Содержание к диссертации
Введение
1. Оптические параметры биологических тканей и методы управления ими (обзор литературы) 23
1.1.Введение 23
1.2.Оптические параметры биологических тканей 26
1.3.Методы управления рассеивающими свойствами фиброзных биотканей 54
1.3.1. Физико-химические основы иммерсионного метода управления рассеивающими свойствами биологических тканей 54
1.3.2. Токсичность оптического просветления 61
1.3.3. Методы усиления чрескожной доставки ОПА 62
1.4.Управление оптическими параметрами биотканей с помощью экзогенных красителей и частиц 69
1.4.1. Свойства многофункциональных агентов, использующихся в тераностике. 69
1.4.2. Увеличение контраста визуализации биообъектов с помощью микро- и наночастиц 74
1.4.3. Терапевтическое применение экзогенных красителей и частиц в биомедицине 75 1.4.3.1.Сваривание биотканей и фототермолиз 75
4.3.2.Фотодинамическая/фототермическая антираковая терапия 77
4.3.3.Антибактериальная терапия 78
1.4.4. Токсичность фотодинамических/фототермических агентов и частиц 80
1.4.5. Доставка красителей и частиц в кожу 82
2. Управление рассеивающими свойствами биологических тканей с помощью иммерсионного метода 87
2.1.Исследование особенностей диффузии гиперосмотических иммерсионных жидкостей в различных типах биотканей (соединительная ткань: склера глаза, твёрдая мозговая оболочка, кость; комбинированная ткань: кожа и мышечная ткань) in vitro, ex vivo и in vivo 87
2.1.1. Методы и материалы 87
2.1.1.1. Используемые ОПА 87
2.1.1.2.Подготовка образцов 89
2.1.1.3.Подготовка экспериментальных животных 92
2.1.1.4.Экспериментальные установки и методики проведения исследований 93
2.1.2. Результаты и обсуждение 101
2.1.2.1.Исследование иммерсионного механизма оптического просветления соединительной ткани in vitro 101
2.1.2.2.Исследование дегидратационного механизма оптического просветления соединительной ткани ex vivo и in vitro 107
2.1.2.3.Взаимодействие гиперосмотических иммерсионных жидкостей с соединительной тканью in vivo 114
2.1.2.4.Оптическое иммерсионное просветление черепной кости in vitro 124
2.1.2.5.Исследование оптического просветления мышечной ткани in vitro.. 126
з
2.1.2.6.Эффективность оптического просветления 130
3. Управление рассеивающими свойствами биологических тканей за счет введения дополнительных рассеивателей 139
3.1.Методы и материалы 139
3.2.Результаты и обсуждение 142
3.2.1. Контрастирование изображений в оптической когерентной томографии печени с помощью наночастиц TiO2 142
3.2.2. Контрастирование изображений в оптической когерентной томографии печени с помощью золотых наночастиц 146
4. Управление поглощающими свойствами биологических тканей с помощью экзогенных красителей 152
4.1.Особенности диффузии метиленового синего и индоцианинового зелёного в различных типах биотканей 153
4.1.1. Материалы и методы 153
4.1.2. Результаты и обсуждение 161
5. Химические и физико-химические методы усиления проницаемости кожи 171
5.1.Влияние этанола на усиление диффузии красителей через роговой слой эпидермиса 171
5.1.1. Материалы и методы 171
5.1.2. Результаты и обсуждение 172
5.2.Мультимодальный подход к усилению диффузии гиперосмотических иммерсионных агентов и транспорта наночастиц в коже 178
5.2.1. Материалы и методы 178
5.2.2. Результаты и обсуждение 182
6. Фракционная микроабляция для чрескожной доставки препаратов 192
6.1.Исследование улучшения проницаемости эпидермиса при его фракционной оптотермической микроабляции (ФОТМА) 192
6.1.1. Материалы и методы 192
6.1.2. Результаты и обсуждение 194
6.2.Исследование влияния абляции эпидермиса на эффективность оптического 197
просветления кожи in vivo
6.2.1. Материалы и методы 197
6.2.2. Результаты и обсуждение 199
6.3. Фракционная лазерная микроабляция (ФЛМА) кожи как метод усиления её проницаемости для микро- и наночастиц 206
6.3.1. Доставка наночастиц TiO2 и микрочастиц Al2O3 в кожу человека ex vivo 209 6.3.1.1.Материалы и методы 209
6.3.1.2.Результаты и обсуждение 211
6.3.2. Доставка наночастиц TiO2 в кожу in vivo 214
6.3.2.1.Материалы и методы 214
6.3.2.2.Результаты и обсуждение 215
6.3.3. Доставка наночастиц TiO2 и микрочастиц Al2O3 в кожу человека in vivo 218 6.3.3.1.Материалы и методы 218
6.3.3.2.Результаты и обсуждение 219
6.3.4. Сравнительное исследование режимов ФЛМА для повышения эффективности чрескожной доставки частиц 227
6.3.4.1.Материалы и методы 227
6.3.4.2.Результаты и обсуждение 230
6.3.5. Использование фракционной лазерной микроабляции и ультразвука для улучшения доставки золотых наночастиц в кожу in vivo
6.3.5.1. Материалы и методы 238
6.3.5.2. Результаты и обсуждение 240
7. Заключение 248
Благодарности 251
Список использованных источников .
