Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Методы рациональной разработки лекарств 10
1.2. Белки-мишени урокиназа и PAK-1: структура, роль в организме, наличие известных ингибиторов 20
1.2.1. Роль урокиназы в организме 20
1.2.2. Структура урокиназы 21
1.2.3. Известные ингибиторы урокиназы и особенности их взаимодействия с протеолитическим центром урокиназы 24
1.2.4. Роль PAK1 в организме 26
1.2.5. Структура протеинкиназы PAK1 28
1.2.6. Известные ингибиторы PAK 30
Глава 2. Методы исследования 35
2.1. Докинг, скоринг и виртуальный скрининг – основа технологии разработки новых ингибиторов. Программа SOL 35
2.2. Постпроцессинг 42
2.2.1. Общие положения: локальная оптимизация и уточнение энергии связывания белка и лиганда. Программа Discore 42
2.2.2. Методы квантовой химии 45
2.3. Прямой докинг. Программа FLM 49
2.4. Экспериментальная методика тестирования ингибирования урокиназы in vitro 52
2.5. Экспериментальная методика тестирования ингибирования протеинкиназы PAK1 in vitro 53
Глава 3. Применение методов компьютерного моделирования для разработки новых ингибиторов урокиназы 55
3.1. Создание молекулярной модели урокиназы 55
3.2. Поиск оптимальных параметров генетического алгоритма 56
3.3. Проверка качества позиционирования программой докинга SOL 63
3.4. Проверка качества оценки энергии связывания урокиназа-лиганд программой докинга SOL 67
3.5. Способность программы докинга SOL находить реальные ингибиторы из множества неактивных лигандов 72
3.6. Виртуальный скрининг баз данных готовых соединений 73
3.7. Валидация и применение постпроцессинга с помощью программы Discore 77
3.8. Применение прямого докинга в рамках программы FLM 84
3.9. Применение полуэмпирических квантово-химических методов для расчета свободной энергии связывания урокиназа-лиганд 86
3.10. Дизайн и синтез новых ингибиторов 90
3.11. Обсуждение результатов главы 95
Глава 4. Компьютерная разработка новых ингибиторов PAK1 102
4.1. Определение связывающего центра протеинкиназы PAK1. Докинг молекулы BPIPP в белок PAK1 102
4.2. Докинг базы данных NCI и результаты экспериментальной проверки..118
4.3. Проведение квантово-химических вычислений для соединений, отобранных из базы данных NCI Diversity 123
4.4. Обсуждение результатов главы 125
Глава 5. Применение докинга и постпроцессинга в международном конкурсе CSAR 132
Заключение 137
Список литературы
- Белки-мишени урокиназа и PAK-1: структура, роль в организме, наличие известных ингибиторов
- Общие положения: локальная оптимизация и уточнение энергии связывания белка и лиганда. Программа Discore
- Проверка качества позиционирования программой докинга SOL
- Проведение квантово-химических вычислений для соединений, отобранных из базы данных NCI Diversity
Введение к работе
Актуальность проблемы
В последние годы значительное внимание исследователей во всем мире уделяется
разработке биофизических методов для высокочувствительной количественной регистрации биомолекул и их взаимодействий между собой. В частности, высокая востребованность со стороны таких отраслей, как фармацевтическая промышленность, медицинская диагностика, экологический мониторинг и др., диктует необходимость разработки точных и скоростных методов обнаружения белковых молекул в биологических образцах сложного состава (кровь, сыворотка, слюна, молоко и т.д.). Исследования в данном направлении требуют междисциплинарного подхода и чрезвычайно важны, поскольку их результаты могут использоваться для решения широкого круга научных и прикладных задач.
Одним из наиболее популярных методов детекции биомолекул является иммуноанализ. Традиционные количественные методы иммуноанализа, такие как иммуноферментный анализ, характеризуются длительным временем получения результата (не менее 2 ч). Относительно быстрые методы, позволяющие получить результат в течение 10 мин, например иммунохроматографический анализ, как правило, дают только качественную оценку в терминах "да/нет".
Перспективным подходом для увеличения чувствительности и сокращения времени иммуноанализа является использование магнитных наночастиц (МЧ) в качестве детектируемых меток. Одним из преимуществ таких меток является возможность их использования в непрозрачных или сильно рассеивающих средах, например, в сочетании с трехмерными твердыми фазами, где применение традиционных окрашенных, флуоресцентных и ферментных маркеров сильно ограничено.
