Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Материалы и методы 9
1.1. Метод молекулярной динамики: основы 9
1.1.1. Силовые поля 10
1.1.2. Поддержание постоянной температуры 13
1.1.3. Поддержание постоянного давления 15
1.1.4. Подбор оптимальных условий для моделирования мембран 15
1.2. Параметризация молекул в силовых полях программного пакета Gromacs 18
1.2.1. Создание и апробация моделей мембран 18
1.2.2. Создание модели углеродных наночастиц 20
1.3. Методы расчета свободной энергии молекул 21
1.3.1. Метод зонтичной выборки 22
1.3.2. Метод метадинамики 24
ГЛАВА 2. Динамика многокомпонентных билипидных слоев и формирование рафтов 26
2.1. Введение 26
2.1.1. Литературный обзор 27
2.1.2. Постановка задач и описание исследуемых систем 32
2.2. Результаты и обсуждение 35
2.2.1. Формирование бислоя из смеси липидов. 35
2.2.2. Формирование рафта в липидном бислое. 37
2.2.3. Исследование силы взаимодействия различных липидов друг с другом 40
2.2.4. Исследование взаимодействия двух монослоев рафта в мембране 44
2.3. Заключение. 47
ГЛАВА 3. Динамика транспорта углеродных нанообъектов через липидные бислои 48
3.1. Введение 48
3.1.1. Литературный обзор 49
3.1.2. Описание исследуемых систем и постановка задачи 54
3.2. Результаты и обсуждение 56
3.2.1. Проникновение фуллерена C60 внутрь мембраны 56
3.2.2. Проникновение кластера из фуллеренов внутрь мембраны 58
3.2.3. Исследование взаимодействия C3 и D3 фуллеренов с биологической мембраной 61
3.3. Заключение 64
ГЛАВА 4. Механизм транспорта протона через билипидные слои 65
4.1. Введение 65
4.1.1. Литературный обзор 66
4.1.2. Описание исследуемых систем и постановка задачи 69
4.2. Результаты и обсуждение 72
4.2.1. Описание модели переноса протона и расчет свободной энергии переноса 72
4.2.2. Изучение свойств «кислородной лестницы» 74
4.3. Заключение 79
Выводы 80
Благодарности 81
Список литературы 82
- Подбор оптимальных условий для моделирования мембран
- Постановка задач и описание исследуемых систем
- Описание исследуемых систем и постановка задачи
- Описание исследуемых систем и постановка задачи
Подбор оптимальных условий для моделирования мембран
Фуллерены-антиоксиданты защищают клетки от свободных радикалов (включая АФК), вызывающих апоптоз in vitro [115, 116]: в культурах нервных клеток [117], гепатомы [118] и эпителия [119]. Некоторые из производных фуллерена (например дендрофуллерены) [120] ингибируют ВИЧ-протеазу, важный белок-мишень в фармакологии. В [121] было продемонстрировано противоопухолевое действие водной суспензии С60 на культурах клеток глиомы при облучении светом: высокие концентрации фуллерена вызвали некроз, в то время как низкие концентрации остановили пролиферацию клеток и в конечном итоге приводили к аутофагии.
В [122] было показано, что карбоксифуллерены предотвращают апоптоз кератиноцитов человека, индуцированного B-ультрафиолетовым облучением. Водорастворимый фуллерен С60(ОН)25 обладает антиоксидантными свойствами. В частности, есть данные, что в присутствии этого фуллерена увеличивается подвижность сперматозоидов человека [123]. Также была продемонстрирована [124] способность к предотвращению токсичности, вызванной L-3,4-дигидроксифенилаланином, для водорастворимых фуллеренов и аскорбиновой кислоты. В статье [5] была изучена антиоксидантная активность двух изомерных форм трималонат фуллерена - С3 (малоновые группы локализованны на одной стороне молекулы фуллерена) и D3 (малоновые группы распределенны симметрично по поверхности фуллерена). Было установлено, что С3 имеет более высокую антиоксидантную активность по отношению к АФК, чем D3 (Рис. 24). Однако молекулярные основы этих взаимодействий не были объяснены, а в частности, процесс пассивного транспорта через клеточные мембраны С60 и его производных.
