покоя в данной группе клеток.
МСК из групп VI (рис.3) , DR (рис.4) и IR (рис.5) разделяются на непересекающиеся подгруппы. Группа VI разделяется на 2 подгруппы (рис. 3а, б, в): VI1 (5 из 68 клеток, 7,4%), VI2 (10 из 68 клеток, 14,7%). Группа DR разделяется на 3 подгруппы (рис. 4a): DR1 (5 из 68 клеток, 7,4 %), DR2 (5 из 68 клеток, 7,4 %), DR3 (2 из 68 клеток, 2,9%). Группа IR разделяется на 2 подгруппы (рис. 5a): IR1 (3 из 68 клеток, 4,4%), IR2 (3 из 68 клеток, 4,4%). Как можно видеть из приведенных данных, источником этого разделения для всех названных групп клеток является моментально активирующийся и моментально деактивирующийся потенциал-независимый ток. У клеток с более выраженной данной компонентой потенциалы реверсии находятся правее, чем у клеток, у которых данная компонента менее выражена. Это позволило предположить, что данная компонента является катионной. Действительно, опыт с удалением Na+ из внешнего раствора во всех перечисленных группах клеток обнаруживает уменьшение входящих токов и смещение потенциалов реверсии влево, что указывает на присутствие катионной проводимости (рис. 3г, д; рис. 4г; рис. 5д). Причем клетки из подгрупп с более выраженной потенциал-независимой компонентой токов при удалении внешнего Na+ приобретают I-V-характеристики подгрупп, в которых эта компонента менее выражена. Это можно наблюдать в опытах с клетками подгруппы VI2, которые в безнатриевом внешнем растворе приобретают вольт-амперную характеристику токов подгруппы клеток VI1 (рис. 3д); в клетках подгруппы DR2, которые в том же опыте приобретают вольт-амперную характеристику клеток подгруппы DR1 (рис. 4г); и в клетках подгруппы IR2, которые под действие удаления внешнего Na+ приобретают вольт-амперную характеристику клеток подгруппы IR1 (рис. 5д).
Идентификация активности TREK1 каналов на уровне интегральных токов
Вряд ли прохождение по клеточному циклу является единственной вероятной причиной широкой вариабельности электрофизиологических характеристик МСК, наблюдавшейся в наших экспериментах. Так, в соответствии с данными, полученными ранее в нашей лаборатории с использованием микрофотометрии (Kotova et al., 2014), популяция МСК содержит множественные малочисленные (2-5%) субпопуляции клеток, способных отвечать лишь на 1-2 природных агониста мобилизацией внутриклеточного Са2+. Небольшая субпопуляция клеток генерирует спонтанные Са2+ осцилляции. Такое разнообразие функциональных фенотипов трудно объяснить лишь клеточным циклом, на основании которого скорее можно ожидать существование 4 основных функциональных классов. Думается, что еще одной причиной наблюдаемой функциональной гетерогенности популяции МСК является ее неоднородность с точки зрения клеточных фенотипов. Вполне возможно, что в популяции МСК предсуществуют субпопуляции клеток, в которых генетически заложена способность дифференцироваться лишь в несколько клеточных типов. Так, для электрически невозбудимых МСК существование клеток с потенциалами покоя, близкими к равновесному K+ потенциалу (левее -70 мВ), является неожиданным результатом. В семействе дифференцированных клеток столь сильная гиперполяризация в покое характерна лишь для возбудимых клеток, например, нейронов. Возможно, данный подтип МСК составляет особую функциональную субпопуляцию. Тоже можно сказать и о популяции клеток c K+ токами входящего выпрямления. Из литературы известно, что экспрессия классических K+ каналов входящего выпрямления (подсемейство Kir2) преимущественно ограничена возбудимыми клетками. Вполне вероятно, что МСК с Kir-токами могут быть предшественниками возбудимых клеток.
В нашей работе были получены многочисленные доказательства того, что в МСК человека функционируют K+ каналы TREK-1 типа. Присутствие TREK-1 каналов на каждом исследованном фрагменте мембраны свидетельствует о довольно высоком уровне их экспрессии, причем в подавляющем большинстве клеток. Кроме того, низкая активность TREK-1 каналов на фрагментах в составе целой клетки в сравнении с изолированным фрагментом указывает на то, что в покоящихся МСК TREK-1 канал регулируется некими, пока неизвестными, внутриклеточными факторами. Последние подавляют активность TREK-1 канала в покоящейся клетке, но после отрыва фрагмента мембраны очевидно теряются, что приводит к существенному увеличению вероятности открытого состояния. Этот факт указывает на то, что установление потенциала покоя не является единственной функцией TREK-1 в МСК. По-видимому, этот канал также может быть вовлечен в гиперполяризацию клеток в ответ на определенные стимулы. Одной из возможностей является активация TREK-1 каналов в МСК под действием внешних сигналов, трансдукция которых сопровождается увеличением продукции арахидоновой кислоты – одного из универсальных внутриклеточных регуляторов. В подтверждение этому нами впервые было обнаружено, что экстраклеточная аппликация арахидоновой кислоты вызывает значительную гиперполяризацию (в среднем на 40 мВ) практически в каждой МСК.
В ранее опубликованных работах сообщалось об обнаружении в МСК транскриптов гена KCNMA1 (BK), указывая на то, что K+ каналы BK типа могут быть функциональны в этих клетках (Heubach et al., 2003; Li et al., 2005; Bai et al., 2007; Park et al., 2007; Liu et al., 2008). Однако, в этих исследованиях не была продемонстрирована активация BK каналов внутриклеточным Са2+ и их активность не анализировалась на уровне одиночных каналов. В нашей работе были получены физиологически целесообразные ответы МСК при участии ВК каналов. Так, нами впервые была продемонстрирована Ca2+-зависимая гиперполяризация в МСК и показан вклад BK каналов в этот процесс. По аналогии с другими клеточными системами можно думать, что в МСК BK-каналы детерминируют Са2+-зависимую гиперполяризацию в ответ на различные агонисты, инициирующие мобилизацию внутриклеточного Сa2+. В подтверждение этой идеи нами впервые продемонстрировано, что экстраклеточный АТФ, стимулирующий Cа2+-сигнализацию в МСК P2Y-рецептор опосредуемым образом, способен активировать BK-каналы. Помимо этого, нами впервые были зарегистрированы токи одиночных BK каналов и продемонстрировано непосредственное влияние ионов Са2+ на их активность.
С использованием ингибиторного анализа нами было показано, что в небольшой ( 10%) субпопуляции МСК функционируют Са2+-активируемые каналы как BK, так и IK1-типа. Функциональная экспрессия последних в МСК впервые показана в нашей работе. Несмотря на присутствие BK каналов, Са2+-зависимая гиперполяризация в IK1-положительных МСК опосредуется преимущественно IK1 каналами.
В завершении отметим, что несмотря на электрофизиологическую гетерогенность популяции МСК, нами были выявлены два инварианта – это К+ каналы TREK1 и BK типов, которые функциональны фактически в каждой клетке. Можно думать, что по мере прогресса в дальнейших биофизических и молекулярных исследованиях МСК группа таких ионных каналов будет расширена. Это позволит очертить базовый электрофизиологический фенотип МСК, подобно тому, как это сделано для нейрональных, глиальных и мышечных клеток.