Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 18
1.1. Гипоксия и ишемия головного мозга. Причины и последствия . 18
2. Основные гипотезы внутриклеточного сенсора кислорода. Пути трансдукции сигналов. 21
2.1. Молекулярные механизмы чувствительности нейронов мозга к локальной гипоксии. 25
2.1.1. Классификация нейронов. Глутаматергические и ГАМКергичсекие нейроны в условиях гипоксии/ишемии. 28
2.2. Астроциты как сенсор локальной гипоксии и ишемии мозга. 32
3. Кальциевый гомеостаз и Са2+-сигнализация в клетках. 37
4. Молекулярные и клеточные механизмы клеточной гибели. Роль воспаления. 44
4.1. Роль ионов кальция в повреждении клеток. 44
4.2. Гибель клеток мозга при гипоксии/ишемии и защитные сигнальные каскады. 45
4.3. Вклад глутаматных и ГАМК-рецепторов в гибель нейронов при гипоксии/ишемии. 48
4.3.1. NMDA-рецепторы. Структура, функции и роль в повреждении нейронов при гипоксии/ишемии. 49
4.3.2. АМРА-рецепторы. Структура, функции, роль в нейропластичности и повреждении нейронов. 55
4.3.3. Каинатные рецепторы. Роль в гипервозбуждении и повреждении нейронов при ишемии. 59
4.3.4. Тормозные ГАМК-рецепторы. Строение, классификация, сигнализация в норме и в условиях гипоксии. 60
5. Механизмы защиты клеток мозга от повреждения при гипоксии/ишемии. 67
5.1. Эндогенные нейропротекторные механизмы. Гипоксическое прекондиционирование. 68
5.1.1. Фактор, индуцируемый гипоксией (HIF), в формировании устойчивости клеток мозга к гипоксии 75
5.1.2. Кальций-связывающие белки в качестве эндогенного нейропротекторного механизма. Защитная роль в ГАМКергических нейронах. 77
5.1.3. Нейротрофические факторы и нейропротекция. Защитное действие мозгоспецифического нейротрофического фактора (BDNF). 84
5.2. Фармакологическое прекондиционирование нейронов мозга. 90
5.2.1. Механизмы защитного действия антиоксидантов и антиоксидантных ферментов. 91
5.2.2. Адренергические рецепторы в мозге и их вклад в нейропротекторные механизмах при гипоксии/ишемии. 95
5.2.3. Противовоспалительные цитокины и нейропротекция. Защитное действие интерлейкина-10. 99
Глава 2. Материалы и методы исследования 104
2.1. Нейроглиальные культуры клеток различных отделов мозга. 104
2.2. Приготовление и культивирование органотипических культур ствола мозга крыс. 105
2.3. Приготовление острых срезов вентральной поверхности ствола мозга. 105
2.4. Флуоресцентная и конфокальная флуоресцентная микроскопия. 106
2.5. Окрашивание внутриклеточных АТФ-содержащих компартментов астроцитов. 108
2.6. Регистрация динамики АТФ-содержащих везикул астроцитов с помощью флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF). 108
2.7. Иммуноцитохимический метод. 109
2.8. Анализ выживаемости клеток мозга in vitro. 110
2.9. Аденоассоциированый вектор для экспрессии BDNF. 111
2.10. Конфокальная микроскопия высокого разрешения для регистрации везикулярной секреции BDNF. 112
2.11. Анализ изображений и статистическая обработка данных. 113
2.12. Создание in vitro кратковременных эпизодов гипоксии-реоксигенации. 113
2.13. Создание условий, подобных ишемии (кислородно-глюкозная депривация, OGD). 114
2.14. Моделирование эксайтотоксического действия глутамата (GluTox) in vitro. 114
2.15. Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ). 115
2.16. Использование мышей с мутациями транскрипционного фактора Sip1. 115
2.17. Двухфотонная микроскопия in vivo. 116
2.18. Моделирование фокальной ишемии мозга крыс (MCAO). 117
Глава 3. Результаты и обсуждение 119
3.1. Молекулярные и клеточные механизмы функциональной чувствительности клеток мозга к гипоксии . 119
3.1.1. Астроциты как сенсор кислорода в мозге. 121
