Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 12
1.1 Особенности строения и функционирования эритроцита 13
1.1.1 Строение и функции гемоглобина эритроцита 13
1.1.2 Строение плазматической мембраны и цитоскелета эритроцита 16
1.2 АТФ: свойства, функции, специфические рецепторы клеток крови 19
1.3 Инсулиноподобный фактор роста 1: свойства, функции, специфические рецепторы эритроцита 21
1.4 Оксид азота (NO): синтез, функции и образование комплексов с гемоглобином в эритроците 23
1.5 Патологии роста: соматотропная недостаточность, синдром Шерешевского-Тернера, акромегалия 26
ГЛАВА 2 Материалы и методы 29
2.1 Приготовление растворов и препаратов 29
2.2 Методы исследования 31
2.2.1 Спектроскопия комбинационного рассеяния гемопорфирина гемоглобина эритроцита 31
2.2.2 Резонансная спектроскопия комбинационного рассеяния каротиноидов плазмы крови 33
2.2.3 Метод лазерной интерференционной микроскопии 35
2.2.4 Метод спиновых меток 37
2.2.5 Метод атомно-силовой микроскопии 38
2.2.6 Флуоресцентные методы 40
2.2.7 Метод определения морфологии эритроцитов 42
2.2.8 Методы определения антиоксидантного статуса крови 42
2.2.8.1 Определение концентрации гемоглобина в гемолизате крови 42
2.2.8.2 Определение содержания небелковых тиолов в крови 43
2.2.8.3 Определение содержания ТБК-активных продуктов в плазме крови 43
2.2.8.4 Определение активности супероксиддисмутазы в гемолизате крови
2.2.8.5 Определение активности каталазы в гемолизате крови 45
2.2.8.6 Определение активности церулоплазмина в плазме 46
2.2.8.7. Определение активности неферментных антиоксидантов плазмы FRAP-методом 46
2.2.9 Методы исследования патологий роста в клинике 46
2.2.10 Статистическая обработка полученных результатов 47
ГЛАВА 3 Результаты исследования и их обсуждение 49
3.1 Исследование роли рецепции АТФ в регуляции кислородтранспортной функции изолированного эритроцита 49
3.1.1 Исследование действия АТФ на конформацию гемопорфирина гемоглобина изолированного эритроцита 49
3.1.2 Исследование действия АТФ на морфологию изолированного эритроцита 54
3.1.3 Исследование действия АТФ на плотность упаковки молекул гемоглобина в изолированном эритроците 56
3.1.4 Исследование действия АТФ на амплитуду рельефа поверхности изолированного эритроцита 60
3.1.5 Исследование действия АТФ на вязкость мембраны изолированного эритроцита 62
3.1.6. Исследование изменения содержания внутриклеточного кальция и флуоресценции триптофана в изолированном эритроците при действии АТФ 64
3.2 Исследование роли рецепции АТФ в регуляции кислородтранспортной функции эритроцита в крови 66
3.2.1 Исследование действия АТФ на конформацию гемопорфирина гемоглобина эритроцита в крови 66
3.2.2 Исследование действия АТФ на морфологию эритроцита в крови 71
3.2.3 Исследование действия АТФ на плотность упаковки молекул гемоглобина в эритроците в крови 73
3.2.4 Исследование действия АТФ на амплитуду рельефа поверхности эритроцита в крови 77
3.3 Исследование роли внутриклеточного кальция в регуляции кислородтранспортной функции изолированного эритроцита 79
3.3.1 Исследование действия внутриклеточного кальция на конформацию гемопорфирина гемоглобина изолированного эритроцита 79
3.3.2 Исследование действия внутриклеточного кальция на морфологию изолированного эритроцита 3.3.3 Исследование действия внутриклеточного кальция на плотность упаковки молекул гемоглобина в изолированном эритроците 86