Выбор метода детекции применяемых меток - один из факторов, оказывающих существенное влияние на эффективность иммуноанализа. Методы регистрации МЧ на основе гигантского магнитного сопротивления (ГМС), как правило, характеризуются невысоким соотношением сигнал/шум, требуют съемных электрических контактов со считывающим устройством и весьма затратны для однократных применений. Кроме того, ГМС-детекторы преимущественно используются в сочетании с магнитными кластерами, соизмеримыми по размеру с чувствительным элементом сенсора, что приводит к слабой зависимости сигналов от концентрации аналита и высокому неспецифическому связыванию. Одна из наиболее чувствительных методик регистрации МЧ, основанная на использовании криогенных сверхпроводящих квантовых интерференционных магнетометров, является достаточно дорогостоящей и труднодоступной для рутинного использования в медицинской диагностике и экологическом мониторинге. Таким образом, разработка методов анализа,
использующих магнитные частицы в качестве меток в сочетании с методами регистрации таких меток, обеспечивающими высокую чувствительность, доступность и высокое отношение сигнал/шум, является перспективным направлением в разработке новых подходов в биосенсорике и иммуноанализе.
Одним из этапов разработки иммуноанализа является оптимизация его условий: выбор антител, способа их иммобилизации, времени инкубации и концентрации иммунореагентов, а также состава буферных и стабилизирующих растворов. Влияние каждого из этих параметров можно оценить с помощью методов, использующих различные метки, лишь на завершающей стадии иммуноанализа. Безметочные оптические методы могут значительно повысить эффективность разработки протокола иммуноанализа за счет количественного мониторинга в режиме реального времени взаимодействий между биомолекулами на каждой стадии анализа, а также сокращения времени и числа операций. Таким образом, развитие безметочных методик для изучения в реальном времени межмолекулярных взаимодействий также является актуальной задачей.
Цели и задачи работы
Цель работы состояла в разработке биофизических методов, основанных на
использовании магнитных наночастиц в качестве детектируемых меток, для высокочувствительной количественной регистрации биомолекул и их взаимодействий между собой. Для достижения поставленной цели в работе решались следующие задачи:
Разработка и верификация методики количественной оценки взаимодействия биомолекул между собой и с магнитными наночастицами путем мониторинга в режиме реального времени каждого этапа иммуноанализа с помощью спектрально-корреляционной интерферометрии.
Изучение с помощью метода спектрально-корреляционной интерферометрии конформационных изменений при смене состава водного окружения слоя сополимеров N,N-диметилакриламида и N-акрилоил-т-аминофенилборной кислоты, иммобилизованных на стеклянной поверхности.
Изучение влияния магнитных наночастиц на предел детекции метода спектрально-корреляционой интерферометрии при их использовании для амплификации сигнала по сравнению с безметочной регистрацией.
Разработка метода детекции биомолекул, основанного на использовании объемных волоконных фильтров в качестве твердой фазы иммуноанализа и магнитных наномаркеров.
Разработка метода детекции биомолекул, основанного на принципе иммунохроматографии с использованием МЧ в качестве меток в сочетании с методом регистрации нелинейных магнитных материалов на комбинаторных частотах.
Научная новизна и практическая значимость
Разработан метод регистрации биомолекул, обладающий оригинальным сочетанием
аналитических характеристик: а) широким линейным диапазоном, составляющим более 3 порядков концентрации аналита; б) малой продолжительностью анализа; в) возможностью анализировать образцы практически любого объема, причем чувствительность метода растет при увеличении объема образца; г) отсутствием пробоподготовки для биологических образцов сложного состава, например, цельного молока. Данные свойства метода продемонстрированы на примере детекции токсинов, продуцируемых бактериями Золотистого стафилококка. Новизна метода заключается в применении объемных волоконных фильтров в качестве твердой фазы анализа в сочетании с использованием магнитных наномаркеров, регистрируемых со всего объема фильтров методом детекции нелинейных магнетиков на комбинаторных частотах. Применение фильтров обеспечивает большую реакционную поверхность твердой фазы - 20 см в объеме около 35 мкл, а также эффективное взаимодействие и быстрое концентрирование антигена на твердой фазе с иммобилизованными антителами непосредственно в ходе анализа. Применяемый подход для регистрации МЧ характеризуется высоким отношением сигнал/шум, поскольку окружающие диа- и парамагнитные материалы, такие как компоненты крови, стекло, вода, пластик и т.д., не вносят вклад в детектируемый сигнал.
Разработан количественный метод иммунохроматографического анализа с использованием магнитных наномаркеров для регистрации в сыворотке крови человека онкомаркера - простатического специфического антигена (ПСА). Данный метод совмещает преимущества лабораторных методов и экспресс-тестов на основе сухой химии: он обладает высокой чувствительностью и позволяет получать количественные результаты при простоте использования и коротком времени получения результата.
Оба разработанных метода иммуноанализа могут найти практическое применение в области диагностики заболеваний и биобезопасности как в лабораторных, так и домашних условиях, а также для контроля пищевой продукции, экологическом мониторинге, в ветеринарии и т.д.