- Физико-химические основы иммерсионного метода управления рассеивающими свойствами биологических тканей
- Используемые ОПА
- Контрастирование изображений в оптической когерентной томографии печени с помощью наночастиц TiO2
- Фракционная лазерная микроабляция (ФЛМА) кожи как метод усиления её проницаемости для микро- и наночастиц
Физико-химические основы иммерсионного метода управления рассеивающими свойствами биологических тканей
В течение последних 25 лет наблюдается всё возрастающий интерес к разработке и применению оптических методов в клинической функциональной визуализации физиологических состояний, диагностике и терапии рака и других заболеваний [1, 2, 40]. Такой интерес обусловлен уникальной информативностью, относительной простотой, безопасностью и достаточно низкой стоимостью оптических устройств по сравнению, например, с рентгеновской компьютерной томографией или магниторезонансной томографией. Однако основным ограничением оптических методов диагностики, включающих оптическую диффузионную томографию, оптическую когерентную томографию (ОКТ), конфокальную микроскопию, отражательную спектроскопию и другие, является сильное рассеяние света в биологических тканях и крови, которое является причиной снижения контраста и пространственного разрешения изображений, а также малой глубины зондирования [1, 41, 42].
Для повышения оптической глубины зондирования биотканей разработан ряд методов [43]. Например, предельная глубина зондирования многофотонной микроскопии долгое время не превышала 100 мкм [44], однако комбинация многофотонного флуоресцентного возбуждения с очень высокой эффективностью сбора излучения увеличило глубину визуализации в рассеивающей среде до 2 мм [45, 46]. ОКТ позволяет изучать внутреннюю микроструктуру биотканей на глубину до 3 мм с пространственным разрешением 5-20 мкм без нарушения целостности биотканей [47]. Глубину зондирования до нескольких сантиметров обеспечивает мультимодальный метод визуализации, комбинирующий поглощение света с акустическим детектированием (так называемая фотоакустическая томография) [48].
Одним из самых простых и эффективных методов решения проблемы увеличения глубины и качества изображений внутритканевых структур, а также повышения точности спектроскопической информации от глубоких слоёв биотканей и крови, является временное снижение светорассеяния в биотканях [4, 5, 49]. В нелинейной спектроскопии и визуализации, а также прецизионной лазерной хирургии (в частности нанохирургии клеток), снижение рассеяния света в тканях способствует уменьшению расходимости жестко сфокусированного лазерного пучка и обеспечивает его точную фокусировку на объект, что существенно повышает эффективность процедуры и позволяет снизить энергию излучения, необходимую для успешного проведения визуализации или фотовоздействия [4, 5, 50-53].
Следуя за развитием метода иммерсионной рефрактометрии, применяемой к клеткам, в 1955 г. Barer и соавт. [54] впервые предложили оптическое просветление клеточной суспензии с помощью раствора протеина, имеющего такой же показатель преломления, как и цитоплазма клеток. Идея об оптическом просветлении ткани пришла из офтальмологии в 80-е годы. Первым объектом оптического просветления являлась роговица глаза [55, 56]. В 1991 году метод иммерсионного оптического просветления впервые был применён к склере [57]. Первые работы, посвящённые исследованиям изменения рассеивающих свойств суспензий интралипида, дрожжевых клеток и обескровленной ткани печени под действием растворов ряда сахаров и спиртов (глюкоза, фруктоза, сахароза, маннитол и др.) были опубликованы научной группой проф. Б. Чанса [58, 59] в 1995-96 гг. В это же время понятие «управление» оптическими параметрами биологических тканей было введено в работах научной группы проф. В.В. Тучина [60-62]. Первые работы этой группы были посвящены изучению влияния гиперосмотических иммерсионных жидкостей (тразограф, растворы полиэтиленгликоля и глюкозы) на рассеяние фиброзной оболочки глаза – склеры – с помощью спектроскопических методов. Предложенный подход показал свою перспективность и получил развитие в работах ведущих научных групп во всём мире [7, 8, 50, 63-75].