3.3.4 Исследование действия внутриклеточного кальция на амплитуду рельефа поверхности изолированного эритроцита 89
3.4 Исследование роли рецепции инсулиноподобного фактора роста 1 в регуляции кислородтранспортной функции изолированного эритроцита 91
3.4.1 Исследование действия ИФР-1 на конформацию гемопорфирина гемоглобина изолированного эритроцита 91
3.4.2 Исследование действия ИФР-1 на морфологию изолированного эритроцита 95
3.4.3 Исследование действия ИФР-1 на плотность упаковки молекул гемоглобина в изолированном эритроците 97
3.4.4 Исследование действия ИФР-1 на амплитуду рельефа поверхности изолированного эритроцита 101
3.4.5 Исследование действия ИФР-1 на вязкость мембраны изолированного эритроцита 102
3.4.6. Исследование изменения интенсивности флуоресценции триптофана в изолированном эритроците при действии ИФР-1 104
3.5 Исследование роли рецепции инсулиноподобного фактора роста 1 в регуляции кислородтранспортной функции эритроцита в крови 105
3.5.1 Исследование действия ИФР-1 на конформацию гемопорфирина гемоглобина эритроцита в крови 105
3.5.2 Исследование действия ИФР-1 на морфологию эритроцита в крови 110
3.5.3 Исследование действия ИФР-1 на плотность упаковки молекул гемоглобина в эритроците в крови 111
3.5.4 Исследование действия ИФР-1 на амплитуду рельефа поверхности эритроцита в крови 114
3.6 Исследование действия соматотропного гормона на конформацию гемопорфирина гемоглобина эритроцитов в крови 115
3.7 Исследование молекулярно-клеточных параметров эритроцитов в крови при соматотропных патологиях и после терапии 117
3.7.1 Исследование состояния доноров с соматотропными патологиями в клинике 117
3.7.2 Исследование влияния соматотропных патологий на конформацию гемопорфирина гемоглобина эритроцита в крови 120
3.7.3 Исследование влияния соматотропных патологий на плотность упаковки молекул гемоглобина в эритроците в крови 124
3.7.4 Исследование влияния соматотропных патологий на антиоксидантный статус крови 128
3.7.5 Исследование влияния соматотропных патологий на конформацию каротиноидов в плазме крови 133
Заключение 137
Выводы 141
Список цитируемых источников
- АТФ: свойства, функции, специфические рецепторы клеток крови
- Резонансная спектроскопия комбинационного рассеяния каротиноидов плазмы крови
- Исследование действия АТФ на конформацию гемопорфирина гемоглобина изолированного эритроцита
- Исследование действия ИФР-1 на конформацию гемопорфирина гемоглобина эритроцита в крови
АТФ: свойства, функции, специфические рецепторы клеток крови
кольца, соединяет атом железа с N-атомом гистидина имидазольного Молекула Гб состоит из 4 гемов, а также 1, 2, 1 и 2 полипептидных цепей, образующих по 8 спиральных участков. Каждая -цепь содержит 141, а цепь – 146 аминокислотных остатков. Субъединицы Гб образуют 12- и 21 димеры за счет гидрофобных взаимодействий [61; 62]. Гем представляет собой порфириновый макроцикл, локализованный в гидрофобной области полипептидной цепи. Атом Fe2+ гемопорфирина координационно связан с 4 атомами азота пиррольных групп плоского порфиринового кольца. Пятая координационная связь, перпендикулярная плоскости кольца, шестая валентность в дезоксиГб свободна, а в оксиГб занята О2. Две ионизированные боковые группы пропионовых кислот выступают на поверхности молекулы. Следует отметить, что напротив проксимального гистидина располагается дистальный гистидин, который создает оптимальные условия для связывания О2 [27; 63; 64].
