Введение к работе
Актуальность темы
В современных отраслях науки, изучающих живые организмы, актуальным является получение качественно новых методов и подходов для наблюдения различных процессов в интактных живых организмах. Одним из таких методов стало применение флуоресцентных белков.
Флуоресцентные белки активно используются в исследовании прижизненных процессов в живых клетках, тканях и организмах, таких как активность работы промотеров, биохимические взаимодействия, локализации различных структур и др. Ген флуоресцентного белка с помощью стандартных биохимических методов вносится в генетический аппарат исследуемого объекта и дальнейшая экспрессия белка и его свечение не требуют наличия дополнительных кофакторов или специфических реагентов (кроме атмосферного кислорода). Набор существующих на данный момент флуоресцентных белков достаточно разнообразен: максимум эмиссии флуоресценции белков занимает широкую область спектра: от синей (менее 450 нм) до красной (708 нм) частей видимого излучения. Также различным флуоресцентным белкам свойственно большое разнообразие значений таких параметров, как квантовый выход флуоресценции, коэффициент экстинкции, фотостабильность и пр.
Обычно новые мутанты флуоресцентных белков получают с помощью случайного или направленного мутагенеза по нескольким ключевым позициям в белке с отбором удовлетворяющих по характеристикам клонов. Такой подход дает мало информации о влиянии каждой замены на свойства белка и не позволяет наперед прогнозировать полученные свойства, так как взаимосвязь между оптическими свойствами флуоресцентных белков и их структурой практически не исследована. Отсутствует методика прогнозирования флуоресцентных свойств того или иного флуоресцентного белка на основании его структуры, т.е. общая задача разработки алгоритма дизайна белков с заранее заданными свойствами не решена. Такая задача может быть решена путем анализа свойств мутантных белков, содержащих единичные точечные аминокислотные замены, с последующим моделированием их структур in silico с помощью методов квантовой химии и молекулярной динамики для поиска корреляций параметров структур с оптическими свойствами.
Цели и задачи исследования
Целью данного исследования является изучение влияния аминокислотных замен на структуру и свойства мутантов красного флуоресцентного белка mRFPl in silico и in vitro с использованием методов квантовой химии, молекулярной динамики, генной инженерии и спектрально-люминесцентной спектроскопии. Исходя из этого, были сформулированы следующие задачи исследования:
создать топологию хромофора белка mRFPl как нового аминокислотного остатка в силовом поле и вычислить ее параметры;
создать PDB-файлы для мутантов белка mRFPl, отредактировать файлы силового поля и создать топологии, соответствующие хромофорам мутантов;
рассчитать равновесные трехмерные структуры мутантов белка mRFPl и провести анализ влияния замены аминокислотного остатка глутамина по 66 положению на геометрические параметры белка;
методом генной инженерии создать плазмиды, содержащие гены 20 мутантных белков на основе белка mRFPl со всеми вариантами аминокислотных остатков по 66 положению, провести целевую наработку препаратов белка, определить оптические свойства полученных препаратов;
провести анализ влияния замены аминокислотного остатка глутамина по 66 положению на оптические свойства белка и сопоставить с изменением геометрических параметров;
методами нелинейной лазерной флуориметрии установить истинные фотофизические параметры отдельных молекул белков и концентрации различных форм белка в растворе.
Научная новизна результатов и практическая значимость работы
Разработан и опробован метод генно-инженерного внесения любых наперед заданных мутаций в ген красного мономерного флуоресцентного белка mRFPl в области хромофора, позволяющий проводить направленный мутагенез белков с целью скрининга свойств в зависимости от изменения аминокислотной последовательности. С помощью метода впервые получено девятнадцать уникальных новых мутантов белка mRFPl по 66 положению в виде концентрированных препаратов белка и определены их оптические свойства.
Впервые разработан метод описания и параметризации объектов типа красных флуоресцентных белков в силовом поле OPLS-AA (в частности, хромофора как отдельной
уникальной аминокислоты) для проведения молекулярно-динамических расчетов состояния и геометрии белков в растворе in silico.
Впервые выявлены эмпирические зависимости оптических свойств флуоресцентных белков от геометрических параметров аминокислот, составляющих и/или окружающих хромофор, что может быть применено при планировании мутагенеза, направленного на получение новых флуоресцентных белков с улучшенными свойствами.
Разработан метод, позволяющий определять фотофизические параметры индивидуальных форм хромофоров в составе смеси без ее разделения, что позволит более точно следить за характеристиками как при получении новых вариантов флуоресцентных белков, так и при применении их как маркеров процессов в живых системах.
Впервые определенные данным методом фотофизические характеристики белка mRFPl и некоторых его мутантов показали, что истинный коэффициент экстинкции отдельных форм флуоресцентных белков может значительно превышать 100 000 М" см" .
Предложено новое направление в получении и исследовании свойств красных флуоресцентных белков, поскольку контроль за степенью созревания и концентрацией нужных форм в растворе позволит увеличить яркость в несколько раз, что может привести к улучшению чувствительности многих методов исследования живых организмов.
Положения, выносимые на защиту
предложен метод генно-инженерного внесения любых наперед заданных мутаций в ген красного мономерного флуоресцентного белка mRFPl в области хромофора, позволяющий проводить направленный мутагенез с целью скрининга свойств в зависимости от изменения аминокислотной последовательности;
разработан метод описания и параметризации объектов типа красных флуоресцентных белков в силовом поле OPLS-AA, позволяющий проводить молекулярно-динамические расчеты состояния и геометрии белков в растворе in silico;
выявлены эмпирические зависимости оптических свойств флуоресцентных белков от геометрических параметров аминокислот, составляющих и/или окружающих хромофор, что может применяться при планировании мутагенеза, направленного на получение новых флуоресцентных белков с улучшенными свойствами;
разработан метод, позволяющий определять фотофизические параметры индивидуальных форм хромофоров в составе смеси без ее разделения.
Апробация работы
Основные результаты работы были доложены на конференции «Альманах клинической медицины» в 2006 году, международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», студенческих конференциях Факультета Биоинженерии и Биоинформатики МГУ в 2006-2007 годах.
Публикации
По результатам работы опубликовано 9 работ, из них статей в рецензируемых журналах, включенных в список ВАК РФ - 5, тезисов докладов и материалов конференций - 4.
Личный вклад автора
Все основные результаты работы получены лично диссертантом. Вклад диссертанта в работу является определяющим.
Структура диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Объем диссертации составляет 127 страниц, в том числе 35 рисунков, 21 таблица и 27 формул. Список цитируемой литературы включает 94 наименования.