Ежегодно интерес к методам так называемого «оптического просветления биотканей» возрастает. По данным Web of Science, PubMed и других источников, количество публикаций, посвящённых оптическому просветлению, включающему изучение механизмов взаимодействия различных иммерсионных агентов (в том числе многокомпонентных) с биологическими тканями и их использованию для увеличения эффективности современных оптических методов биомедицинских исследований, увеличивается экспоненциально. В литературе представлены различные примеры физических и химических воздействий, дающих возможность управлять рассеивающими свойствами биотканей. Среди них компрессия [76, 77], растягивание [78], дегидратация [79, 80], коагуляция [81], пропитывание (иммерсия) биосовместимыми химическими веществами [49-53, 82-84], а также фотохимическое [85, 86] и фототепловое [86] просветление.
Большинство методов снижения рассеяния биоткани основаны на согласовании показателей преломления компонентов биоткани либо за счёт замены внутритканевой жидкости иммерсионным агентом, обладающим более высоким показателем преломления, либо за счёт повышения концентрации белков и мукополисахаридов во внутритканевой жидкости в результате диффузии воды из ткани, обусловленной осмосом; при этом показатель преломления внутритканевой жидкости становится ближе к показателю преломления волокон. Кроме того, может возрастать оптическая однородность биоткани благодаря уплотнению рассеивающих центров (например, коллагеновых волокон) как при выдавливании внутритканевой жидкости из области воздействия, так и при дегидратации за счёт действия агентов или испарения воды [5,
51, 52, 76-80, 87, 88]. Конкретные механизмы оптического просветления зависят от типа биоткани и применяемого метода.
В настоящее время внешняя механическая компрессия используется как метод, позволяющий увеличить разрешение и контраст изображений ОКТ и микроскопии [76, 77, 79, 87, 89-91]. Слои с разными механическими свойствами сжимаются в разной степени, что приводит к различию их оптических свойств; на этом основана оптическая когерентная эластография [92-94]. Кроме того, механическая компрессия кожи позволяет оценить содержание в ней хромофоров, поглощение которых в нормальных условиях завуалировано поглощением других хромофоров. Так, выдавливание крови из области приложения компрессии позволяет оценить по спектрам диффузного отражения содержание в коже каротиноидов [95], а по спектрам флуоресценции содержание в коже меланина [96, 97]. Растягивание биоткани производит аналогичный эффект [78, 98]. Частичного просветления можно достичь и при непосредственном воздействии лазерного пучка небольшой интенсивности на биоткань за счет тепловой дегидратации области облучения, а также при коагуляции ткани [79-81].
Для ряда применений, особенно в случае лазерных терапевтических или хирургических вмешательств, можно использовать управление оптическими свойствами биотканей с помощью фотохимического или фототеплового воздействия. Например, в работах [12, 99-101] предложен метод управления оптическими свойствами жировой ткани, которая обычно является сильно рассеивающей биотканью. В основе метода лежит комбинированное фотохимическое и фототепловое действие [102] на клетки жировой ткани. При малых интенсивностях облучения в мембране образуются новые поры или увеличиваются уже существующие, что способствует эффективному обмену содержимого клетки с окружением. Для жировых клеток наличие пор способствует липолизу, в результате которого межклеточное пространство заполняется содержимом клеток и продуктами их распада (триглицериды, жирные кислоты, вода и глицерин) [85, 103, 104]. Появление в межклеточном пространстве такой иммерсионной жидкости способствует процессу оптического просветления жировой ткани [85].
При использовании экзогенных хромофоров эффективность взаимодействия света с тканью может быть существенно более высокой и селективной. Использование красителей для целей диагностики и терапии нашло широкое применение в современной медицине. Хорошо известно применение красителей как контрастных веществ при визуализации потоков крови, определения сердечного выброса и функции печени, обнаружения атеросклеротических бляшек, локализации различных опухолей, скрытых в толще тканей [105-111] и как фотосенсибилизаторов при фотодинамической и фототермической терапии рака [112-116], для сваривания тканей [117-121], лечения заболеваний кожи [122-127] и других приложений. Под действием света красители, применяемые для визуализации, флуоресцируют, что позволяет локализовать объект исследования. Многие их них при этом обладают фотодинамическими свойствами и способствуют генерации синглетного кислорода или других активных форм кислорода и радикалов, разрушающих сенсибилизированные раковые клетки и бактерии [11, 113, 114, 128]. Увеличение энергии облучения в полосе поглощения красителей вызывает локальный нагрев и разрушение биотканей, что используется для локального термолиза и абляции [115, 116, 127, 129].