3.1.1.1. Внутриклеточные пути трансдукции сигналов в астроцитах при гипоксии. 123
3.1.1.2. Роль везикулярной секреции АТФ астроцитами в гипоксическом ответе и передаче сигнала. 126
3.1.2. Чувствительность нейронов к снижению рО2. Популяции глутаматергических и ГАМКергических нейронов в условиях гипоксии. 128
3.1.2.1. Механизмы внутриклеточной сигнализации в нейронах во время гипоксии. 132
3.2. Селективное повреждение и гибель некоторых популяций ГАМКергических нейронов во время гипоксии. 136
3.2.1. Механизм формирования постгипоксического гипервозбуждения в нейронах. 141
3.3. Эндогенные защитные механизмы нейронов мозга при гипоксии. Способы активации. 149
3.3.1. Гипоксическое прекондиционирование. Механизмы формирования в глутаматергических и ГАМКергических нейронах. 149
3.3.2. Нарушение механизмов гипоксического прекондиционирования NMDA- рецепторов нейронов коры мозга при мутации транскрипционного фактора Sip1. 157
3.3.2.1. Мутация транскрипционного фактора Sip1 нарушает механизмы гипоксического прекондиционирования АМРА-рецепторов в нейронах коры мозга. 163
3.3.2.2. Интерлейкин-10 усиливает нейропротекторный эффект эпизодов гипоксии в нейронах ствола мозга и активирует феномен быстрого гипоксического прекондиционирования АМРА-рецепторов нейронов коры мозга Sip1fI/fI-мышей. 169
3.3.2.3. Нейропротекторные эффекты интерлейкина-10 реализуются за счет изменения экспрессии GluA2-субъединиц АМРА-рецепторов. 172
3.3.3. Кальций-связывающие белки как эндогенный нейропротекторный механизм ГАМКергических нейронов. 181
3.3.4. Нейротрофические факторы мозга в активации гипоксического прекондиционирования ГАМКергических нейронов. Базовая и вызываемая гипоксией экспрессия генов. 186
3.3.4.1. Сверхэкспрессия BDNF защищает клетки гиппокампа от гибели при ишемии . 194
3.3.4.2. Сверхэкспрессия BNDF изменяет базовую и индуцированную гипоксией экспрессию генов, вовлеченных в формирование гипоксического прекондиционирования. 200
3.4. Ишемия и гибель клеток. Ишемия (OGD) оказывает различное действие на Са2+-динамику нейронов гиппокампа. 210
3.4.1. Глутаматергические и ГАМКергичсекие нейроны в условиях ишемии (OGD). Са2+-динамика и продукция АФК. 212
3.5. Эндогенные механизмы защиты клеток мозга от повреждающих факторов ишемии. 217
3.5.1. Защитные эффекты кальций-связывающих белков ГАМКергических нейронов при ишемии. 218
3.5.2. Нейропротекторное действие нейротрофического фактора мозга (BDNF) при ишемии и токсичности глутамата. 224
3.5.2.1. Сверхэкспрессия BDNF в нейронах гиппокампа ингибирует процессы апоптоза и некроза через PI3K-зависимый сигнальный каскад. 226
3.5.2.2. BDNF усиливает экспрессию генов, кодирующих защитные белки, и снижает уровень провоспалительных факторов. 231
3.5.2.3. Сверхэкспрессия BDNF регулирует активность и уровень экспрессии возбуждающих глутаматных и тормозных ГАМК-рецепторов. 234
3.5.2.4. Везикулярная секреция BDNF нейронами гиппокампа при OGD и глутаматной токсичности. 240
3.5.2.5. Ингибирование механизмов везикулярной секреции отменяет нейропротекторное действие BDNF при ишемии. 244
3.6. Активация нейропротекторных механизмов нейронов мозга с помощью противовоспалительного цитокина – ИЛ-10, антиоксидантов и агонистов 2 адренергических рецепторов при ишемии. 254
3.6.1. Защитное действие противовоспалительного цитокина – интерлейкина-10 при ишемии. Эффект на OGD-индуцированные Са2+-сигналы клеток гиппокампа и их гибель. 257
3.6.2. Механизмы нейропротекторного действия антиоксиданта – таксифолина. Эффекты на глутаматергические и ГАМКергические нейроны гиппокампа при ишемии. 261
3.6.2.1. Таксифолин подавляет продукцию АФК в ГАМКергических нейронах при OGD. 261
