Введение к работе
Актуальность темы
Система свертывания крови обеспечивает остановку кровотечения при повреждении кровеносного сосуда. Образование гемостатического сгустка происходит в несколько этапов: сужение просвета сосуда, образование тромоцитарного агрегата на месте повреждения и укрепление сгустка, состоящего из клеток крови, полимерной сетью фибрина. Нарушения в работе каждого из этих звеньев могут привести к тромбозу или кровотечению. Активация системы свертывания происходит на поверхности поврежденного сосуда, однако при дальнейшем росте сгустка процесс идет уже без непосредственного контакта с активирующей поверхностью.
Формирование полимерной сети фибрина, удерживающей клетки крови, происходит в результате работы каскада ферментативных реакций – системы плазменного свертывания. Это запутанная система сериновых протеаз, кофакторов и ингибиторов, в которой существует, по крайней мере, шесть положительных и отрицательных обратных связей. На финальном этапе происходит образование и полимеризация мономеров фибрина, полученных из нерастворимого белка фибриногена путем частичного протеолиза тромбином.
Тромбин является ключевым элементом системы свертывания, который
выполняет как прямую функцию гемостаза – образование фибриновой сети и
активацию тромбоцитов, так и регуляторную - активацию факторов,
обеспечивающих положительные и отрицательные обратные связи в системе. Кроме того, тромбин играет важную роль в процессе восстановления тканей.
Нарушения системы свертывания, вызванные дефицитом белков
свертывающей системы - факторов VIII, IX и XI - приводят к неконтролируемым кровотечениям. Они связаны с недостаточным образованием фибрина во внутренней области сгустка не контактирующей с активирующей поврежденной поверхностью кровеносного сосуда. Таким образом, для исследования процессов,
происходящих при образовании фибринового сгустка необходимо учитывать пространственную неоднородность процесса.
Важность положительных и отрицательных обратных связей в процессе распространения свертывания в пространстве была подтверждена теоретически и экспериментально. Теоретически было предсказано существование автоволны концентрации тромбина в крови, которая в рамках данного представления является активной средой. Однако до сих пор эта гипотетическая автоволны тромбина не наблюдалась экспериментально. Образование фибрина легко исследовать в эксперименте, так как образование полимерной сети можно наблюдать по светорассеянию. Но до настоящего момента было невозможно восстановить пространственно-временное распределение тромбина внутри растущего сгустка и определить форму возможной автоволны.
Существует метод исследования динамики активации тромбина в гомогенной системе, однако в такой постановке превращение всего доступного фибриногена в фибри и образование сустка происходит при достижении концентрацией тромбина уровня менее 5% от максимального. Таким образом, остается неясным, зачем производится такое количество «лишнего» тромбина. Ответ на этот вопрос может быть найден в рамках рассмотрения процесса роста сгустка в пространственно неоднородной системе.
Методика, позволяющая исследовать пространственную динамику тромбина в процессе формирования сгустка, даст возможность исследовать процессы регуляции системы свертывания на совершенно новом уровне.
Цель работы
Исследовать пространственную динамику генерации тромбина в процессе роста фибринового сгустка в плазме крови
Задачи исследования
1. Создание экспериментальной методики, позволяющей регистрировать пространственно-временное распределение тромбина
2. Исследование характера пространственной динамики тромбина в плазме
крови
-
Выявление ключевых факторов, определяющих динамику тромбина в плазме
-
Исследование влияния тромбоцитов на динамику тромбина
Научная новизна
В результате работы создана уникальная экспериментальная методика,
позволяющая регистрировать пространственно-временное распределение
активности протеолитического фермента. Было впервые непосредственно показано, что движущей силой роста фибринового сгустка в пространстве является автоволна концентрации активного тромбина, которая может распространяться в крови. Были найдены ключевые факторы, обеспечивающие существование этого феномена и изучена его регуляция.
Научно-практическое значение
Созданная методика может быть использована для исследования
пространственно-временного распределения ферментативной активности различных протеаз. Кроме того, разработанный метод может являться чувствительным методом диагностики нарушений плазменного и тромбоцитарного звеньев гемостаза. Также он может быть использован для исследования механизмов действия и эффективности препаратов, применяющихся для терапии врожденных и приобретенных нарушений системы свертывания.
Положения, выносимые на защиту
1. Разработана экспериментальная методика для исследования
пространственно-временного распределения активности тромбина в процессе роста
фибринового сгустка в плазме крови
2. Экспериментально показано, что распространение активности тромбина в
пространстве обладает свойствами автоволны в активной среде
3. Показано, что формирование автоволны определяется составом плазмы, т.е.
присутствием белков, обеспечивающих положительные обратные связи в системе и
фосфолипидной поверхности, необходимой для протекания реакций каскада плазменного свертывания
4. Показано, что ограничение распространения автоволны в пространстве обеспечиавется работой пути протеина С в присутствии кофактора тромбина – тромбомодулина
Апробация работы
состоялась 01 ноября 2013 г. на заседании межлабораторного семинара в федеральном бюджетном учреждении науки центре теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН.
Результаты работы представлены на научных конференциях: 5-я Всероссийская конференция "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии" (Москва, 3-5 февраля 2011), XXIII Congress of the International Society of Thrombosis and Haemostasis (Киото, Япония, 23-28 июля 2011), IV Съезд биофизиков России (Нижний Новгород , 20-26 августа 2012 г), American Society of Hematology Annual Meeting (Атланта, США 8-11 декабря, 2012), 6-я Всероссийская конференция "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии" (Москва, 31 января - 02 февраля 2012), XXIV Congress of the International Society of Thrombosis and Haemostasis (Амстердам, Нидерланды, 29 июня – 04 июля 2013).
Публикации
По материалам диссертационной работы опубликовано 9 научных работ. Статей в рецензируемых журналах – 2, в трудах конференция и съездов - 7
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 — обзора литературы, главы 2 — описания материалов и методов, главы 3 — описания результатов, и главы 4 — обсуждения результатов), выводов и библиографического указателя, включающего 132 источника.