График, иллюстрирующий большую антиоксидантную активность С3 по сравнению с D3 на модельных липосомах. Из [5]. Большая часть фуллеренов попадает в клетку путем обычного эндоцитоза [125]. С другой стороны, гидрофобные молекулы C60 могут напрямую взаимодействовать с мембраной и проникать внутрь путем обычной диффузии. Методы молекулярного моделирования часто используются для изучения проницаемости малых молекул [126] и наночастиц [127] через биологические мембраны.
В частности, взаимодействие фуллерена С60 с ДПФХ мембраной исследовалось в статье [45]. Согласно этим данным, фуллерен способен проникать в мембрану за время порядка нескольких наносекунд. С60 погружается в биомембрану не доходя до середины около 1 нм и остается на этой глубине в течение продолжительного времени (длина траектории – 50 нс). При проникновении фуллерена площадь, приходящаяся на головку липида, увеличивается на 25% до 0,80 нм2.
Поведение фуллерена вблизи и внутри ДМФХ мембраны исследовалось в работах [46, 128]. Было также обнаружено, что свободная энергия фуллерена уменьшается при переходе из воды в область биомембраны, а затем в область гидрофобных хвостов. Согласно проведенным расчетам понижение энергии происходит благодаря более сильным ван-дер-ваальсовым взаимодействиям между фуллереном и липидами, чем между фуллереном и водой. Там же было показано отсутствие энергетического барьера для транспорта фуллерена из воды в мембрану.
Исследование по проникновению кластеров из фуллеренов в биомембраны проводилось в статье [129] с использованием крупнозернистого приближения на временах до 4 мкс. Использовались мембраны из ДПФХ и ДОФХ и 16 молекул фуллерена в воде на разных расстояниях от центра мембраны (в воде, ближе к липидным головкам, в центре мембраны). Молекулы фуллерена агрегировали в воде в течение 500 нс и проникали внутрь мембраны (Рис. 25).
Результаты [129] подтверждают данные из [45] что при контакте кластера С60 с областью липидных головок образуется маленькая пора (дефект), время жизни которой около 500 пс. В эту область проникает первый фуллерен из кластера. После этого остальные фуллерены проникают внутрь мембраны и на временах порядка микросекунд дезагрегируют. Согласно [129] с повышением молярной концентрации фуллеренов возрастает площадь, приходящаяся на липидную головку и толщина мембраны. Однако параметр порядка для алкильных хвостов изменяется незначительно даже при самых высоких концентрациях. При мольной доли фуллерена 11,1% понижается коэффициент латеральной диффузии на 40%, на 10% уменьшается модуль сжатия и на 20% модуль изгиба, что свидетельствует об общем разрыхлении мембраны. Изменение механических свойств мембраны не привело к каким-либо
В Табл. 12 приведены основные результаты исследований методом МД проницаемости фуллерена в биомембраны. В исследованиях, расчеты свободной энергии производились тремя основными методами: методом зонтичной выборки, ограничения по силе, а также методом адаптивного смещения по силе.
Все авторы получили минимум энергии для фуллерена внутри мембраны, однако остальные детали разнятся: наличие барьера при переходе через гидрофильные головки, положение и глубина минимума. Табл. 12. Сравнение существующих молекулярнодинамических расчетов взаимодействия фуллерена с мембранами.
В исследовании использовались четыре разные системы: липидный бислой с одной молекулой фуллерена C60, с десятью молекулами C60, а также с одной молекулой C3 и одной молекулой D3 (Табл. 13). Модельная мембрана состояла из 128 липидов ДПФХ. Молекулы C60, C3 or D3 были помещены над мембраной и не контактировали с ней в начале симуляций. Во всех расчетах мы использовали Бергеровские липиды [134] и модель воды SPC/E [135].
Все расчеты проводились в ансамбле NPT: семиизотропное давление 1 бар (баростат Парринелло-Рамана [22], временная константа 2 пс) и температура 323 К (термостат Нозе-Гувера [20, 21], временная константа 2 пс). Липиды и вода нагревались независимо, периодичные граничные условия применены в трех направлениях. Все связи поддерживались алгоритмом LINCS [136]. Шаг интегрирования – 2 фс, электростатика рассчитывалась при помощи алгоритма PME [18] (радиус обрезания 1 нм, FFT решетка 0,18 нм). Потенциал Леннард-Джонса рассчитывался с радиусом обрезания 1,2 нм. Табл. 13. Список проведенных численных экспериментов.