Разработана методика для количественного изучения взаимодействия биомолекул с целью мониторинга каждой стадии иммуноанализа. Методика основана на принципе спектрально-корреляционной интерферометрии с использованием в качестве сенсорных чипов стандартных микроскопных покровных стекол. Методика успешно испытана на примере изучения влияния пептидного фрагмента (65-76) С-концевого домена моноцитарного хемотаксического белка-1 (МСР-1) на взаимодействие МСР-1 с гепарином, а также для изучения обратимых конформационных изменений полимерных структур на
поверхности стекла. Полученные результаты подтверждены независимыми методами: вискозиметрией, эллипсометрией, сканирующей электронной микроскопией, иммуноферментным анализом. Продемонстрирована возможность количественного мониторинга каждого этапа иммуноанализа с использованием магнитных наночастиц в качестве меток. Оригинальность разработанного подхода заключается в возможности регистрации в реальном времени взаимодействия между биомолекулами непосредственно на стеклянной поверхности без нанесения дополнительных проводящих или диэлектрических пленок. Разработанная методика может найти применение как для развития новых методов иммуноанализа, так и для широкого круга приложений, требующих количественной оценки динамики межмолекулярных взаимодействий.
На примере детекции кардиомаркера сердечного тропонина І (сТнІ) показано, что применение магнитных наночастиц в качестве меток приводит к усилению сигнала спектрально-корреляционной интерферометрии, причем использование магнитных наномаркеров приводит к увеличению чувствительности по сравнению с безметочной регистрацией примерно в 100 раз. Динамический диапазон составил около 3 порядков величины концентрации. Благодаря высокой чувствительности и широкому динамическому диапазону, разработанный метод может рассматриваться в качестве привлекательного инструмента с широкодоступными и низкозатратными расходными материалами (одноразовыми сенсорными чипами) для проведения иммуноанализа в реальном времени в таких областях, как диагностика заболеваний, регистрация патогенов в продуктах питания, мониторинг окружающей среды.
Положения, выносимые на защиту
-
На основе спектрально-корреляционной интерферометрии развита методика количественной оценки взаимодействия между биомолекулами. Эффективность методики экспериментально продемонстрирована на примере исследования влияния пептидного фрагмента (65-76) С-концевого домена моноцитарного хемотаксического белка-1 (МСР-1) на взаимодействие МСР-1 с гепарином.
-
С помощью спектрально-корреляционной интерферометрии показаны обратимые изменения конформации привитых на стеклянную поверхность сополимеров N,N-диметилакриламида и N-акрилоил-ш-аминофенилборной кислоты при смене состава водного окружения.
-
Установлено, что магнитные наночастицы диаметром ~ 50 нм, используемые для амплификации сигнала при детекции сердечного тропонина I с помощью спектрально-корреляционой интерферометрии, вызывают улучшение предела детекции более чем в 100 раз по сравнению с безметочной регистрацией. Показано, что в результате такой
амплификации достигается предел детекции сердечного тропонина I на уровне 0,1 нг/мл и динамический диапазон - около 3 порядков величины концентрации.
-
Разработан метод регистрации биомолекул с использованием магнитных наночастиц в качестве меток, регистрируемых по нелинейному перемагничиванию на комбинаторных частотах, с применением в качестве твердой фазы объемных волоконных фильтров с развитой площадью поверхности. Характерные особенности разработанного метода продемонстрированы на примере определения в цельном молоке стафилококковых токсинов, энтеротоксина А (СЭА) и токсина синдрома тканевого шока (ТСТШ). Показано, что за счет концентрирования токсинов на волоконной твердой фазе с иммобилизованными антителами чувствительность метода растет с увеличением объема пробы. При времени анализа 2 ч и объеме пробы 30 мл достигнут предел детекции для ТСТШ - 4 пг/мл и для СЭА - 10 пг/мл. Установлено, что при времени анализа 25 мин пробы объемом 150 мкл предел детекции ТСТШ составляет 0,1 нг/мл, СЭА - 0,3 нг/мл. Продемонстрирована близкая к линейной зависимость регистрируемых сигналов от изменения концентрации аналита в диапазоне более 3 порядков величины.
-
Разработан количественный экспресс-метод детекции онкомаркера - простатического специфического антигена (ПСА) - в сыворотке крови человека на основе иммунохроматографического анализа с использованием магнитных наномаркеров. Показано, что предел количественной детекции ПСА составляет 25 пг/мл, динамический диапазон -более 3 порядков величины концентраций.