В эритроцитах пентакоординированный дезоксиГб (T-форма) образует искаженный октаэдр, т.к. молекулы воды в цитоплазме клетки являются лигандами слабого поля. При этом, на внешних 3d-орбиталях присутствует 4 неспаренных электрона, а железо находится в высокоспиновом состоянии [65–67]. В метГб (Fe3+) при нейтральных значениях рН шестая координационная связь занята молекулой H2O, при этом железо находится ближе к плоскости гема, 5 электронов неспарены и занимают все 3d-орбитали (S=5/2) [47; 60]. Оксигенирование переводит гексакоординированный Fe2+ в низкоспиновое состояние (R-форма). При этом изменяется дисперсия электронов по внешним орбиталям железа. Наиболее распространены три модели перераспределения электронов в комплексе Гб с кислородом. Pauling L. предположил модель заполненной электронной оболочки комплекса Fe(II)-О2, при этом каждая группировка находится в синглетном состоянии [68]. Weiss J.J. утверждает, что образуется комплекс Fe(III)-O2-, т.н. «дублет-дублет», при котором электрон переходит от атома железа к О2 при связывании [69; 70]. По теории McClure D.S., в комплексе Fe(II)-О2 кислород находится в триплетном состоянии, а дезоксиГб переходит из высокоспинового состояния в промежуточное триплетное состояние. Позже Goddard W.A. and Olafson B.D. выдвинули «модель озона», включающую трехцентровую четырехэлектронную связь, где низкоспиновой Fe4+ связывается с пероксидом O22- [71]. В настоящее время считается, что электронное строение оксиГб характеризуется многоконфигурационным составом различных состояний валентных связей. Однако, в нем преобладают занятые спаренными электронами орбитали, т.к. электронной конфигурации 3d6 в октаэдрическом окружении энергетически выгодно образование низкоспиновых комплексов [72]. При данном типе дисперсии электронов, внешние d-орбитали имеют различную энергию: 2 орбитали (eg) характеризуются большей энергией, чем 3 оставшиеся (t2g). Когда взаимодействие с лигандами сильное, электроны железа спариваются с внешними неспаренными электронами, заполняя преимущественно 3d орбитали с низкой энергией (рис. 1.1.1.1) [67; 73].
В дезоксиГб атом Fe2+ выходит из плоскости порфиринового кольца на 0.8 из-за стерического отталкивания гистидина и атомов азота порфиринового цикла. С-концы глобина дважды соединены солевыми связями, тирозины зафиксированы в полостях между спиралями ван-дер-ваальсовыми и водородными связями. Структура дезоксиГб стабилизирована 2.3-БФГ с отрицательным зарядом, образующим дополнительные перекрестные солевые мостики между положительно заряженными остатками лизина и гистидина -цепей [27; 64]. Сдвиг электронной плотности в геме при присоединении лиганда вызывает конформационную перестройку глобулы. Общая схема оксигенации Гб эритроцитов: (2 в) (г2 в) ( 0) Гем усиливает изменение атомного радиуса при переходе железа в низкоспиновое состояние, что приводит к смещению проксимального остатка гистидина. По данным Perutz M.F (1987), триггером данного смещения служит перемещение Fe2+ в плоскость порфиринового кольца. При этом наблюдается изменение структуры молекулы Гб: разрыв солевых мостиков, С-концы цепей и тирозины обретают свободу вращения. Оксигенированная форма Гб более компактна, расстояние в -цепях между атомами железа уменьшается на 2, а в -цепях - на 1,3. Одна пара -субъединиц поворачивается на 15 относительно другой пары, отдельные атомы перемещаются на расстояние 6. 2.3-БФГ удаляется из молекулы Гб, т.к. ее центральная полость становится слишком мала, также возрастает расстояние между -аминогруппами. При этом аминокислотные остатки, связывающие перемещаются из относительно гидрофильного в более гидрофобное окружение, что облегчает отщепление ионов водорода [25; 61; 74].
Гб обладает кооперативным «гем-гем» свойствами. Связывание первой молекулы О2 энергетически менее выгодно, чем связывание последней О2, следовательно, возрастает вероятность перехода дезоксиГб в окси-форму. Связываясь с глобиновой частью молекулы, протоны водорода и молекулы СОг могут оказывать аллостерическое действие на сродство Гб к О2 [22; 27; 49].
Таким образом, при образовании комплексов гемоглобина с лигандами наблюдается перераспределение электронов по орбиталям атома железа, что приводит к изменениям в структуре Гб. Данные изменения отражаются на свойствах Гб, в частности, на способности молекул образовывать комплексы и транспортировать О2 и NO по кровотоку.