Постановка задач и описание исследуемых систем
Протонофорами могут быть молекулы свободных слабых органических кислот, которые могут быть синтезированы самой клеткой, или же образованы путем перекисного окисления липидов. В статье [155] было протестировано действие фитановой кислоты на протонную проводимость. Проводимость возросла в 10 раз при добавлении 0,2 молярной фракции кислоты. Однако этот эксперимент никак не объясняет разницы коэффициентов проницамости в пять порядков между протонами и остальными катионами.
Вторая гипотеза, связанная с формированием цепочки воды внутри мембраны, не может быть проверена экспериментальными методами. И хотя доказано, что протоны могут транспортироваться с участием молекул воды в грамицидиновых каналах [156], энергии активации переноса протона через канал достаточно высокие - 63 кДж/моль в везикулах, состоящих целиком из фосфолипидов, и 109 кДж/моль в везикулах с 33% содержанием холестерина. Однако механизм образования водных пор может также объяснить низкую проницаемость протонов для липидов архейных бактерий [157]. Рис. 37. Свойства проницаемости протона. В статье [158] было показано влияние длины алкильной цепи на проницаемость протона и натрия: чем длиннее цепь, тем меньше проницаемость протона (Рис. 37б). Энергия активация переноса протона была оценена в [150] и равняется 71 кДж/моль при проницаемости 1,710-4±0.410-4 см/с. Там же авторы показали корреляцию между текучестью мембраны и протонной проницаемостью. Такая высокая энергия активации не характерна для процесса переноса протона по водной цепочке (механизм Гроттнусса), где энергия равна 8-12 кДж/моль. В [159] впервые было опубликовано, что фосфатные группы обладают высокой буферной емкостью и могут быть использованы в качестве переносчиков протонов.
На данный момент всего несколько молекулярно-динамических исследований было проведено по переносу протона в мембранных системах. Это связано, в первую очередь, с трудностями расчета непосредственно переноса протона - процесса, описывающегося квантовой механикой.
В статье [51] исследовался процесс транспорта протона вблизи поверхности фосфолипидной мембраны. Исследовалась молекула гидроксония, а для описания процесса переноса протона был разработан специальный потенциал MS-EVB2. Авторами было обнаружено, что сначала протон проникает в «карманы», образованные липидами, а потом движется вдоль по поверхности мембраны. Гидроксоний взаимодействует с полярными группировками липидных молекул и участвует в образовании “мостов” между соседними липидами. ПСС диффузии протона в область мембраны из воды имеет максимум 0,7kBT, а если считать диффузию из мембраны в область воды, то барьер выше и составляет 1,2kBT.
Расчеты КМ/ММ были представлены в [160]. Проверялось две гипотезы: о диффузии протона в мембрану, а также гипотеза формирования цепочки воды в мембране. Было показано, что для сорбции в область мембраны протону необходимо 83,68 кДж/моль. Без участия водной поры энергия активации транспорта иона через мембрану составляла также 83,68 кДж/моль, т.е. суммарно – 167,36 кДж/моль. Во втором случае водная пора формировалась медленным движением протона внутрь гидрофобного слоя, энергия активации также получилась высокой, скорее всего из-за недостаточной релаксации системы при движении иона. Однако авторы предлагают принять вторую гипотезу как наиболее вероятный способ движения протона.
В статье [161] обсуждается возможность формирования поры в мембране, состоящей из цепочки молекул воды (гипотеза предложена в [162]). Молекулы воды притягивались внутрь мембраны, при этом рассчитывалась свободная энергия процесса. Полученная энергия равнялась 108±10 кДж/моль, что намного выше энергии активации переноса протона. Это исследование явилось еще одним подтверждением того, что формирование малой поры (цепочки молекул воды) внутри мембраны – маловероятный и энергозатратный процесс.
Формирование пор в мембранах методом МД можно наблюдать при проведении электропорации мембраны [163-166]. При включении электрического поля появляется сначала небольшая пора из тонкой цепочки воды, которая быстро в течение нескольких наносекунд увеличивается в размерах. При выключении поля, в зависимости от силы поля, времени воздействия и прочих факторов, мембрана может восстановить начальную структуру. Однако оценить энергетику образования поры используя только равновесную МД практически невозможно.
Суммируя все выше изложенные результаты исследований, можно заключить, что на данный момент не существует ни одной теории, описывающий механизм переноса протона в биомембранах и учитывающей все особенности экспериментальных данных.