Апробация результатов
Результаты работы были представлены на 13 российских и международных конференциях: International Conference on the Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers (Minneapolis, Minnesota, U.S.A., 22-26 May 2012; Rostock, Germany, 25-29 May 2010), European Magnetic Sensors and Actuators Conference (Prague, Czech Republic, 1-4 July 2012; Bodrum, Turkey, 4-7 July 2010), Conference on Optical Chemical Sensors and Biosensors (Barcelona, Spain, 1-4 April 2012; Prague, Czech Republic, 28-31 March 2010), III Международный Симпозиум «Актуальные проблемы биофотоники - 2011» (Санкт-Петербург - Нижний Новгород, 16-22 июля 2011), Московский международный симпозиум по магнетизму (Москва, 21-25 августа 2011), Международный конкурс научных работ молодых ученых в области нанотехнологий RUSNANOTECH (Москва, 26-28 октября 2011; 1-3 ноября 2010), Научная конференция МФТИ (Москва-Долгопрудный, 10-30 ноября 2011; 27-30 ноября 2009), III Евразийский конгресс «Медицинская физика - 2010» (Москва, 21-25 июня 2010).
Публикации
По материалам работы опубликовано 5 статей в рецензируемых научных журналах, входящих в список ВАК, и 16 тезисов докладов в сборниках трудов конференций.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, одной главы литературного обзора, четырех глав результатов и обсуждения экспериментов, заключения, списка цитируемой литературы, в который входит 169 источников. Работа изложена на 131 странице, содержит 49 рисунков и 5 таблиц.
Белки-мишени урокиназа и PAK-1: структура, роль в организме, наличие известных ингибиторов
В настоящее время существует довольной большой объем данных о механизмах действия урокиназы в организме, таких как воздействие ее на ангиогенез и ремоделирование сосудов и взаимодействие урокиназы с ее рецептором, а также существуют данные о самой структуре урокиназы и её рецептора. Все это делает урокиназу перспективной мишенью для противоопухолевой терапии, а также позволяет заключить, что применение рациональной разработки новых соединений, подавляющих отдельные функции урокиназы, может быть эффективным для решения задачи создания нового противоопухолевого лекарства на основе ингибиторов системы урокиназы.
Можно предложить четыре типа ингибирования компонент системы урокиназы [65]. Во-первых, это блокирование взаимодействия урокиназы с её рецептором. Во-вторых, блокирование участков, ответственных за взаимодействие с ко-рецепторами урокиназы, обуславливающими цитокиновую сигнализацию урокиназы. В-третьих, возможно также блокирование системы урокиназы за счет ингибирования олигомеризации ее рецептора, что препятствует передачи сигнала к интегринам. И, наконец, это блокирование протеолитического активного центра самой урокиназы, функция и строение которого на данный момент изучены лучше, чем функции и строение других доменов урокиназы. Поскольку на данный момент экспериментально продемонстрирована роль протеолитической активности урокиназы в процессах роста и метастазирования опухолей [54-56,67], разработка ингибитора протеолитической активности урокиназы представляется наиболее актуальной задачей.
Известные ингибиторы урокиназы и особенности их взаимодействия с протеолитическим центром урокиназы
Естественными ингибиторами урокиназы и тканевого активатора плазминогена в организме человека являются PAI-1 и PAI-2, которые после связывания с uPA и tPA образуют с ними ковалентную связь и необратимо их инактивируют, что приводит к подавлению фибринолиза за счет уменьшения активности плазмина. Таким образом, в организме они предотвращают кровотечения при фибринолизе.
Первое свидетельство, подтвердившее возможность подавления прогрессирования опухоли с помощью ингибиторов протеолитической активности урокиназы, было получено с использованием антител к урокиназе [68,69]. Впоследствии, усилия в этой области были направлены на разработку низкомолекулярных синтетических ингибиторов uPA, обладающих высокой эффективностью, селективностью и фармакокинетическими свойствами, позволяющими их использовать как лекарственные препараты для противоопухолевой терапии.
Специфика связывания большинства ингибиторов с протеолитическим центром uPA в значительной степени определяется аминокислотным остатком Asp189 урокиназы, расположенным в основе первичного якорного участка для субстратов, названного специфичным карманом S1 [70]. Кристаллическая структура каталитического домена урокиназы обладает подобной трипсину топологией, в которой Asp189 сохранен, придавая участку S1 аффинность к положительно заряженным остаткам Arg и Lys [64]. Поэтому, большинство синтетических ингибиторов uPA, созданных к настоящему времени, обладают общей структурной особенностью, заключенной в моно - или биароматической части, обладающей функцией амидина или гуанидина и действующей как миметик аргинина. Однако, при разработке ингибиторов существует строгое ограничение, обусловленное необходимостью ингибирования урокиназы, не затрагивая активность других подобных трипсину сериновых протеаз, и особенно tPA и плазмина, ключевых ферментов для процессов фибринолиза.