В последнее время для управления рассеивающими и поглощающими свойствами биотканей всё больше используются суспензии наночастиц. Например, наночастицы диоксида титана (TiO2), обладающего полосой поглощения в УФ диапазоне, широко применяются в косметической продукции для защиты кожи от воздействия УФ излучения [130-132].
Новыми направлениями в современной медицине является использование наноматериалов в качестве контрастирующих агентов для визуализации клеток [133, 134] и областей биоткани [135-137], и агентов, позволяющих осуществлять гипертермию меченых клеток без нагрева окружающей здоровой ткани [138, 139].
Металлические наночастицы с плазмонным резонансом представляют особый интерес для биомедицины благодаря своим уникальным оптическим и физико-химическим свойствам, поскольку хорошо известно, что резонансное поглощение света металлической наночастицей может быть настроено на нужный оптический диапазон за счет изменения размера, формы, материала и структуры [139142]. Кроме того, использование наночастиц золота в качестве «шаблонов» и наноконтейнеров позволяет получать на их основе многофункциональные наноструктуры для тераностики (терапии и диагностики) [143-145].
В данном обзоре обсуждаются структура и оптические параметры некоторых соединительных и клеточных биотканей, физические и молекулярные механизмы иммерсионного метода оптического просветления этих биотканей, использование наночастиц для повышения рассеивающих свойств биотканей и применение данных методов для повышения глубины зондирования и разрешающей способности оптических методов диагностики, использование красителей и наночастиц для фотодинамического и фототермического воздействия на очаги воспаления и злокачественные новообразования в коже, а также методы преодоления кожного барьера для улучшения эффективности доставки иммерсионных агентов, лекарственных препаратов и частиц.
Используемые ОПА
Приблизительно 95% органического матрикса приходится на коллаген. Вместе с минеральными компонентами коллаген является главным фактором, определяющим механические свойства кости. Кроме коллагена в состав органического матрикса входят протеины, клетки крови и липиды [234]. В сухом деминерализованном костном матриксе содержится около 17% неколлагеновых белков, среди которых находятся и белковые компоненты протеогликанов [175].
Межклеточный органический матрикс компактной кости составляет около 20%, неорганические вещества – 70% и вода – 10% [235]. По данным [234] минеральные компоненты трубчатой костной ткани составляют 16%, липиды – 54%, протеины – 16% и вода – 16%. В губчатой кости преобладают органические компоненты, которые составляют более 50%, на долю неорганических соединений приходится 33–40%. Количество воды сохраняется в тех же пределах, что и в компактной кости [175, 235]. По данным А. Уайта и соавт. [236], неорганические компоненты составляют около 1/4 объёма кости; остальную часть занимает органический матрикс. Вследствие различий в относительной удельной массе органических и неорганических компонентов на долю нерастворимых минералов приходится половина массы кости. Пористость костной ткани составляет от 5% до 10% [234].
Микроструктура трубчатой кости состоит из вторичных остеонов диаметром 200-300 мкм [237], которые содержат большие сосудистые каналы (50-90 мкм диаметром), окружённые периферическими ламеллярными кольцами (толщиной 3 – 7 мкм), так называемыми «цементными стяжками», на внешней границе [238]. На наноструктурном уровне ламеллы состоят из органических минерализованных коллагеновых волокон I типа (до 15 мкм длиной и 50-70 нм в диаметре, сформированных регулярно упакованными субнаноструктурными молекулами коллагена), связанных и погружённых в неорганический карбонизированный нанокристалл апатита (около 30 нм в длину и ширину, 2-3 нм толщиной) [239, 240].