3.6.2.2. Таксифолин препятствует OGD-индуцированной гибели нейронов в сети. 264
3.6.2.3. Долгосрочные эффекты таксифолина направлены на изменение экспрессии белков, регулирующих антиоксидантные системы и нейропротекторные пути сигнализации нейронов. 269
3.6.3. Механизмы нейропротекторного действия активаторов 2-адренергических рецепторов при ишемии. 279
3.6.3.1. Агонисты 2-адренергических рецепторов оказывают антиапоптотическое действие во время OGD и реоксигенации. 281
3.6.3.2. Агонисты 2-адренергических рецепторов подавляют OGD-индуцированный воспалительный процесс в нейроглиальной культуре. 285
3.6.3.3. Агонисты 2-адренергических рецепторов вызывают секрецию ATP астроцитами и подавляют гипервозбуждение нейрональных сетей. 288
3.6.4. Усиление защитных свойств противовоспалительного цитокина – ИЛ-10 с помощью пероксиредоксина-6 и гуанфасцина при фокальной ишемии головного мозга (МСАО). 293
Заключение 296
Выводы 304
Список цитированной литературы 306
- Гипоксия и ишемия головного мозга. Причины и последствия
- Молекулярные и клеточные механизмы функциональной чувствительности клеток мозга к гипоксии
- Сверхэкспрессия BDNF защищает клетки гиппокампа от гибели при ишемии
- Усиление защитных свойств противовоспалительного цитокина – ИЛ-10 с помощью пероксиредоксина-6 и гуанфасцина при фокальной ишемии головного мозга (МСАО).
Гипоксия и ишемия головного мозга. Причины и последствия
Человек не испытывает дискомфорта при насыщении артериальной крови кислородом на 90–95%, тогда как снижение этого показателя до 56% является критическим, а дальнейшее падение уровня О2 может приводить к гибели организма (Berre et al., 1999; Акопян и др., 2002). Изменения общего состояния у людей отмечается при подъеме на высоту 2000–2500 м и выражается в появлении слабости, головной боли, иногда тошноты (Радзевич и др., 2001; Schultz et al., 2014). Для неподготовленных людей подъем на 3000 м является предельной высотой, на которой они способны сохранять способность к умственной деятельности. При этом величина парциального давления кислорода (рО2) в окружающем воздухе составляет около 60 мм.рт.ст. (Barak et al., 2001). Наиболее выраженные изменения в состоянии человека наблюдаются при достижении высоты 5000–8000 м, которые проявляются в виде одышки, тахикардии, выраженной головной боли, застоя крови в обоих кругах кровообращения и даже нарушениями психики (Семенов и др., 2012; Urner et al., 2012).
Гипоксия на организменном уровне представляет собой состояние со сниженным уровнем обеспечения органов молекулярным кислородом или с проблемой утилизации углекислого газа в ходе осуществления внутриклеточных окислительно восстановительных реакций (Стасюк, 2012; Eldridge et al., 2006). В большинстве случаев дефицит кислорода рассматривается как патологический фактор. Организм человека может испытывать влияние физиологической гипоксии также в различных нормальных ситуациях – в мышцах во время их длительного сокращения (Лябах и Маньковская, 2008; Verges et al., 2010), в коре головного мозга и гиппокампе во время длительной и напряженной мыслительной деятельности (Бурых и Сергеева, 2008; Brambrink and Orfanaki, 2010), а также при увеличении функциональной нагрузки органов с относительно низким уровнем метаболизма (почках, печени, ЖКТ и др.) (Васильев и др., 2009; Sun et al., 2014). Гипоксия подразделяется на 4 основные вида:
1) Гипоксическая гипоксия (гипоксемия или артериальная гипоксемия) – недостаточное содержание кислорода в артериальной крови, происходящее при низком напряжении кислорода, когда гемоглобин не насыщается кислородом полностью.