В более ранних исследованиях селективными ингибиторами урокиназы считались паразамещенные производные бензамидина, которыми заменяют, 4-хлоро- и 4-трифторометилфенилгуанидины и амилорид, но ни один из них не обладал высокой эффективностью; у них всех Ki находился в пределах микромолярного диапазона [71-73]. Поиск более активных ингибиторов привел к синтезу двух бензо[b]тиофен-2-карбоксамидинов с 4 замещениями, B428 и B623, с Ki 0.53 и 0.16 микроМ, соответственно [74,75]. В последние несколько лет было предложены много новых низкомолекулярных ингибиторов урокиназы, включая производные 4-аминоарилгуанидина и 4-аминобензамидина, 2-пиридинилгуанидины, 1-изохинолинилгуанидины и 1-(7-сульфонамидоизохинолинил)гуанидины, производные мексилетина, 4-хлоро-3-алкоксизокумарины, содержащие терминальный бром, 4-оксазолидиноновый аналог UK122, производные 5-тиометилтиофенеамидина, N-1-адамантил)- N -(4-гуанидинобензил) мочевина (WX-293T), и WX-UK1, производная 3-амидинофенилаланина [76-88]. Однако, среди этих ингибиторов, только WX-UK1 с Ki = 0.6 микроМ (WILEX, Мюнхен, Германия) вошел в клинические испытания. Так как WX-UK1 не абсорбируется при пероральном приеме, позже Wilex разработал пропрепарат для перорального приема, WX-671, для системной доставки активного WX-UK1. Эффективность этого пропрепарата была оценена в двух клинических испытаниях II фазы в комбинации с классическими цитостатическими препаратами [89,90]. Тем не менее, на настоящий момент все еще не существует препарата – ингибитора урокиназы, вошедшего в клиническую практику, и разработка таких ингибиторов остается актуальной задачей.
Помимо низкомолекулярных ингибиторов урокиназы, существуют также классы селективных пептидных ингибиторов, которые могут связываться как с активным участком, так и с поверхностными петлями uPA, и часто воспроизводят способ связывания ингибиторов PAIs, например, последовательность CSWRGLENHRMC, названная упаин-1 (upain-1) [91]. Однако компьютерное моделирование больших пептидных ингибиторов и их взаимодействия требует иных подходов и алгоритмов в связи с их большими размерами, в отличие от низкомолекулярных ингибиторов, и в данной работе затрагиваться не будет, и далее речь пойдет о разработке низкомолекулярных ингибиторов протеолитического центра урокиназы, действующих по обратимому механизму.
Общие положения: локальная оптимизация и уточнение энергии связывания белка и лиганда. Программа Discore
В трехмерных структурах, взятых из базы данных PDB, отсутствовала информация о легких атомах (атомах водорода), а в некоторых структурах отсутствовали отдельные тяжелые атомы или аминокислотные остатки. Прежде чем проводить типизацию атомов белка в соответствии с силовым полем MMFF94, которое используется в вышеописанных программах докинга, были восстановлены пропущенные тяжелые атомы, а также структуры были дополнены атомами водорода с помощью программы APLITE [108]. Далее также с помощью программы Aplite была произведена процедура типизации атомов белка в силовом поле MMFF94, а с помощью программы SOLGRID [45] были построены сетки потенциалов. Координаты области докинга (так называемый куб докинга) определялись из положения закристаллизованного ингибитора в активном центре комплекса (координаты центра куба докинга совпадают с геометрическим центром нативного для данного комплекса ингибитора). Данная область захватывала весь протеолитический центр и имела размер 22 Х 22 Х 22 . Лиганды отобранных комплексов также были дополнены атомами водорода в соответствии с их зарядовыми состояниями при pH = 7.
Подготовленные таким образом 45 нативных комплексов белок–лиганд в дальнейшем были использованы для проверки качества докинга программами SOL и FLM, а также программой постпроцессинга DISCORE [108]. Подобная проверка состояла в том, чтобы определить, насколько правильно программа докинга позиционирует лиганды в активном центре белка урокиназы, а также насколько правильно она способна оценивать энергию связывания лиганда и белка урокиназы.
Поиск оптимальных параметров генетического алгоритма Прежде чем оценивать качество докинга, была проведена проверка эффективности работы программы докинга SOL при использовании различных параметров реализованного в ней генетического алгоритма. Для анализа были взяты 20 комплексов урокиназы белок-лиганд из базы данных PDB таким образом, чтобы лиганды имели разное количество внутренних вращательных степеней свободы (от 6 до 19). Были рассмотрены следующие параметры генетического алгоритма, величина которых оказывает влияние на эффективность работы программы SOL:
1) Количество независимых запусков программы: NUMBER OF RUNS параметр, определяющий количество выполняемых независимых запусков генетического алгоритма. Очевидно, что увеличение количества независимых запусков программы повысит вероятность нахождения глобального минимума, однако время, требуемое на расчеты, будет расти пропорционально количеству запусков.
