Введение к работе
Актуальность исследования
Лазерная спектроскопия комбинационного рассеяния света (КР) и резонансная спектроскопия комбинационного рассеяния света (РКР) являются одними из эффективных и широко используемых методов регистрации и исследования биологических молекул. К основным преимуществам методов КР и РКР спектроскопии относится их избирательность, быстрота измерений и пригодность для исследования жидкостей, растворов, газов, пленок, поверхностей, волокон, твердых веществ и кристаллов. Кроме того, количества веществ, необходимые для исследования этим методом, ограничены лишь поперечными размерами сфокусированного лазерного луча. Узкая спектральная ширина линии лазерного возбуждения и использование многоканальной системы регистрации позволяет измерять КР спектры в диапазоне от 10 до 4000 см" . Вместе с тем, высокая плотность мощности лазерного излучения может обеспечить получение информативных спектров даже при небольших концентрациях исследуемого вещества. При работе с биохимическими объектами, методы КР и РКР спектроскопии позволяют получать информацию о переходах между колебательными энергетическими уровнями, т.е. о молекулярных колебаниях молекулы. Таким образом, спектр КР молекулы представляет собой по сути её мгновенный снимок. Интенсивность пика КР при этом прямо пропорциональна концентрации исследуемых молекул.
Свободные радикалы (СР) это атомы или молекулы, имеющие на внешней оболочке один или несколько неспаренных электронов. Это делает СР химически активными, поскольку радикал стремится либо вернуть себе недостающий электрон, отняв его от окружающих молекул, либо избавиться от «лишнего» электрона, отдавая его другим молекулам. В организме человека СР реагируют со всеми биологическими молекулами, встречающимися на их пути, нанося им повреждения. В человеческом организме в норме оксидантные и анти-оксидантные процессы сбалансированы. Это означает, что негативное действие СР на биологические молекулы организма сведено к минимуму. Равновесие может быть нарушено в результате воздействия на организм различных факторов, таких как УФ, ИК и рентгеновское излучения, болезни, стрессы, медикаменты, косметические продукты и образ жизни человека.
Кожа человека, как граничный орган между окружающей средой и организмом, содержит большое количество антиоксидантов, таких
как каротиноиды, витамины, энзимы, и другие. Антиоксиданты играют решающую роль в поддержании окислительно-восстановительного баланса в организме, а также в защите организма от повреждений, вызванных свободнорадикальным окислением. Уменьшение уровня концентрации антиоксидантов в коже приводит к окислительно-восстановительному дисбалансу, что, в конечном счёте, может привести к развитию окислительного стресса и необратимым повреждениям биоткани.
Антиоксидантные свойства каротиноидов известны по in-vitro измерениям. Очевидно, что несомненный интерес представляют ІП-vivo измерения концентрации каротиноидов в коже человека в зависимости от воздействия на неё стресс-факторов, которые всегда сопровождаются образованием свободных радикалов. Питание, богатое различными антиоксидантами, наоборот, приводит к увеличению уровня концентрации антиоксидантов в организме человека. Получение информации об усваиваимости каротиноидов организмом, о механизмах их транспорта и накопления в органах человека, особенно в коже, а также о кинетике восстановления антиоксидантов после воздействия стресс-факторов, является чрезвычайно актуальным.
До недавнего времени in-vivo измерения каротиноидов в коже не представлялись возможными из-за отсутствия метода, обеспечивающего высокую чувствительность и неинвазивность. Спектроскопия РКР в свою очередь обладает рядом существенных преимуществ среди существующих неинвазивных методов измерения каротиноидов в коже человека.
Представленная работа посвящена разработке и апробации не-инвазивного двухволнового метода, в основе которого лежит спектроскопия РКР света, для определения концентрации каротиноидов (3-каротина и ликопина в коже человека in-vivo.
Перспективность этого направления исследований очевидна не только для лучшего понимания физиологических процессов в коже, но и для быстрого определения состояния антиоксидантной системы организма в целом. Помимо прямых измерений на коже, особый интерес представляет определение концентрации каротиноидов в организме при их использовании в медицине, косметологии, в пищевой промышленности, животноводстве, и везде, где возникает вопрос о нарушения окислительно-восстановительного баланса.