Одним из главных компонентов живой кости является вода. Вода в кости находится в связанном состоянии с минеральной фазой, с органической фазой (коллаген и цементное вещество) или в свободном состоянии (объёмная вода) [241, 242]. Наиболее сильно связанная вода – это вода, находящаяся в апатитоподобных кристаллах (около 35 мг воды/г минерала) [243]. Значительно менее сильно связанная фракция – это вода, связанная с коллагеновыми фибриллами. В неминерализированном состоянии коллагеновые волокна связывают большую объёмную фракцию воды (до 60%) [244]. Во время кальцификации кристаллы апатита депонируются в органическом матриксе, постепенно замещая остеоидную воду и снижая её объёмную фракцию до 20%. В итоге эта фракция падает до 10% в старческих костях [245]. Объёмная вода заполняет поры кальцифицированного матрикса, который формирует сеть взаимосвязанных каналов (лакуноканаликулярную систему), которая соединяет Гаверсовы каналы (сосудистая система кости) с остеоцитами, встроенными в минерализированный матрикс [241, 244]. Эта коммуникационная сеть служит для транспорта питательных веществ, отходов и сигнальных молекул из сосудистой системы в остеоциты и обратно. Водные каналы также являются транспортными путями для ионов кальция и фосфатов поступающих в и из костной ткани, которая служит минеральным резервным фондом организма [241].
Показатель преломления цельной черепной кости оценивался Ascenzi и Fabry [246] при различных стадиях минерализации в диапазоне от 1.555 до 1.564. Компоненты этой ткани имеют следующие показатели преломления: апатиты - 1.623, гидратированный коллаген (I типа) - 1.43 и липиды 1.45 (см. табл. 1.1).
На рисунках 1.7 (б) и 1.8 представлены коэффициент поглощения и транспортный коэффициент рассеяния образца черепной кости свиньи in vitro. В отличие от спектров склеры, ТМО и слизистой оболочки, в спектре поглощения и рассеяния кости полосы поглощения воды слабо выражены.
Структурно скелетная мышца относится к поперечнополосатым мышечным тканям. Она состоит из многочисленных удлинённых волокон (рисунок 1.10). Мышечное волокно рассматривают как многоядерную клетку, покрытую 10-нм мембраной - сарколеммой. Диаметр функционально зрелого поперечнополосатого мышечного волокна обычно составляет от 10 до 100 мкм, а длина волокна соответствует длине мышцы. В каждом мышечном волокне вдоль него в саркоплазме расположено множество нитевидных образований – миофибрилл, упакованных в пучки и окруженных клеточной мембраной. Толщина миофибриллы составляет менее 1 мкм [175]. В саркоплазме мышечных волокон обнаруживается и ряд других структур, в том числе митохондрии, объёмная доля которых составляет по разным данным или 5% [247] или от 4 до 15% [248] от объёма волокна.
В мышечной ткани взрослых животных и человека содержится от 72 до 80% воды. Около 20-28% от массы мышцы приходится на долю сухого остатка, главным образом белков. Основными белками, входящими в состав мышечных волокон, являются миозин (50-55% от сухой массы миофибрилл) и актин (20% от сухой массы миофибрилл). Толстые нити (миофиламенты) образуются путем соединения большого числа определенным образом ориентированных в пространстве молекул миозина. Помимо белков, в состав сухого остатка входят гликоген и другие углеводы, различные липиды и другие химические соединения [175].
Объёмная доля волокон мышечной ткани составляет 0.244+0.003 [160]. В свою очередь волокна мышечной ткани формируются из белковых миофибрилл и митохондрий.
Поглощение мышечной ткани в основном определяется поглощением миоглобина и воды (52.0 ± 0.3% [250] или 73.0 ± 0.5% [251]). На рисунке 1.11 представлен спектр коэффициента поглощения образца мышечной ткани быка. Было показано, что широкие пики поглощения на длинах волн 560 и 760 нм связаны с присутствием миоглобина и его производных, таких как оксимиоглобин и метмиоглобин [252, 253]. Пики поглощения на длинах волн 540 и 570 нм, хорошо разрешаемые на рисунке 1.11, относятся к оксимиоглобину [252-254]. Пики поглощения выше 900 нм совпадают с пиками, присутствующими в спектрах поглощения других тканей, и относятся к внутритканевой воде. Спектральная зависимость транспортного коэффициента рассеяния скелетной мышцы близка по форме к спектрам рассеяния мягких фиброзных тканей (см. рис. 1.8). На спектр рассеяния также оказывает влияние присутствие в ткани миоглобина и воды (см. рис. 1.12).