2) Размер популяции: POPULATION SIZE - определяет количество особей в популяции (количество особей, создаваемых на одном шаге эволюции).
3) Число поколений: NUMBER OF GENERATIONS - определяет, сколько раз нужно провести смену поколений в одном запуске генетического алгоритма.
4) Размер пула родителей: MATING POOL SIZE - определяет количество родителей следующего поколения. Эти родители набираются из популяции, и при помощи их попарных комбинаций и прямого копирования создается новая популяция.
5) Способ отбора в пул родителей. В программе SOL реализованы следующие варианты: STEP FUNCTION SELECTION WITH NICHING – последовательный выбор родителей с учетом нишинга, который строится на основании их энергии (должна быть низка) и генетического (то есть геометрического) разнообразия в пуле отобранных родителей (должно быть высоко).
ROULETTE WHEEL SELECTION – выбор родителей осуществляется случайным образом с вероятностью, пропорциональной значениям энергии связывания.
STEP FUNCTION SELECTION – отбираются родители с самыми низкими энергиями связывания. При этом в первом случае дополнительный параметр - NICHING DIVERSITY FACTOR - определяет, насколько разные родители должны попадать в пул родителей (чем он больше, тем больше разнообразия). Для этого после каждой выбранной в пул родителей особи вычисляется расстояние между ее генотипом и генотипом особей текущего поколения D ( .--a.-)2, (IV) i=\ где N – количество генов в хромосоме, ai и bi – значения генов двух особей между которыми вычисляется расстояние, и к значению общей энергии особей текущего поколения прибавляется величина NICHING DIVERSITY FACTOR . D 6) Количество особей элиты: ELITISM – определяет сколько наилучших особей должно заведомо переноситься в следующее поколение, чтобы найденный результат не был потерян. 7) Способ кроссинговера: кроссинговер представляет собой модель полового размножения – создание новой хромосомы из двух родительских хромосом путем случайного объединения их генов. В программе докинга SOL реализованы три вида кроссинговера: UNIFORM CROSSOVER – однородный кроссинговер строится на случайном выборе каждого i-ого гена потомка из i-ого гена первого родителя (с вероятностью P) или i-ого гена второго родителя (с вероятностью 1-P). ONE POINT CROSSOVER – одноточечный кроссинговер: в геном потомка включаются первые гены от первого родителя и последние гены от второго родителя. Точка разделения «первых» и «последних» генов выбирается случайным образом.
Проверка качества позиционирования программой докинга SOL
Для оценки влияния растворителя были выбраны три варианта оптимизации: оптимизация без растворителя, оптимизация с растворителем и оптимизация с включением растворителя на последнем шаге оптимизации. Сравнение коэффициентов корреляции между энтальпиями связывания белок– лиганд, рассчитанными в MOPAC для всех случаев с энергиями, рассчитанными из экспериментальных данных, показало, что включение растворителя в оптимизацию незначительно улучшает коэффициент корреляции с экспериментом. Поэтому, для того чтобы сократить время вычислений (в зависимости от количества подвижных атомов это время могло превосходить время оптимизации без растворителя более чем в два раза) дальнейшие расчеты проводились с включением растворителя на последнем шаге оптимизации. Помимо коэффициента корреляции также было оценено среднеквадратичное отклонение оптимизированного лиганда от его нативного положения. Локальная оптимизация лиганда в MOPAC значительно не изменяла геометрию лиганда относительно нативной, а среднеквадратичное отклонение по всем атомам было меньше 1 .
Также была проведена оценка необходимости включения атомов белка в локальную оптимизацию. Для этого в процессе оптимизации оставлялись подвижными или только лиганд, или лиганд и все атомы водорода белка, или лиганд и все ближайшие к нему атомы белка, расположенные не дальше 2 , 3 , 4 , 5 и 10 от крайних атомов лиганда (таблица 16).