2) Гемическая гипоксия (анемическая гипоксия) связана с недостатком гемоглобина при анемии или при неспособности гемоглобина связывать кислород (отравление СО2, нитритами и др.). Данный вид гипоксии характеризуется низким содержанием кислорода в крови при его высоком парциальном давлении.
3) Циркуляторная гипоксия (застойная гипоксия) возникает, когда в артериальной крови кислород содержится в нормальном количестве, но его поступление к тканям и органам существенно затруднено.
4) Тканевая гипоксия (гистотоксическая гипоксия) встречается при поражении клеток тканей и они не могут эффективно использовать поступающий к ним из крови кислород (например, при отравлении цианидами). При такой гипоксии страдают ферментативные системы (Новиков и Катунина, 2002).
В общей схеме событий, происходящих во время длительной гипоксии можно выделить несколько стадий (Corcoran and O Connor, 2013; Багдасарова и др., 2009): 1) снижение рО2 в крови и тканях, что далее приводит к снижению концентрации АТФ внутри клеток и повышению уровня [Ca2+]i; 2) повышение активности фосфолипаз; 3) электрическая дестабилизация клеточных мембран и появление у них неспецифической проницаемости для ионов; 4) разобщение процессов окисления и фосфорилирования в клетках, что в итоге приводит к гибели клеток на фоне прогрессирующего энергодефицита.
Головной мозг является основным потребителем кислорода в силу его высокой метаболической активности. В соответствии с этим, мозг обладает наиболее высокой чувствительностью к острой гипоксии, особенно сопровождающейся дефицитом энергетических субстратов (Kounalakis et al., 2013; Zhou et al., 1997). Корреляционный анализ изменения электроэнцефалограмм (ЭЭГ) и параметров фоновой импульсной активности нейронов сенсомоторной и зрительной коры у крыс при моделировании подъема на высоту 10 000 м показал, что чувствительность к дефициту О2 различается в разных структурах мозга и проявляется наиболее четко в изменении разрядной активности нейронов, а не их суммарной биоэлектрической активности. В ответе мозга на острую гипоксию можно выделить 2 основные фазы. Во время 1-й фазы острой гипоксии (легкое проявление О2-недостаточности) происходит усиление общей биоэлектрической активности мозга в сочетании с повышением возбудимости нейронов. Во время этой фазы процессы возбуждения развиваются активнее, чем тормозные, что получило название «гипоксическая деполяризация биологических мембран нейронов» (Новиков, 1994). Во время второй фазы гипоксии, наоборот, процессы торможения начинают доминировать над возбуждением, что связано с истощением энергетических запасов нервных клеток. В итоге биоэлектрическая активность мозга угасает и при продолжении действия гипоксии происходит функциональное нарушение нервной деятельности и повреждение нейронов (LaManna et al., 2004).