Резонансная спектроскопия комбинационного рассеяния каротиноидов плазмы крови
Исследование содержания внутриклеточного Са2+ проводили на нагруженных флуоресцентным зондом Fura2-AM изолированных эритроцитах, которые инкубировали с АТФ/ИФР-1 в течение получаса. Спектры флуоресценции и мгновенные спектры с пикосекундным разрешением регистрировали с интервалом 5 минут с помощью спектрофлуориметра Hitachi 850 (Япония), а также измерительного комплекса на основе системы однофотонного счета Simple Tau 140 (время импульса – 25 пс, частота импульсов – 50 МГц, энергия импульса – 13 пДж, накопление сигнала – 10 с), (Becker & Hickl, Германия) [228; 229].
Зонд Fura2-AM характеризуется высоким значением квантового выхода, а спектральные характеристики Fura2-AM и свободного Fura2 аналогичны [53; 230]. При возбуждении флуоресценции на ex 335 нм регистрируется сигнал от внутриклеточного комплекса «Fura2+Ca2+», при ex 362 нм в эритроците флуоресцирует свободный зонд Fura2. Регистрация флуоресценции осуществляется на em 480 нм [231; 232]. Для возбуждения флуоресценции триптофана эритроцитов использовали излучение с ex 280 нм (em = 360 нм). При поглощении фотона молекула зонда переходит в возбужденное состояние, за счет перемещения электрона на орбиталь с большей энергией. Вероятность возврата молекулы в основное энергетическое состояние, сопровождающееся излучением, характеризуется квантовым выходом флуоресценции [233; 234]: где kf – вероятность потери энергии в виде кванта флуоресценции, kd – затраты энергии на движение ядер и молекул, kq – на взаимодействие с ингибитором флуоресценции, kst – на переход молекулы в триплетное состояние, kr – на осуществление фотохимических реакций Количественный анализ флуоресценции комплекса «Fura2-Са2+» проводили по закону Бугера-Ламберта-Бера при оптической плотности пробы 0.01 [234– 237]: где Io - интенсивность возбуждающего света, cpf - квантовый выход флуоресценции, - молярный коэффициент поглощения, с - молярная концентрация вещества, / - длина оптического пути При этом интенсивность флуоресценции (число испускаемых фотонов) при импульсном возбуждении ведет себя экспоненциально: If (t)=Ae =Ae {Ъ) где А - амплитуда, t - время, к - полная скорость дезактивации возбужденного состояния, т - время жизни флуоресценции Усредненное время существования комплекса «Fura2-Са2+» в возбужденном состоянии (время жизни флуоресценции) вычисляли по формуле: где Аi – амплитуда, i – время жизни для каждого отдельного i-компонента В исследовании также оценивали соотношение интенсивностей спектров флуоресценции при ex 335 нм (комплекс «Fura2-Са2+») и 362 нм (свободный Fura2). По данным Hirst R., данное соотношение I335/I362 пропорционально изменению концентрации внутриклеточного свободного кальция в эритроцитах [232; 238; 239]. 2.2.7 Метод определения морфологии эритроцитов Изменение соотношения различных морфологических форм эритроцитов наблюдается при развитии патологий в организме и может сопровождаться изменением геометрии клеток, дисперсией размеров, изменением распределения Гб, перестройкой мембраны и цитоскелета эритроцита [41; 44; 240].
Исследование морфологической формы эритроцитов осуществляли визуально на микроскопе «Carl Zeiss Axioplan 2» (Carl Zeiss Group, Германия) с объективом х60 (NA=0.6). Изображения (160x140 мкм) регистрировали встроенной видеокамерой. Для каждой пробы исследовали форму не менее 400 клеток [241; 242]. Предварительно клетки инкубировали с исследуемым веществом (АТФ, ИФР-1, А23187) на протяжении 5, 10 и 30 минут, затем фиксировали глутаровым альдегидом и наносили на предметное стекло. Эритроциты в полученных «мазках» классифицировали по номенклатуре Bessis М. (1973) на нормальные двояковогнутые дискоциты ( 85%), чашеобразные стоматоциты 1 порядка ( 3%) и эхиноциты 1 порядка с одиночными выростами ( 6%), набухшие с одной стороны стоматоциты 2 порядка, стоматоциты в виде «открытого рта» 3 порядка, эхиноциты 2 и 3 порядка по количеству выростов. Предгемолитическими формами считали округлые сфероциты, эхиноциты и стоматоциты 3 порядка [43; 169; 243-246].