Описание исследуемых систем и постановка задачи Модельная мембрана состояла из 100 гидратированных (степень гидратации – 54,3) молекул ПОФХ. Размеры ящика – 5,8x5,7x8,6 нм, плоскость мембраны перпендикулярна оси Z. Мембрана была собрана с использованием программы CHARMM-GUI в 0,1M KCl. Равновесная МД была проведена в течение 100 нс, после чего рассчитывались профили свободной энергии. Во всех симуляциях использовалось силовое поле CHARMM36 и модель воды TIP3P. ПСС был рассчитан для двух независимых липидов (один протонированный, ПОФХ-Н, и другой обычный ПОФХ) в разных монослоев друг напротив друга.
Во всех симуляциях был использован ансамбль NPT: семиизотропное давление (баростат Парринелло-Рамана, константа времени 2 пс) и постоянная температура 313 K (термостат Нозе-Гувера, константа времени 2 пс). Липиды и вода термостатировались отдельно, периодические граничные условия были применены во всех направлениях. Длина связей поддерживалась постоянной с использованием алгоритма LINCS [136]. Шаг интегрирования был увеличен до 5 фс за счет использования тяжелых атомов водородов. Кулоновские взаимодействия рассчитывались с использованием алгоритма PME (радиус обезания 1 нм, решетка FFT 0,18 нм). Радиус обрезания для потенциала Леннард-Джонса – 1,2 нм. Табл. 16. Список проведенных численных экспериментов.
ПСС рассчитывался методом зонтичной выборки. Гармонический потенциал прикладывался к двум фосфатам липидов вдоль координаты реакции (ось Z). Скорость движения потенциала была постоянной, поэтому в каждый момент времени положение фосфоров определялось как z(t)=z0+vt, где z0 – начальное положение атома фосфора. Метод ограничения по позиции был применен к обоим фосфатам в плоскости XY для фиксации их друг напротив друга. ПСС рассчитывался интегрированием результирующей силы взаимодействия фосфора с мембраной.
Все произведенные расчеты представлены в Табл. 16. Оптимальная скорость движения фосфоров - 2,510-3 нм/нс: при таком медленном движении возмущения в системе существенно уменьшаются, процессы можно считать равновесными. Также были произведены расчеты с фиксированными атомами фосфора на разных расстояниях друг от друга - для набора статистики для вычисления вероятности образования водных мостиков в мембране.
Задача исследования - оценить возможный механизм переноса протона с использованием молекулярного моделирования.
Цель исследования - изучить структурные перестройки в мембране, сопряженные с переносом протона фосфатами и рассчитать энергию активации этого процесса. 4.2. Результаты и обсуждение
Описание модели переноса протона и расчет свободной энергии переноса Исходя из вышеописанных экспериментальных данных, наиболее вероятным механизмом переноса протона является с использованием протонофоров. И первые кандидаты на эту роль – жирные кислоты мембран. Протонирование жирных кислот ведет к их нейтрализации, а следовательно они могут переносить протоны при помощи флип-флоп переходов. Однако в синтетических липидах, когда в системе отсутствуют жирные кислоты, перенос протона все равно происходит, поэтому жирные кислоты не являются искомыми протонофорами.
Значение pKa для жирных кислот сопоставимо со значением pKa для фосфатных групп (pKa 3.0), поэтому фосфатная группировка липида может быть переносчиком протона, особенно учитывая ее высокую буферную емкость [167]. Флип-флоп происходит довольно медленно (порядка нескольких часов), а энергия активации более 100 кДж/моль. Поэтому в нашей молекулярно-динамической модели предложена гипотеза неполного флип-флопа (Рис. 38): два липида, находящиеся с двух сторон мембраны, один из которых протонированный, двигаются внутрь мембраны до такого расстояния, когда перенос протона становится возможным.
Описание исследуемых систем и постановка задачи
В каждой симуляции был рассчитан потенциал средней силы (Рис. 40). ПСС возрастает по мере проникновения липидной головки внутрь мембраны. Видно, что наклон кривой ПСС молекулы ПОФХ круче, чем молекулы ПОФХ-Н. Как видно из графика (Рис. 40) значения ПСС повышались с понижением скорости, это связано, скорее всего с уменьшением возмущений в системе. Свободная энергия (G) складывалась из двух значений энергий для каждого липида. Таким образом, чтобы перенести фосфаты внутрь мембраны до расстояния 1,3 нм, необходимо затратить 70-90 кДж/моль.