Цель и задачи диссертационной работы
Целью диссертационной работы является разработка комплексного подхода для решения задачи определения абсолютной концентрации каротиноидов в коже человека и животных, а также в любых других образцах.
В диссертационной работе решаются следующие задачи:
Создание лазерного двухволнового РКР спектрометра с целью проведения быстрых неинвазивных измерений каротиноидов в коже человека и других объектах.
Выбор источника излучения, оптимизация оптической схемы РКР спектрометра, размера возбуждающего лазерного пучка на коже, плотности мощности зондирующего лазерного излучения и канала светосбора.
Разработка методики измерения каротиноидов в коже человека.
Разработка методики обработки спектров РКР.
Разработка алгоритма селективного определения каротиноидов (3-каротина и ликопина в коже человека.
Использование эффекта фотообесцвечивания («выцветания флуоресценции») для повышения чувствительности регистрации низких концентраций каротиноидов в коже человека.
Определение абсолютной концентрации каротиноидов в коже человека.
Научная новизна
Предложен, реализован и апробирован неинвазивный метод измерения концентрации каротиноидов (3-каротина и ликопина в коже человека, в основе действия которого лежит резонансная спектроскопия комбинационного рассеяния света при двухволно-вом лазерном возбуждении.
Предложен и реализован метод повышения чувствительности регистрации низких концентраций каротиноидов кожи, основанный на использовании эффекта фотообесцвечивания («выцветания флуоресценции»).
Впервые подтверждено в in-vivo измерениях, что каротинои-ды, выполняя антиоксидантную функцию в коже человека, разрушаются в результате действия таких факторов как УФ, ПК, рентгеновское излучения, стресс, болезни, употребление больших доз алкоголя, физические упражнения высокой интенсивности. Опре-
делены кинетики реакции каротиноидов на действие соответствующих стресс-факторов.
Впервые продемонстрировано косвенно, по деградации каротиноидов, измеренной in-vivo методом резонансной спектроскопии КР, что ИК-А облучение кожи человека, производит в ней свободные радикалы. Показано, что спектр образования свободных радикалов лежит преимущественно в диапазоне длин волн от 780 нм до 1500 нм. Эта гипотеза в дальнейшем была подтверждена прямыми измерениями образования свободных радикалов в коже методом электронного парамагнитного резонанса.
Впервые измерено «сезонное возрастание» уровня концентрации каротиноидов в коже, выражающееся в увеличенной концентрации каротиноидов в летние и осенние месяцы по сравнению с зимними и весенними месяцами. Средняя величина «сезонного возрастания» была определена равной 1.26±0.21.
Впервые проведены измерения концентрации каротиноидов в поте человека. Этот результат является фундаментальным для дальнейшего понимания кинетики изменения концентрации каротиноидов в коже человека и физиологии кожи.
Показано, что метод резонансной спектроскопии КР может использоваться для оптимизации и стабилизации антиоксидантного состава кремов, пищевых добавок и продуктов питания.
Обобщение полученных результатов даёт право утверждать, что каротиноиды являются веществами-маркерами антиоксида-тивного потенциала кожи человека.
Впервые предложен метод устранения ладонно-подошвенного синдрома - побочного эффекта, часто проявляющегося при лечении раковых больных препаратом доксорубицин (doxorubicin), в основе действия которого лежит нейтрализация доксорубицин-индуцированных свободных радикалов на поверхности кожи при помощи крема, содержащего сбалансированный «коктейль» антиоксидантов.
Практическая ценность
Созданная экспериментальная установка, в основе действия которой лежит метод резонансной спектроскопии КР света с двух-волновым лазерным возбуждением, позволяет проводить селективные неинвазивные измерения каротиноидов в коже человека и жи-
вотных in-vivo, а также in-vitro измерения в коже, растворах, суспензиях и твёрдых телах.
Измерение кинетики изменения концентрации каротиноидов даёт информацию о количестве образующихся свободных радикалов в исследуемом образце (кожа, медикаменты, косметические средства, продукты питания, и т.д.) и, таким образом, позволяет судить количественно о величине действия стресс-фактора на образец.