Время, требуемое для расчетов, значительно увеличивалось с увеличением количества подвижных атомов белка. Например, для комплекса 1f92 оптимизация одного лиганда требовала 16.5 часов, включение в эту оптимизацию атомов белка, расположенных не далее, чем 2 от лиганда, увеличивало это время до 25 часов, а включение в оптимизацию всех атомов водородов белка требовало уже 41.5 час. Таблица 16. Коэффициенты корреляции рассчитанных в MOPAC энтальпий связывания со значениями энергий связывания, полученными из экспериментальных данных для различных вариантов оптимизации атомов белка (при наличии / отсутствии растворителя в модели COSMO) на основании результатов для 10 нативных комплексов урокиназа-лиганд (1c5w, 1ejn, 1f5k,
Из таблицы 16 видно, что подвижность ближайших атомов способна увеличить корреляцию с экспериментом, однако поскольку включение большого числа атомов нецелесообразно и требует больших вычислительных ресурсов, оптимальным кажется включение в оптимизацию ближайших атомов белка, расположенных на расстоянии 2 . Также видно, что отсутствие учета растворителя заметно уменьшает корреляцию.
Помимо этого было замечено, что исключение из набора комплекса 1c5w или 1ejn значительно увеличивает корреляцию с экспериментальными данными. Результаты приведены в таблице 17.
Программа FLM для исследуемых 10 лигандов дает коэффициент корреляции с экспериментом 0.49, программа DISCORE – 0.45, а программа SOL – 0.57. Исключение комплексов 1c5w или 1ejn в этих случаях почти не меняет корреляцию с экспериментом. При этом, «задоченные» положения во всех случаях сильнее отличаются от нативного, чем положение, оптимизированные в MOPAC (что не удивительно, так как в первом случае происходит поиск глобального минимума независимо от нативного положения, а во втором – локальная оптимизация около нативного положения). Таблица 17. Коэффициенты корреляции рассчитанных в MOPAC энтальпий связывания со значениями энергий связывания, полученными из экспериментальных данных для различных вариантов оптимизации атомов белка (при наличии / отсутствии растворителя в модели COSMO) на основании результатов для 10 нативных комплексов урокиназа-лиганд (1c5w, 1ejn, 1f5k,
Также, при проведении докинга программой SOL и последующей локальной оптимизацией лигандов в MOPAC (эта процедура может быть полезна в дальнейшем для поиска новых ингибиторов, нативное положение которых в белке неизвестно), коэффициент корреляции с экспериментом составляет для тех же 10 комплексов - 0.61. Отсюда можно предположить, что заметное влияние комплексов 1c5w или 1ejn на корреляцию с экспериментом может быть вызвано как недостатками метода параметризации PM7 (в том числе невключением в расчет энтропии связывания), так и дефектами нативного положения лиганда в белке для этих двух комплексов.
Здесь также нужно учесть, что скоринг-функция программы SOL, как и скоринг-функция программы DISCORE содержит в себе подгоночные параметры, тогда как при вычислениях с помощью MOPAC подобные параметры не используются. Также на данный момент не использовалось вычисление энтропии квантово-химическими методами, однако ее значение также вносит определенный вклад в свободную энергию связывания белок-лиганд.
В данном исследовании в качестве начальной геометрии брались нативные положения лигандов в белке, однако в задаче поиска нового вещества положение соединения в активном центре белка неизвестно, т.е. перед проведением расчетов в MOPAC необходимо найти глобальный минимум энергии взаимодействия белок-лиганд. Поэтому перспективным в данном случае выглядит соединение методов докинга и квантово-химических расчетов в качестве постпроцессинга (постпроцессинг в силомом поле с помощью программы DISCORE показал в этом случае меньшую эффективность). Конечно, такой комбинированный метод не подойдет для скрининга баз данных, содержащих десятки и сотни тысяч соединений, поскольку потребует большого времени вычислений, но на этапе дизайна нового соединения, когда важно точно оценить, какой вклад внесет, например, добавление в структуру новых химических групп, и не ухудшит ли оно активность, он может оказаться эффективным.
Проведение квантово-химических вычислений для соединений, отобранных из базы данных NCI Diversity
В ходе докинга соединения из NCI занимали те же области (карманы связывания) I, II, III и IV, что конформеры и изомеры соединения BPIPP. Область I расположена на поверхности -спирали III автоингибиторного домена (цепь А) и региона каталитического домена (цепь C), который задействован в связывании субстрата и в транс-автофосфорилировании. Соединения, связавшиеся в области I, возможно могут влиять на взаимодействие автоингибиторного домена с каталитической областью белка и на конформационные изменения, связанные со смещением -спирали III автоингибиторного домена, которая задействована в активации киназной активности протеинкиназы PAK.
Область II расположена на другой стороне -спирали III автоингибиторного домена (цепь А), где расположены друг напротив друга автоингибиторный домен и CRIB домен другой субъединицы (цепь B). Соединения, связавшиеся в области II вероятно могут оказывать влияние на конформацию CRIB домена и на изменения, связанные со смещением -спирали III автоингибиторного домена, которая задействована в активации киназной активности протеинкиназы PAK.