Параллельно вычислительным экспериментам, А. Лохматиковым была экспериментально определена энергия активации процесса переноса протона на липосомах, состоящих только из синтетических липидов ПОФХ. При разных температурах измерялся протонный транспорт по методике, описанной в [148]. Измеренная Ea равнялась 60 кДж/моль (Рис. 41), что на 20 кДж/моль меньше аналогичных измерений на природных липидах [150], а также на 10-20 кДж/моль меньше значений, полученных при перемещении двух фосфатов внутрь мембраны на расстояние 1,2 нм.
Изучение свойств «кислородной лестницы» Во время проведений расчетов было замечено, что появление цепочки воды внутри мембраны всегда сопряжено с характерными структурными перестройками сложноэфирных атомов кислорода липидных молекул. Каждый ПОФХ имеет четыре кислорода, при приближении моделируемых липидов внутри мембраны, восемь кислородов перестраивались в специализированную структуру, которая была названа “кислородная лестница” (Рис. 39б). Молекулы воды располагались мостиком вдоль отрицательно заряженной кислородной лестницы в гидрофобной части мембраны (Рис. 39в). Важно отметить, что лестница формировалась до того, как образуются водные цепочки, на расстояниях RPP 1,5 нм (Рис. 42).
Процесс формирования кислородной лестницы между двумя молекулами фосфора, расположенными на расстоянии 1,5 нм. а – Начальная конфигурация системы. б – Начало Чтобы проверить причастность кислородных лестниц к формированию водных цепочек, была проведена вторая серия МД расчетов. Атомы фосфоров липидов ПОФХ-Н и ПОФХ были зафиксированы на определенных RPP расстояниях (Табл. 16), это позволило достигнуть в конкретных точках состояния равновесия и отсутствия сильных возмущений в системах. На Рис. 42 показаны стадии формирования кислородной лестницы и выстраивания по ней водной цепочки. Вода выстраивалась вдоль кислородов уже на расстоянии порядка RPP=1,55 нм. Однако как только лестница разрушалась, цепочки также прекращали свое существование. Водные цепочки стали появляться чаще и сохранились дольше на более близких расстояниях RPP, особенно при RPP 1,1 нм (Рис. 42, Рис. 43). МД расчеты показали, что формирование водных цепочек лимитировано образованием кислородных лестниц, т.к. формирование этих двух структур происходит не параллельно, а последовательно. По-видимому, временная задержка, которая требуется для того, чтобы сформировалась цепочка воды, в первой серии МД не была соблюдена из-за постоянного движения фосфоров. Соответственно это привело к тому, что молекулы воды выстроились позже, т.е. энергия активации оказалась завышенной (Рис. 39). формирования кислородной лестницы. в – Появление кислородной лестницы между двумя фосфорами внутри мембраны. г – Построение водного мостика вдоль кислородной лестницы.
Приближение двух фосфатов липидов друг к другу внутри мембраны увеличивает вероятность образования водной цепочки, однако требует больше энергии. Из второй серии МД были рассчитаны вероятности образования водной цепочки внутри мембраны, способной переносить протон. Показано, что процесс наиболее вероятен при 1,1 нм RPP 1,4 нм (Рис. 43а). Кинетическая модель Нэйгла [162] переноса протона показывает, что перенос протона может осуществляться на таких расстояниях. В таком случае для атомов фосфора на расстоянии 1,4 нм энергия активация получается порядка 50-60 кДж/моль (Рис. 40), и это хорошо согласуется с рассчитанной экспериментально энергией активации переноса протона через билипидный слой (Рис. 41).
На Рис. 43б оценена вероятность образования водных цепочек (кластеров) из равновесной МД длиной 200 нс. Мембрана была разбита на слои толщиной 1 ангстрем: рассчитывалось среднее количество частиц, оказавшихся в данном слое на один фрейм. Зеленая и красная линия показывают распределение фосфатных групп с двух сторон мембраны (максимумы этих кривых задают границу мембраны по оси Z). Синяя кривая -распределение одиночных молекул воды в мембране (вода, находившаяся за пределами мембраны не учитывалась, поэтому кривые обрываются при z=+/-2). Голубая кривая -распределение пар молекул воды (молекулы объединялись в пары, если расстоянием между ними было меньше 4 ангстрем). Видно, что концентрация одиночных молекул воды в середине мембраны на четыре с лишним порядка меньше, чем ее величина на границе мембраны. Концентрация пар молекул воды в центре мембраны точно не определена, а интерполяция голубых точек внутрь мембраны дает примерную оценку полтора порядка для концетрации.