Контрастирование изображений в оптической когерентной томографии печени с помощью наночастиц TiO2
Образец (2) помещался на предметное стекло (1) (эпидермисом вверх) и покрывался полиэтиленовой плёнкой (5) с окном 10x20 мм2 (3), соответствующим области с повреждением РСЭ (4), чтобы исключить высыхание образца со стороны дермы. На поверхность четырёх образцов в области окна наносился ОПА. Аналогично подготовленные четыре образца оставлялись на воздухе. Все образцы находились при температуре 20C в герметично закрытой камере, заполненной гранулами из силикагеля, чтобы предотвратить неконтролируемое поглощение тканью воды из окружающей среды. Образцы взвешивались каждый час (исключая ночное время) в течение нескольких недель. Измерения прекращались при достижении постоянного веса каждого образца. Перед взвешиванием ОПА тщательно удалялся с поверхности образца, после взвешивания наносилась новая порция агента. Измерения проводились при комнатной температуре.
Толщина образцов биоткани измерялась микрометром, для чего образцы помещались между двумя предметными стеклами, и измерения выполнялись в нескольких точках образца. Точность каждого измерения составляла ±10 мкм. Полученные значения усреднялись, рассчитывалось среднеквадратичное отклонение.
In vivo исследования проводились на склере и коже лабораторных животных. Все эксперименты, уход и содержание животных осуществлялись в соответствии с Директивой № 63 от 22 сентября 2010 года Европейского парламента и Совета Европейского Союза «О защите животных, используемых для научных исследований» [752] и «Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник от 06.04.1973 [753]. Эксперименты проводились с разрешения комитета по этике ГОУ ВПО «СМУ Росздрава».
Одним из объектов исследований служил глаз кролика альбиноса. Возраст кролика составлял 5 месяцев. Кролик был подвергнут анестезии с помощью инъекции 0.1% раствора natrium ethaminal. Доза вводимого препарата составила 40 мл/кг. Агент (40% водный раствор глюкозы для инъекций) наносился на поверхность склеры капельным способом периодически с интервалом 5 мин. Общий объём введенного раствора составил 0.1 мл. Измерения коэффициента отражения были начаты через 30 минут после инъекции. Чтобы исключить непроизвольное моргание в течение эксперимента, использовался стандартный векодержатель.
In vivo измерения спектров диффузного отражения кожи проводились на белых лабораторных крысах. Возраст крыс составлял около 9 месяцев, вес - около 200 г. Животные был анестезированы с помощью интраперитональной инъекции 1%-го раствора natrium ethaminal дозой 40 мг/кг веса животного. После обездвиживания животного на участке измерения (бедро) удалялся волосяной покров. Для преодоления защитного барьера эпидермиса введение ОПА выполнялось в виде подкожной инъекции. Объём вводимого препарата составлял 0.1 мл.
Измерения коэффициентов коллимированного пропускания и диффузного отражения биоткани выполнялись с помощью оптического многоканального спектрометра ЛЭСА-бмед (БиоСпек, Россия) в спектральном диапазоне 400-800 нм с источником излучения ксеноновой лампой или с помощью многоканального спектрометра USB4000 (Ocean Optics Inc., США) в спектральном диапазоне 400-1000 нм с источником излучения галогенной лампой HL-2000 (Ocean Optics Inc.,). Схема экспериментальной установки показана на рисунке 2.3.
Для измерения коллимированного пропускания образцы кожи закреплялись на рамке с отверстием 7x7 мм2 и помещались в кювету между двумя специализированными волоконно-оптическими кабелями (P400-1-UV-VIS, Ocean Optics, США) с внутренним диаметром 400 мкм и числовой апертурой 0.2. Одно волокно служило для доставки излучения к образцу, а другое -для сбора прямо прошедшего излучения (рис. 2.3 А). Для обеспечения коллимированности пучка на торцах волокон с помощью стандартных разъемов SMA-905 закреплялись коллиматоры 74-ACR (Ocean Optics, США).
Для измерения коэффициента диффузного отражения использовалась специально разработанная конструкция волоконно-оптического датчика: центральное волокно служило для доставки излучения к поверхности биоткани, а боковое волокно использовалось для сбора диффузно отраженного излучения. Волокна закреплялись в корпусе для обеспечения фиксированного расстояния между концами волокон и поверхностью образца (рис. 2.3 Б). Расстояние между осветительным волокном и поверхностью кожи составляло 12 мм. Конфигурация используемого в эксперименте волоконно-оптического датчика обеспечивала нормальное освещение поверхности кожи пятном диаметром 4 мм и сбор отраженного биотканью излучения под углом 20 относительно подводящего световода с участка ее поверхности диаметром 8 мм. Соотношение площадей засветки и светосбора составляло приблизительно один к четырем. Такая геометрия датчика давала возможность регистрировать только диффузное отражение света биотканью, исключая зеркально отраженный компонент, при этом минимизировались потери обратно рассеянного излучения в длинноволновой области спектра. Датчик регистрировал усредненный по площади сбора излучения сигнал. Воспроизводимость результатов измерений находилась в пределах 5%. В качестве эталона отражения использовался отражательный стандарт WS-1-SL (Ocean Optics, США).