Основные положения, выносимые на защиту
Метод спектроскопии РКР является оптимальным среди существующих неинвазивных методов для определения концентрации каротиноидов в коже человека и проведения измерений по определению антиоксидантного потенциала кремов и продуктов питания. Использование двухволнового метода на длинах волн 488 нм и 514.5 нм позволяет раздельно определять содержание каротиноидов (3-каротина и ликопина в коже человека. Использование метода фотообесцвечивания («выцветания флуоресценции») повышает чувствительность регистрации низких концентраций каротиноидов в коже человека.
В коже человека in-vivo каротиноиды нейтрализуют свободные радикалы и разрушаются таким образом, что уменьшение концентрации каротиноидов происходит в течение первых 100 минут в зависимости от действующего стресс-фактора и его интенсивности. Восстановление - более длительный процесс, занимающий 1-3 дня и зависящий от питания и антиоксидантного потенциала кожи человека.
Доказано, что, несмотря на незначительную энергию квантов, ИК излучение производит в коже человека свободные радикалы. Спектр образования свободных радикалов лежит преимущественно в диапазоне длин волн от 780 нм до 1500 нм.
Концентрация каротиноидов в коже человека распределена неравномерно и имеет максимум в верхнем слое эпидермиса, т.е. в роговом слое. Далее концентрация уменьшается экспоненциально вглубь кожи и достигает постоянного минимального значения на глубине 14-20 мкм. Насыщение рогового слоя кожи каротиноидами обусловлено спецификой процесса потоотделения, при котором каротиноиды выходят на поверхность кожи с потом и, затем, впитываются внутрь.
5. Побочное действие препарата доксорубицин, вызывающего «ладонно-подошвенный синдром» может быть эффективно предотвращено нанесением на кожу крема, содержащего сбалансированный «коктейль» антиоксидантов.
Апробация работы и публикации
Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на следующих конференциях: 12-й, 13-й, 14-й, 15-й, 16-й, 17-й, 18-й и 19-й Международной конференции по лазерной физике ("LPHYS'2003", Гамбург, Германия; "LPHYS'2004", Триест, Италия; "LPHYS'2005", Киото, Япония; "LPHYS'2006", Лазанна, Швейцария; "LPHYS'2007", Леон, Мексика; "LPHYS'2008", Трондхайм, Норвегия; "LPHYS'2009", Барселона, Испания; "LPHYS'2010", Фоц до Игуацу, Бразилия), IX и XIII Международной конференции по перспективам проникновения веществ через кожу ("РРР 2004", "РРР 2008", Ла Гранде Мотте, Франция), 7-й, 9-й, 10-й, 12-й и 13-й Международной школы для студентов и молодых учёных по оптике, лазерной физике и биофизике ("SFM'2003", "SFM'2005", "SFM'2006", "SFM'2008", "SFM'2009", Саратов, Россия), Симпозиуме по неинва-зивным методам в косметологии ("L'oreal-2005", Париж, Франция), Симпозиуме немецкого общества гинекологов и онкологов ("NOGGO-2005", Берлин, Германия), Симпозиуме по системам визуализации и оптическим технологиям для медицины-2005 (Берлин, Германия), 41-й Международной конференции по клинической онкологии ("ASCO-2005", Орландо, США), Симпозиуме по Недеструктивному определению жизненно-важных веществ-2005 (Потсдам, Германия), Международном симпозиуме «Питание для будущего» ("ШК-2006", Потсдам, Германия), 2-м Международном съезде общества фармакологии и физиологии кожи ("ISP-2006", Рим, Италия), конференции по биомедицинской оптике ("BIOS-2007", Сан Хосе, США), Международном конгрессе по использованию ингридиентов в косметике ("НРСГ2009", Варшава, Польша), 12-й Международной конференции по применению лазеров в науке ("LALS'2010", Оулу, Финляндия).
Публикации
Основные результаты диссертационной работы опубликованы в 37 работах, список которых приведен в конце автореферата.
Структура и объем диссертации