Формирование кислородного мостика внутри мембраны никак не сопряжено с процессами протонирования/депротонирования. Поэтому для транспорта протона лимитирующей стадией является как раз формирование кислородного мостика. Видимо этим объясняется отсутствие H2O/D2O эффекта. Кинетическая модель также предсказывает отсутствие эффекта, связанного с изменением проницаемости в зависимости от pH.
Ранее в статье [168] был показано, что скорость транспорта протонов через Fo домен АТФазы также не зависит от величин мембранного потенциала в пределах 6,0 pH 10,0, а также была установлена независимость переноса протона от типа воды H2O/D2O в пределах 8,0 pH 10,0. Эти наблюдения были объяснены лимитирующей стадией белкового конформационного перехода с энергией активации Ea порядка 60-70 кДж/моль. По аналогии, в нашем случае кислородная лестница как раз и есть тот конформационный переход, лимитирующая стадия, ограничивающая транспорт протона. Реализация таких "благоприятных" конформаций будет зависеть от гибкости молекул, участвующих в процессе, и это объясняет сильную зависимость протонного переноса от текучести, фазы мембраны.
Филогенетический анализ показал, что протон-зависимой энергетике предшествовала натрий-зависимая энергетика, возможно из-за высокой проницаемости древних мембран для протона [143]. В разных группах организмов возникали разнообразные приспособления для уменьшения проницаемости Н+. Бактерии используют различные средства для увеличения плотности упаковки неполярных атомов в средней плоскости бислоя, археи – монослои липидов [169, 170]. Эти средства по идее должны препятствовать образованию «лестничных мостов» внутри мембраны.
В случае архейных мембран кислородные лестницы должны быть короче, т.к. в каждом липиде содержится только четыре атома кислорода. Это объясняет, почему архейные мембраны практически непроницаемы для протонов, даже несмотря на то, что мембранный дипольный потенциал архей на 120 мВ ниже, чем у организмов, содержащих сложноэфирные липиды [170].
Описание исследуемых систем и постановка задачи
Проникновение фуллерена C60 внутрь мембраны Равновесная МД одной молекулы фуллерена с мембраной показала, что в течение первой наносекунды С60 сорбируется в область головок (Рис. 26а). А уже на третьей наносекунде спонтанно проникает в область гидрофобных хвостов (Рис. 26a,в), что согласуется с ранее проведенными экспериментами [45, 46, 130]. На протяжении следующих 100 нс симуляции фуллерен остается внутри мембраны.
Характеристика взаимодействия молекулы фуллерена с мембраной. а – Расстояние между ц.м. С60 и ц.м. мембраны. Погружение внутрь мембраны (прерывистая линия – граница мембраны) отмечено стрелкой – на 3 наносекунде симуляции. б – Профиль свободной энергии процесса проникновения фуллерена C60 в модельную эукариотическую мембрану. в – Вид системы мембраны с фуллереном внутри.
После равновесной МД проводился расчет профиля энергии взаимодействия С60 с мембраной ДПФХ. В Табл. 12 приведены аналогичные расчеты МД взаимодействия фуллеренов с различными мембранами. Согласно этой таблице можно заключить, что форма нашего потенциала средней силы (ПСС) фуллерен-мембрана схожа с исследованиями, проведенными ранее. Главный минимум энергии находится чуть поодаль от центра мембраны, а при прохождении области головок – есть небольшой барьер. Следует отметить, что некоторые детали разнятся среди ранее проведенных экспериментов: иногда не наблюдается барьер при переходе фуллерена из водной среды в область хвостов. Крупнозернистое моделирование дает завышенные значения свободных энергий. Суммируя, можно утверждать, что в силу маленьких времен расчета возникает проблема недостижимости термодинамического равновесия в исследуемых гетерогенных средах. Также разница в параметризации моделей, в свою очередь, ведет к различающимся результатам в схожих исследованиях.
Расчет профилей свободной энергии для системы фуллерен-мембрана производился с применением метода метадинамики, который раньше не использовался исследователями. Таким образом, рассчитав ПСС и сравнив его с предыдущими результатами, мы валидировали метод и убедились в правильности подобранных параметров.