Гипоксическое повреждение головного мозга является следствием нарушения энергетического гомеостаза мозговой ткани. Считается, что первичным ответом нейронов на гипоксию является активация NAD-зависимых окислительно-восстановительных реакций, сопровождающихся накоплением АТФ и улучшением процессов сопряжения окисления и фосфорилирования в митохондриях, а также снижением потенциала покоя нейронов. Именно эти изменения на ранней стадии гипоксии в качестве компенсаторной реакции обеспечивают повышение электрической активности нейронов (Galli et al., 2013). При этом дестабилизация энергетического гомеостаза нейронов преимущественно связана с инактивацией NAD-зависимого пути окисления биологических субстратов при одновременной активации сукцинат-зависимого дыхания (Di Lisa and Ziegler, 2001). Происходит подавление или полное ингибирование переноса электронов на цитохромном участке дыхательной цепи (Gnaiger, 2005), а эти сдвиги редокс-потенциала вызывают последующие метаболические нарушения (Wolin et al., 2005), в т.ч. уменьшение АТФ и креатинфосфата, накопление АДФ и АМФ (Зарубина и Шабанов, 2004). Данные сдвиги биоэнергетики активируют в нейронах процесс анаэробного образования АТФ и нарастание внутриклеточной концентрации лактата (Городецкий, 2006). Одновременно происходит накопление и других органических кислот цикла Кребса, а также восстановленных пиридиннуклеотидов. Происходящее в это время падение рН вызывает инактивацию многих внутриклеточных белков, а также нарушает их связь с клеточной мембраной (Leung et al., 2011). Несмотря на компенсаторную активацию анаэробных реакций, гликолиз не может длительное время поддерживать энергетический потенциал клеток во время гипоксии на надлежащем уровне. В результате митохондрии вынуждены использовать в качестве субстрата окисления жирные кислоты, т.е. происходит накопление ацил-КоА в нейронах и ингибирование окислительного фосфорилирования на уровне адениннуклеотидтранслоказы и дальнейшее падение энергетического потенциала клеток (Боева и др., 2010).
По чувствительности к гипоксии in vivo можно выделить 3 основные структуры мозга: 1) наиболее чувствительными отделами являются центральные слои коры и особенно двигательного анализатора (O Reilly and Haddad, 1996); 2) далее следуют глубокие слои коры и гипоталамическая область (Сороко и др., 2005); 3) дорзальное ядро блуждающего нерва, гиппокамп и ядро подъязычного нерва по некоторым данным проявляют большую устойчивость гипоксии (Захарова и др., 2004; Guyenet, 2000), вероятно, в силу существования в них эндогенных адаптивных механизмов, что представляет большой интерес для исследований.
Гипоксические условия возникают также при ишемии тканей и органов, но патогенетические механизмы формирования ишемического повреждения обусловлены, прежде всего, нарушениями в доставке энергетических субстратов к клеткам. В соответствии с этим, ишемия является гораздо более тяжелым и опасным явлением, приводящим к серьезным повреждениям тканей, т.к. при ишемии, в сравнении с гипоксией, гораздо быстрее истощается энергетический запас клеток за счет нарушения продукции АТФ митохондриями (Верткин и др., 2007; Генинг и Иванская, 2006; Chandel, 2010).
Молекулярные и клеточные механизмы функциональной чувствительности клеток мозга к гипоксии
Кислород является жизненно важным элементом для аэробных организмов, являясь необходимым акцептором электронов в дыхательной цепи митохондрий при производстве АТФ. Головной мозг характеризуется высокой чувствительностью к изменениям уровня кислорода, и крайне уязвим во время гипоксии. Гипоксия в мозге возникает вследствие недостатка кислорода во вдыхаемом воздухе, при сердечнососудистых заболеваниях, ишемии, и др., а также сопровождает многие нейродегенеративные заболевания (Lall et al., 2019; Qin et al., 2019; Islam, 2017). Способность клеток мозга чувствовать местные изменения рО2 и механизмы передачи сигналов от сенсора О2 до эффекторных белков является актуальной фундаментальной задачей и, несмотря на значительный объем имеющихся знаний, в этих вопросах не существует единого мнения.