Концентрацию Гб определяли по методу Ахрема и др. (1989). Предварительно 20 мкл крови, стабилизированной гепарином (10 Ед/мл), смешивали с 980 мкл дистиллированной воды и тщательно перемешивали. Для определения концентрации Гб 40 мкл полученного гемолизата вносили в пробирку с 1.96 мл 0.06% водного раствора CH3(CH2)nOS03Na. В контрольную пробирку вносили 40 мкл дистиллированной воды. Пробы тщательно перемешивали, оптическую плотность регистрировали на спектрофотометре Hitachi-556 (Tokio, Japan) на = 540 нм. В кювету сравнения добавляли 2 мл 0.06% раствора CH3(CH2)11OSO3Na. Концентрацию Гб рассчитывали по формуле где n – коэффициент разведения гемолизата (50), MГб – 16114, – молярная экстинкция Гб (10140 М-1см-1), l – длина оптического пути (1 см).
Содержание небелковых тиолов (НТ) определяли по методу Sedlack and Lindsay (1968) с модификациями Ахалай, Платонова и Байжуманова (2006). Метод основан на реакции дитионитробензойной кислоты (ДТНБ) с восстановленными тиолами с получением дисульфида и окрашенного 5-тио-2-нитробензоата (ТНБ). Показатель пропорционален уровню восстановленного глутатиона, утилизирующего H2O2.
В опытную пробирку последовательно вносили 50 мкл крови, 500 мкл 0.02 М ЭДТА-Na2, 500 мкл 10% ТХУ. Пробу инкубировали в течение 10 минут и центрифугировали (8000g, 15 мин). Затем отбирали 800 мкл супернатанта, смешивали с 2 мл 0.4 М трис-HCl (pH 8.9) и 50 мкл 0.01 М ДТНБ, инкубировали 5 минут и определяли D при = 412 нм на спектрофотометре Hitachi-556 (Tokio, Japan) относительно контроля с 50 мкл дистиллированной воды [248; 249]. Содержание НТ выражали в нмоль/мг Гб крови.
Содержание активных продуктов, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-АП) в плазме крови определяли по методу Браже и др. (2011). Метод основан на экстракции бутанолом продуктов ПОЛ (МДА), образующих с ТБК окрашенный комплекс [28].
В опытную пробирку, содержащую 3 мл 2% фосфорной кислоты, вносят 0.2 мл плазмы, в контрольную – к 3 мл 2% фосфорной кислоты добавляют дистиллированную воду, затем в обе приливают по 1 мл 0.8% раствора ТБК и помещают на водяную баню (45 мин, t=96С). Затем пробы охлаждают и добавляют 5 мл н-бутанола. Пробирки стряхивают, центрифугируют (3000g, 10 мин), отбирают супернатант и измеряют оптическую плотность опытной пробы против контрольной на =535 и 580 нм в кювете толщиной 1 см на спектрофотометре Hitachi-556 (Tokio, Japan) [250]. Содержания ТБК-АП расчитывают по формуле: С = (D535-D580) 106 + 0.81 где D535 – оптическая плотность опытной пробы при длине волны 535 нм, D580 – оптическая плотность опытной пробы при длине волны 580 нм.
Исследование действия АТФ на конформацию гемопорфирина гемоглобина изолированного эритроцита
Таким образом, мы зафиксировали увеличение входа и содержания Ca2+ в эритроцитах, сопровождающееся усилением флуоресценции триптофана белков изолированных эритроцитов в присутствии АТФ. Известно, что при активации P2X7-рецепторов эритроцита образуются поры, по которым ионы кальция проникают в клетку, и, вероятно, модифицирует структуру цитоскелета и конформацию Гб [14; 41; 54; 96; 101]. Так, нами установлено, при инкубации эритроцитов с АТФ Гб переход в R-форму, что сопровождается перемещением субъединиц 12 и 21 относительно друг друга, сближением гемов -цепей и расхождением -цепей. Мы предполагаем, что изменения флуоресценции триптофана связаны с тем, что аминокислота триптофан -цепи в положении 37 и тирозин (42) перемещаются в более гидрофобное окружение [61; 62; 261]. Кроме того, во флуоресценцию триптофана могут вносить вклад конформационные изменения белков мембраны и цитоскелета эритроцита. Вероятно, увеличение концентрации внутриэритроцитарного Са2+ и связывание его ионов данными структурами, уменьшается заряд мембраны, что приводит к увеличению количества свободных ОН-групп тирозина БП3, оказывающих опосредованное влияние на суммарную флуоресценцию триптофана [229; 262].