Метод отражательной спектроскопии относится к неинвазивным методам исследования. Данный метод являлся, в частности, бесконтактным, так как торцы используемых световодов не соприкасались с поверхностью биоткани. При переходе зондирования от одного участка склеры к другому отмечались изменения уровня сигнала в пределах 10%, однако динамика изменения диффузного отражения склеры под действием иммерсионного агента имела одинаковый характер независимо от участка сбора излучения. Измерения выполнялись в спектральном диапазоне 400 - 750 нм. Регистрация спектров производилась до нанесения ОПА и через каждые 30 секунд в течение 30 минут.
Фракционная лазерная микроабляция (ФЛМА) кожи как метод усиления её проницаемости для микро- и наночастиц
В работе [783] глубина детектирования рассматриваемой ткани (интактный образец поясничного межпозвоночного диска, -600 мкм) существенно превышает значение ГД интактного образца скелетной мышцы быка, полученное в настоящей работе (-350 мкм). По-видимому, различия в значениях глубины полезного сигнала, получаемого из ОКТ-изображений, связаны, во-первых, с различиями в структуре и свойствах исследуемых тканей, а, во-вторых, с использованием авторами работы [783] техники поляризационного ОКТ, которая позволяет улучшить изображение тканей с ярко выраженными анизотропными свойствами.
По литературным данным показатель преломления скелетной мышцы быка, измеренный в диапазоне 560-640 нм составляет 1.382+0.004 [784]. Различие между показателями преломления внутритканевой жидкости (1.35), миофиламентами (1.49) и митохондриями (1.4) создаёт сильное рассеяние биоткани. Под действием глюкозы, проникающей во внутритканевое пространство, происходит согласование показателей преломления компонентов биоткани, что приводит к повышению её оптической прозрачности. Так, в работе [785] показано, что под действием 40%-раствора глюкозы коэффициент коллимированного пропускания образца абдоминальной мышечной ткани крысы увеличился более чем на 70% в течение 30 мин на длине волны 900 нм. По данным работы [786] коэффициент коллимированного пропускания миокарда свиньи увеличился приблизительно в 5 раз в течение 85 мин на длине волны 900 нм при использовании в качестве ОПА также 40%-раствора глюкозы.
Авторы работы [785] сообщили о некоторой дегидратации образцов биоткани в процессе оптического просветления. Однако использование в настоящей работе 40%-раствора глюкозы для внутривенного введения с большей кислотностью (рН = 3.5), напротив, вызывало значительное увеличение толщины образца биоткани (в среднем на 38%). Очевидно, что увеличение объёма ткани при набухании приводит к разрыхлению волокон и увеличению внутритканевого пространства, что, в свою очередь способствует ускорению процесса диффузии, в то время как дегидратация ткани, т.е. её уплотнение, затрудняет проникновение молекул ОПА во внутритканевое пространство. В тоже время, в работе [786], использование такого же раствора глюкозы для внутривенного введения (рН = 3.5) для оптического просветления тканей миокарда вызывало уменьшение толщины образцов в среднем на 14%, что на наш взгляд связано с различиями в белковом составе скелетных и сердечных мышц организма. Так, например, содержание миофибриллярных белков в сердечной мышце значительно меньше ( 40% от объёма волокна), по сравнению со скелетной ( 70% от объёма волокна) [175, 249], в то время как концентрация белков стромы в миокарде выше, чем в скелетной мышце [175]. По-видимому, данные структурные особенности и химический состав миокарда препятствуют его набуханию в растворах с низким рН.
Представленные результаты показывают, что под действием 40%-ного раствора глюкозы наблюдается оптическое просветление скелетной мышцы in vitro. Так в течение 90 мин при увеличении оптической глубины зондирования на 14% контраст ОКТ-изображений увеличился в 4 раза, а оптическая глубина детектирования структурных элементов ткани – в 2.4 раза. При этом наблюдается расширение внутритканевого пространства между миофибриллами, т.е. набухание биоткани, за счёт низкого рН ( 3.5) раствора. Данный эффект сходен с эффектами, наблюдаемыми при воздействии растворов глюкозы на соединительные ткани (склера, ТМО, дерма кожи).