Известно, что рО2 в артериальной крови в норме поддерживается в среднем на уровне 100 мм.рт.ст., тогда как в паренхиме мозга этот показатель может быть между 20–30 мм.рт.ст. (Sakadzic et al., 2010; Parpaleix et al., 2013) с незначительными видовыми различиями, следовательно, можно предполагать существование собственного сенсора кислорода в ткани головного мозга. С помощью подачи инертного газа – азота в герметическую ячейку со срезами/клетками производили вытеснение растворенного в среде кислорода, уровень которого регистрировался с помощью оптического сенсора (диаметр 250 мкм, OxyLite system, Oxford Optronix), размещенного вблизи среза или слоя клеток при экспериментах in vitro. Во время гипоксии производилась регистрация динамики цитозольного кальция ([Ca2+]i) с помощью флуоресцентной микроскопии. На рисунке 13А показаны изображения острого среза вентральной поверхности ствола мозга крысы, клетки которой загружены астроцитарным маркером – Sulforhodamine-101 (SR-101) и кальций-чувствительным зондом – Oregon Green 488 BAPTA-1 (OGB-1). Видно, что в срезе имеются как нейроны (клетки зеленого цвета на панели Merge), так и астроциты (клетки желтого цвета, пересечение OGB-488 и SR-101), что позволяет регистрировать динамику [Ca2+]i во время гипоксии в этих двух типах клеток в одном эксперименте (рис. 13Б и В). Видно, что через 40±20 секунд после подачи азота в ячейку, когда рО2 снижается до 17±12 мм.рт.ст., происходит генерация Са2+-сигналов как в астроцитах (отвечают на гипоксию первыми), так и нейронах. Реакции астроцитов (рис. 13Б) на гипоксию имеют вид повторяющихся кратковременных Са2+-сигналов с возвращением [Ca2+]i до уровня покоя, тогда как нейроны острого среза ствола мозга отвечают кратковременным повышением [Ca2+]i (рис. 13В).
В первичной смешанной нейроглиальной культуре гиппокампа крысы (10 DIV, рис. 13Г), загруженной кальций-чувствительным зондом Fura-2, постепенное снижение рО2 (до 23±15 мм.рт.ст.) также вызывает появление различных Са2+-сигналов в астроцитах (рис. 13Д) и нейронах (рис. 13Е). При этом, в среднем, число астроцитов, реагирующих быстрым повышением [Ca2+]i существенно больше, по сравнению с нейронами и их Са2+-ответы имеют чаще всего вид высокоамплитудных Са2+-осцилляций, тогда как для нейронов характерны кратковременные сигналы. Для одиночных нейронов гиппокампа (рис. 13Е отмечены 1–3) обнаружено глобальное (необратимое на всем промежутке регистрации) повышение [Ca2+]i, которое является индикатором их повреждения.
Существуют данные, что альпинисты, дышавшие разреженным воздухом на пике Эверест, имели среднее рО2 артериальной крови на уровне 25 мм.рт.ст. (Grocott et al., 2009), при этом рО2 в паренхиме мозга было не известно, что говорит о способности мозга у некоторых индивидов функционировать в среде с экстремально низким содержанием кислорода. Более того, известно, что клетки различных отделов мозга характеризуются различной чувствительностью к гипоксическим явлениям. При ишемии в коре головного мозга, гиппокампе и в мозжечке уже через 2–3 минуты возникают очаги некроза, тогда как в продолговатом мозге даже через 10–15 минут погибают лишь единичные клетки (Lipton, 1999).
Таким образом, как нейроны, так и астроциты различных отделов мозга способны реагировать повышением [Ca2+]i на уменьшение рО2 до 20 мм.рт.ст. При этом, Са2+-сигналы культивируемых астроцитов характеризуются большей амплитудой и, как правило, имеют вид осцилляций, но всегда с возвращением концентрации ионов кальция до базового уровня. В тоже время, Са2+-ответы большинства культивируемых нейронов гиппокампа имеют вид одиночных обратимых импульсов с амплитудой в 1,5 раза меньшей, в сравнении с астроцитами.