Исходя из того, что в крови АТФ подвергается как ферментативному расщеплению, так и связыванию белками плазмы и рецепторами других клеток, в данной серии экспериментов к крови добавляли более высокие концентрации АТФ (10.0, 5.0 и 1.0 мМ).
Было установлено, что в течение получасовой инкубации крови с 10.0, 5.0 и 1.0 мМ АТФ доля комплексов гемоглобина с кислородом по сравнению с контролем не меняется. Однако, наблюдается дозозависисмая тендения ускорения образования комплексов Гб с О2, при этом абсолютное количество молекул гемоглобина с кислородом уменьшается (рис. 3.2.1.1).
Динамика изменения параметров КР-спектра гемопорфирина (число комплексов гемоглобина с кислородом) эритроцитов при инкубации крови с АТФ (M±se, - результаты достоверно отличаются от контроля по t-критерию, р 0.05)
Исследуя динамику образования гемоглобином комплексов с оксидом азота (I), было выявлено увеличение показателя к 15 минуте инкубации на 40% в присутствии 5.0 мМ АТФ. Следует отметить, что на протяжении получасовой инкубации наблюдается обратная зависимость между концентрацией добавляемого АТФ и числом комплексов ГбNO (рис. 3.2.1.2).
Способность гемоглобина связывать лиганды не изменяется на протяжении 30-минутной инкубации крови с исследуемыми концентрациями АТФ (рис. 3.2.1.3). Важно, что в присутствии 1.0 мМ АТФ на протяжении всего времени инкубации крови Гб эритроцитов характеризуется низкой способностью образовывать комплексы с лигандами, в частности, с кислородом (на 15 минуте снижается на 25%).
Динамика изменения параметров КР-спектра гемопорфирина (способность гемоглобина связывать лиганды) эритроцитов при инкубации крови с АТФ (M±se, - результаты достоверно отличаются от контроля по t-критерию, р 0.05)
При исследовании способности Гб эритроцитов сбрасывать лиганды (О2, NO) при инкубации крови с 5.0 мМ АТФ выявлено увеличение показателя на 5 минуте на 32% относительно контрольных значений. В присутствии 10.0 мМ АТФ способность сбрасывать лиганды эритроцитов в крови не меняется, а при добавении 1.0 мМ АТФ данный параметр обратимо уменьшается за 15 минут на 26% (рис. 3.2.1.4).
Время инкубации, мин Рис. 3.2.1.4 Динамика изменения параметров КР-спектра гемопорфирина (способность гемоглобина сбрасывать лиганды) эритроцитов при инкубации крови с АТФ (M±se, - результаты достоверно отличаются от контроля по t-критерию, p 0.05)
Таким образом, в ходе исследования нами было зафиксировано изменение конформации гемопорфирина Гб эритроцитов при инкубации крови с 5.0 мМ АТФ. При неизменном количестве комплексов Гб с кислородом, возросло число комплексов ГбNO (I), а также усилилась способность Гб сбрасывать лиганды, что свидетельствует об изменении конформации гемопорфирина гемоглобина. Кроме того, установлено, что динамика зафиксированных изменений Гб в суспензии изолированных эритроцитов и крови различна. Так, в цельной крови при действии 5 мМ АТФ на 5 минуте обратимо увеличивается способность гемоглобина сбрасывать лиганды, за счет уменьшения деформации метиновых мостиков между пирролами гемопорфирина, затем возрастает доля комплексов ГбNO I типа, при этом пирролы располагаются более симметрично. По данным литературы, в крови АТФ расщепляется ферментами плазмы и клеток, активно связывается белками и рецепторами тромбоцитов, макрофагов, моноцитов, инициируя выброс ряда медиаторов (NO) [6; 30; 116]. Вероятно, выявленные отличия в действии АТФ на эритроциты в суспензии и комплексной среде (крови) обусловлены высокой буферной емкостью плазмы, выбросом медиаторов при активации пуринергических рецепторов на прочих клетках крови, а также активацией P2Y13-рецепторов, локализованных на поверхности эритроцита, образующимся в процессе гидролиза АДФ [115; 121].