Область III расположена на поверхности CRIB домена и смежных с ним областей автоингибиторных доменов обоих субъединиц (цепи A и B). Соединения, связавшиеся в области III, могут оказывать влияние на конформацию CRIB домена и на изменения, связанные с активацией киназной функции протеинкиназы PAK.
Соединения, связавшиеся в областях I, II и III вероятно могут влиять на стабильность димера PAK1, равновесного состояния мономер-димер, взаимодействие PAK1 с активирующими G-белками, и транс-автофосфорилированием PAK1, а также на связывание с субстратом и на общие конформационные изменения при активации.
Некоторые свойства карманов связывания (областей) могут быть определены путем исследования функциональных групп соединений и белка, поскольку общая структура и геометрия карманов связывания играют значительную роль в способности соединений связаться с белком, однако при этом не вносят вклада в специфические взаимодействия с PAK. Так как соединения-лидеры, приведенные выше, активируют киназную активность PAK1, можно ожидать, что связывание этих соединений будет менять конформацию белка таким образом, чтобы вызвать открытие киназного активного центра для связывания пептидных субстратов и ATP. В таком случае должны присутствовать специфические взаимодействия с функциональными группами белка. Простое геометрическое соответствие (pi-pi и гидрофобные взаимодействия) без дополнительных взаимодействий, направленных на функциональные группы (таких как перенос зарядов, образование водородных связей) может не оказаться значимым для активации PAK1. Например, соединения, попавшие при докинге в карман I, требуют наличия отрицательного заряда, расположенного в окрестности Lys135 (автоингибиторный домен, цепь A) чтобы иметь возможность стимулировать активацию PAK1. Также, соединения, «задоченные» в карман III, предполагают нахождение этих соединений в определенных конформациях для реализации специфического взаимодействия с His83 (CRIB-домен, цепь A). Все соединения, «задоченные» в карман II, имеют функциональные группы, что позволяет ожидать их взаимодействия с аминокислотами Asn138 и Thr136 цепи А, и с His86 цепи В.
Комбинированный метод, включающий в себя докинг программой SOL и последующий постпроцессинг в рамках квантово-химического комплекса MOPAC был описан выше применительно к комплексам урокиназа-лиганд. Этот же метод был применен для отобранных 41 соединения PAK1-лиганд. Использование программы DISCORE в качестве метода постпроцессинга в данном случае казалось малоперспективным в виду отсутствия большого количества соединений с известными активностями в отношении PAK1, и как следствие – возможности провести обучение и подгонку эмпирических коэффициентов в скоринг-функции программы DISCORE.
Структура белка PAK1 (взятая из PDB ID – 1F3M) содержит 11102 атомов, то есть является довольно большой структурой, по сравнению, например, с урокиназой, которая содержит 3818 атомов для PDB ID 1SQO. Попытка обрезать структуру, например, убрать цепь D, находящуюся довольно далеко от областей расположения лигандов, приводила к изменению зарядов на лигандах, и как следствие – изменению энергий связывания по сравнению с целой структурой белка. Поэтому для оптимизации методом PM7 использовалась целая структура и времена счета, требуемые для оптимизации только лиганда в неподвижном белке даже для небольших лигандов, составляли около суток и более, а при включении в оптимизацию ближайших атомов белка, находящихся не далее, чем 2 от лиганда, эти времени составили уже несколько суток.
Несмотря на то, что многие отобранные по скоринг-функции программы SOL соединения показали активность в эксперименте корреляция скоринг-функции программы SOL с энергией, полученной из экспериментальных данных, оказывается отрицательной (-0.35 для pH=8 и -0.1 для pH=7). В результате постпроцессинга в программном комплексе MOPAC при оптимизации лиганда и ближайших атомов белка, находящихся на расстоянии до 2 от лиганда, с учетом растворителя на последнем шаге корреляции рассчитанных в MOPAC энтальпий с энергиями, полученными из экспериментальных данных, возрастают (и составляют соответственно 0.17 для pH=8 и 0.21 для pH=7). Таким образом, в случае белка PAK1 методы молекулярного моделирования также позволяют найти новые активные ингибиторы, но корреляции с экспериментальными данными невысоки. Здесь, однако, важно учесть, что в отличие от описанных в предыдущей главе ингибиторов урокиназы, которые являлись ингибиторами протеолитического активного центра и действовали по конкурентному механизму, найденные соединения, активные в отношении PAK1, не являются конкурентными ингибиторами каталитического активного центра. В этом случае найденные ингибиторы и активаторы PAK1 оказывают не прямое влияние на активность PAK1, поэтому однозначной зависимости между константами связывания соединений и протеинуиназной активностью PAK1, измеренной in vitro, может не быть, что объясняет низкие корреляции рассчитанных значений энергий связывания с экспериментальными данными