Сверхэкспрессия BDNF защищает клетки гиппокампа от гибели при ишемии
Для выяснения вклада BDNF в формировании гипоксического прекондиционирования и активации защитных путей ГАМКергических нейронов гиппокампа, нами был сделан клеточный нокдаун BDNF с помощью siRNA и через 48 часов после трансфекции производились эксперименты по моделированию OGD (рис. 38). В качестве контрольной группы выступали клеточные культуры гиппокампа, в которые трансфецировали siRNA, последовательность которой отличается от siRNA против BDNF (рис. 38А, Scrambled, отрицательный контроль). Выяснилось, что сама процедура трансфекции не оказывает достоверного повреждающего воздействия на клеточную культуру гиппокампа, поскольку до начала экспериментов, подобно контрольным клеткам (которые не подвергались никаким воздействиям, рис. 38Б, ряд 1) в группе Scrambled некроз наблюдался только в одиночных клетках (рис. 38Д, Scrambled, PI), а также около 10% клеток на различных стадиях апоптоза (рис. 38Е, Ж). Во время OGD (40 минут) в нейронах гиппокампа в экспериментальной группе Scrambled (рис. 38А) наблюдалось двухфазное увеличение [Ca2+]i в глутаматергических (черные кривые) и ГАМКергических (красные кривые) нейронах гиппокампа. При этом ГАМКергические нейроны, в основном, характеризовались большими амплитудами Са2+-сигналов во время первой фазы OGD-индуцированного ответа, переходящими в необратимый рост [Ca2+]i (вторая фаза). В тоже время, в глутаматергических нейронах (рис. 38А, черные кривые) между первой (обратимой) фазой и второй (необратимой) проходит некоторый лаг-период, который может варьировать от культуры к культуре и, вероятно, зависит от экспрессии кальций-транспортирующих систем нейронов. Через 40 минут OGD наблюдается гибель порядка 60±18% клеток в поле зрения микроскопа (рис. 38Д, ряд 1 – PI+OGD; рис. 38З, Scrambled).
Клеточные культуры гиппокампа, прекондиционированные эпизодами кратковременной гипоксии по схеме эксперимента, представленного на рисунке 36, возвращали на 24 часа в СО2-инкубатор и потом проводили моделирование OGD. В группе прекондиционированных клеток (НР) наблюдается базовая гибель по типу некроза лишь одиночных клеток (рис. 38Д, ряд 2 – PI), однако число клеток на ранней стадии апоптоза составляло порядка 17±4% (рис. 38Е, Ж), при этом на поздних стадиях апоптоза находилось не боле 1% клеток, что меньше, чем в группе Scrambled. Т.е. можно предположить, что с одной стороны, гипоксическое прекондиционирование может индуцировать апоптоз в небольшой популяции клеток, но с другой стороны, большинство из этих клеток находится на ранней стадии апоптоза и, возможно, прекондиционирование формирует лаг-период в большинстве апоптозных клеток и, наоборот, сдерживает апоптотические процессы. Что касается Са2+-сигналов на OGD, то в прекондиционированных глутаматергических нейронах гиппокампа практически полностью подавляется первая фаза OGD-индуцированных Са2+-ответов и почти на 60% (относительно Scrambled, рис. 38А) ингибируется вторая фаза (рис. 38Б, НР, черные кривые). В ГАМКергических нейронах через 24 часа после прекондиционирования происходит появление длительного лаг-периода, предшествующего генерации OGD-индуцированных Са2+-ответов, но тем не менее, происходит глобальное повышение [Ca2+]i (рис. 38Б, НР, красные кривые). В целом, ингибирующее действие гипоксического прекондиционирования на OGD-индуцированные Са2+-сигналы нейронов гиппокампа приводит к снижению гибели клеток до 15±6% после OGD (рис. 38Д, ряд 2 – PI+OGD; рис. 38З).
Прекондиционирование клеточных культур, трансдуцированных (AAV)-Syn-BDNF-EGFP-конструктом приводит к полному подавлению некроза до начала экспериментов (рис. 38Д, ряд 3 – PI) и ингибированию апоптоза – около 1% клеток находится на ранней стадии апоптоза (рис. 38Е, Ж). В этой экспериментальной группе в глутаматергических нейронах полностью подавлена фаза глобального увеличения [Ca2+]i, при сохранении первой, обратимой фазы Са2+-ответа (рис. 38В, черные кривые). В ГАМКергических нейронах также сохраняется первая фаза Са2+-ответов, вторая фаза, подавлена на 59% (рис. 38В, красные кривые) по сравнению с группой Scrambled, а гибель клеток снижается до 5±3% (рис. 38Д, ряд 3 – PI+OGD; рис. 38З).