На Рис. 26б видно, что фуллерен преодолевает энергетический барьер в примерно 15 кДж/моль при переходе из водной среды в область гидрофобных хвостов. Глобальный минимум энергии находится на расстоянии 0,7 нм от центра мембраны: при приближении к центру мембраны свободная энергия фуллерена возрастает на 30 кДж/моль. Для изучения положения молекулы фуллерена внутри мембраны была проведена дополнительная равновесная МД: С60 был помещен в центр бислоя между концами.
Результаты МД фуллерена в мембране. а – Распределение вероятностей нахождения фуллерена на различных расстояниях от центра мембраны. б - Ориентация липидных хвостов вокруг молекулы С60.
После 50 нс симуляции был построен график распределения вероятностей расположения фуллерена в мембране (Рис. 27а). Из него видно, что фуллерен находится на расстоянии 0,8 нм от центра мембраны большую часть времени (Рис. 27). Адсорбция фуллерена на поверхность мембраны и его прыжок внутрь бислоя никаким образом не влияет на свойства липидов (Табл. 14).
Все перечисленные выше результаты не противоречат ранее полученным данным, что свидетельствует о правильно параметризованной модели. 3.2.2. Проникновение кластера из фуллеренов внутрь мембраны В водной среде гидрофобные фуллерены могут существовать лишь в агрегированном состоянии. В следующем эксперименте мы провели МД с десятью фуллеренами и ДПФХ мембраной в тяжелоатомном приближении. Для того, чтобы изучить проницаемость кластера из фуллеренов, мы разместили десять молекул С60 в воде над мембраной таким образом, чтобы они не контактировали ни с мембраной, ни друг с другом. Спустя несколько наносекунд после начала симуляции фуллерены агрегировали и адсорбировались на поверхность мембраны в области гидрофильных головок. Первый фулерен из агрегата попал внутрь мембраны через 3 нс. Остальные фуллерены проникли в мембрану спустя несколько наносекунд. На сотой наносекунде девять из десяти фуллеренов были погружены в область гидрофобных хвостов (Рис. 28в). Все фуллерены оставались внутри мембраны на протяжении последующих 400 нс расчетов. Мы не наблюдали дезагрегации фуллеренов внутри мембраны, как было показано в [130], возможно из-за того, что не хватило расчетного времени (дезагрегация происходит на временах порядка микросекунд). Наиболее вероятная локализация кластера из фуллеренов – 0,5-1 нм от центра мембраны.
Рис. 28. Характеристика и вид МД систем фуллеренов с мембраной. а, б – Параметры порядка для липидных хвостов, рассчитанные для ДПФХ мембраны, ДПФХ мембраны с одним фуллереном и ДПФХ мембраны с десятью фуллеренами C60: а – sn-1-цепь, б – sn-2-цепь. в – Вид конечной конфигурации системы (девять из десяти фуллеренов внутри мембраны). г – молекулярный гидрофобный потенциал (МГП), рассчитанный для верхней части мембраны. Фуллерены показаны как ВдВ сферы красным цветом.
Вразрез с предыдущими исследованиями с использованием крупнозернистой модели [130], мембрана деформируется при добавлении большого количества фуллеренов: она изгибается (Рис. 28в, радиус кривизны рассчитан как в [33], Рис. 29), площадь, приходящаяся на липидную головку уменьшается с 69 до 56 2, а толщина мембраны увеличивается с 38,7 до 42 к концу расчета (Табл. 14). Табл. 14. Свойства ДПФХ мембраны в МД с разным количеством фуллеренов.
МГП был рассчитан для двух сторон мембраны: в начальный и конечный период времени (Рис. 30). В начальный момент времени поверхность мембраны выглядит классически: небольшие гидрофобные области (хвосты) перемежаются с к крупными гидрофильными (головки). Фуллерены расположены и над гидрофобными, и над гидрофильными участками мембраны (Рис. 30а, б). После проникновения кластера из фуллеренов внутрь мембраны, было показано, что образовалась крупная гидрофобная область, рядом с местом проникновения С60 (Рис. 30в, г). Это означает, что фуллерены, проникшие в мембрану, вызвали ее возмущение, приведшее к частичному экспонироваю гидрофобных хвостов в водную среду, а по сути, образованию небольшой поры в мембране. В такой конформации липиды особенно уязвимы перед АФК.