Эффективность оптического просветления может служить параметром, позволяющим сравнивать различные ОПА с точки зрения относительного изменения прозрачности биотканей под действием ОПА. Для определения эффективности оптического просветления используются различные подходы, в зависимости от измеряемых параметров: отношение значений транспортного коэффициента рассеяния ткани до и через 20 мин после начала иммерсии [321], отношение коллимированного пропускания образца после достижения им максимального оптического просветления к коллимированному пропусканию интактного образца [782], отношение интенсивностей полного пропускания, включающего коллимированный и диффузный компоненты, через определённое время и в начальный момент [322], максимальное разрешение объекта, видимого через образец ткани in vitro, и относительное изменение параметра, характеризующего отношение сигнал/шум, при визуализации кровеносных сосудов с помощью метода анализа контраста лазерных спеклов in vivo [323].
На основе результатов измерения коэффициента коллимированного пропускания нами оценивалась степень (эффективность) оптического просветления образцов биоткани как относительное изменение усреднённого коэффициента пропускания всех исследуемых образцов в исследуемом диапазоне длин волн: дTc=Tc(0c(t = о) (213 где T(t) - усреднённое значение параметра в различные моменты времени, Т(t = 0) - начальное усреднённое значение параметра.
Метод оценки эффективности оптического просветления как относительной разности максимального и минимального значений коэффициента коллимированного пропускания позволяет оценить степень прозрачности биоткани для оптического излучения без учёта изменения структурных свойств ткани. Однако, как показано в работах [787, 788], растворы многоатомных спиртов и глюкозы вызывают сжатие биотканей (в частности, кожи) в течение периода наблюдения до 120 мин. Уменьшение толщины исследуемого образца биоткани согласно закону Бугера-Ламберта вносит дополнительный вклад в наблюдаемое увеличение значения Tc. Tc (t) = ехр[-t (t)l(t)], (2.14) где Tс(t) - временная зависимость коллимированного пропускания образца биоткани, l(t) -временная зависимость толщины биоткани. На наш взгляд оценка изменения значения t [из уравнения (2.14)] позволяет получить более объективную информацию об изменении рассеивающих свойств (изменениями 132 поглощающих свойств в исследуемом спектральном диапазоне можно пренебречь), т.к. учитывает возможное изменение толщины образца биоткани в процессе оптического просветления. Тогда эффективность оптического просветления можно оценить с помощью выражения: Л = х100%, (2.15) t{t = 0) где ц, (t = 0) - начальный коэффициент ослабления интактного образца биоткани, ц, (t) -значение коэффициента ослабления в различные моменты времени. Аналогично можно рассчитать значение степени оптического просветления исходя из оценки коэффициента ослабления на основе ОКТ-измерений [уравнение (2.2)].
В таблице 2.3 обобщены значения эффективности оптического просветления исследуемых биологических тканей под действием иммерсионных оптических агентов, рассчитанные с помощью соотношений (2.13) и (2.15) на основе измерения коэффициента коллимированного пропускания и (2.14) на основе ОКТ-измерений в спектральном диапазоне 930±50 нм. В таблице также представлены оценки степени оптического просветления биотканей, полученные на основе литературных данных. Поскольку полное время оптического просветления для различных типов биоткани и ОПА существенно различалось, в таблице представлены значения степени оптического просветления через 10 мин после начала взаимодействия биотканей с ОПА. Для сравнения представлена максимальная степень оптического просветления, которая наблюдалась через 8-12 мин для образцов склеры и твёрдой мозговой оболочки и через 60-90 мин для образцов кожи при измерении коллимированного пропускания. Естественное испарение воды из образца кожи до достижения максимальной степени просветления происходило в течение 270-300 мин.
Из таблицы следует, что значения эффективности оптического просветления, рассчитанные на основании выражения (2.13), различаются на порядок. Кроме того, не наблюдается зависимости эффективности от концентрации используемых ОПА, при этом нельзя уверенно отрицать такую зависимость, т.к. данный эффект может быть связан с различными геометрическими параметрами исследуемых образцов биотканей.
Используя результаты оценки эффективности с помощью выражения (2.15) можно избежать данной неопределённости. Так, хорошо видно, что с увеличением концентрации глюкозы степень оптического просветления кожи увеличивается.