Нокдаун с помощью специфической siRNA против BDNF и последующее прекондиционирование этих клеток эпизодами гипоксии, приводит к увеличению числа некротических клеток (8±3%) в культуре (рис. 38Д, ряд 4 – PI) еще до начала экспериментов, а на различных стадиях апоптоза находится порядка 85% (в том числе на ранней стадии – 40±12% и 43±7% на более поздних стадиях апоптоза) (рис. 38Е, Ж). Во время OGD в группе с клеточным нокдауном по BDNF наблюдаются обе фазы OGD-индуцированных Са2+-сигналов в глутаматергических нейронах (рис. 38Г), причем амплитуда глобального увеличения [Ca2+]i почти в 4 раза выше, по сравнению с другими экспериментальными группами. Окрашивание клеток антителами против GAD65/67 показало отсутствие ГАМКергических нейронов в культурах с нокдауном BDNF, что может говорить о их гибели на стадиях прекондиционирования эпизодами гипоксии. Гибель клеток после OGD достигает уровня 87±13% (рис. 38З). Такой выраженный повреждающий эффект нокдауна BDNF на ГАМКергические нейроны не связан с процедурой индукции нокдауна, поскольку в отрицательном контроле (группа Scrambled) обнаруживались ГАМКергические нейроны после OGD, а процессы базовой гибели клеток были на уровне контроля (без воздействий lipofectamine RNAiMAX и siRNA) (рис. 38А, Д).
Усиление защитных свойств противовоспалительного цитокина – ИЛ-10 с помощью пероксиредоксина-6 и гуанфасцина при фокальной ишемии головного мозга (МСАО).
Для проверки нейропротекторной эффективности ИЛ-10 in vivo, были выполнены эксперименты по моделированию MCAO с помощь интралюминальной окклюзии средней мозговой артерии с последующей реперфузией. Фокальная ишемия головного мозга (MCAO) производилась в соответствии с общепринятой методикой (Tukhovskaya et al., 2013). Введение ИЛ-10 производилось внутривенно через установленный в хвостовую артерию катетер при помощи электронного программируемого двухканального инжектора за 1 час до окклюзии мозговой артерии. Совместно с ИЛ-10, крысам вводили антиоксидантный фермент – Prx-6, также показавший высокую нейропротекторную эффективность (рис. 46Б) и гуанфацин, агонист 2-адренергических рецепторов, который, наоборот, был менее эффективен (рис. 46Б), но также подавлявший повышение [Ca2+]i во время OGD. Морфологическое определение размеров зоны некроза головного мозга проводилось через 1 сутки (по 4 животных в группе) после постановки эксперимента. Оценка степени поражения головного мозга проводилась с помощью окраски срезов мозга 2,3,5-трифенилтетразолием хлорида.
Через 24 часа после МСАО происходило повреждение в виде некротической области (рис. 65А, светлый цвет, отмечен стрелками) в 53±18% мозга (рис. 65Б). Введение ИЛ-10 в концентрации 10 мкг/мл крысам за 1 час до MCAO приводило к уменьшению площади некроза мозга через 24 часа после МСАО до 18±11% (рис. 65А, Б). Инъекции препарата, включающего ИЛ-10 (10 мкг/мл) + гуанфацин (GF, 10 мкг/мл) приводили к усилению защитного действия ИЛ-10 и уменьшало площадь очага инсульта до 14±7% (рис 65А, Б). Препарат, в состав которого помимо ИЛ-10 (10 мкг/мл) входил Prx-6 (100 мкг/мл) вызывал еще более выраженный защитный эффект и подавлял некроз в модели МСАО до 8±2% (рис. 65А, Б).
Таким образом, интерлейкин-10 защищает клетки мозга от OGD и ишемии через подавление входа ионов Са2+ в цитозоль, и регуляцию экспрессии генов, отвечающих за активацию защитных механизмов клеток. На модели фокальной ишемии in vivo удалось показать возможность усиления защитных свойств ИЛ-10 при его введении животным в виде композиций с активатором 2-адренорецепторов и антиоксидантным ферментом – Prx-6, что приводит к снижению некротических процессов в очаге инсульта.