Выявив изменения конформации гемопорфирина Гб, мы исследовали морфологический состав эритроцитов после 5 и 30 минут инкубации крови с 5.0 мМ АТФ [241; 243]. Контролем были эритроциты в крови в присутствии аликвоты буфера А. В ходе эксперимента установлено, что при 5- и 30-минутной инкубации с АТФ количество дискоцитов уменьшается относительно контроля на 19% и 17%, соответственно. При этом на 5 минуте инкубации с АТФ на 42% увеличивается число эхиноцитов 1 порядка, на 30 минуте инкубации крови с 5.0 мМ АТФ количество эхиноцитов 1 порядка возрастает в 2.4 раза относительно контроля (рис. 3.2.2.1). 85 контроль 90 85 80 75 70 65 Рис. 3.2.2.1 Изменение соотношения различных форм эритроцитов на 5 и 30 минутах инкубации крови с АТФ (M±se, - результаты достоверно отличаются от контроля по t-критерию, p 0.05)
Таким образом, при инкубации крови с 5.0 мМ АТФ на протяжении 30 минут наблюдается изменение морфологического состава эритроцитов относительно контроля. Так, зарегистрировано уменьшение количества дискоцитов в пробах, увеличение доли эхиноцитов 1 порядка и предгемолитических форм эритроцитов. При активации пуринергических Р2Х7-рецепторов, локализованных на поверхности эритроцита, образуются ионные поры, пропускающие внутрь клетки Са2+, который инициирует эхиноцитарную трансформацию клеток [41; 54; 231]. Однако, регистрируемый эффект в крови менее выражен, чем в суспензии изолированных эритроцитов. Вероятно, цельная кровь обладает определенной буферной емкостью к АТФ, за счет белков плазмы (альбумин). Кроме того различные клетки крови имеют на своей поверхности пуринергические рецепторы, выбрасывая в межклеточное пространство при активации различные активные соединения (NO, АФК), модифицирующие вязкость мембраны и распределение гемоглобина в цитоплазме. Данные параметры оказывают непосредственное влияние на изменение морфологичсекой формы эритроцитов [38; 67].
Исследование действия ИФР-1 на конформацию гемопорфирина гемоглобина эритроцита в крови
Таким образом, стимулирование входа Са2+ в эритроцит при инкубации клеток с высокими концентрациями А23187 оказывает значительное влияние на геометрические размеры и плотность упаковки Гб в цитоплазме. Так, к 30 минуте значительно уменьшается площадь изолированных эритроцитов, при этом возрастает ОРХ и плотность молекул Гб в цитоплазме. Возможно, усиление входа Са2+ в эритроцит при активации рецепторов или увеличении их числа оказывает комплексное действие на клетку: уменьшается гидратная оболочка молекул Гб, за счет конкурентного связывания на одном с водой сайте Гб, инициируется десорбция мембраносвязанной фракции при гиперполяризации мембраны, изменяется заряд белковых цепей Гб. Данному изменению предшествует незначительное уменьшение ОРХ и перераспределение молекул Гб. В присутствии 5 мкМ ионофора увеличивается ОРХ эритроцитов, однако, площадь клеток и плотность молекул Гб не изменяются. Вероятно, из-за высокой буферной емкости белков цитоплазмы эритроцита (кальмодулин, кальпаин), активации Са2+-АТФаз и прочих компенсаторных механизмов поддержания ионного баланса, значительное изменение молекулярно-клеточных параметров эритроцита зафиксировано именно на длительных временах инкубации и при высоких концентрациях ионофора.
Очевидно, что амплитуда рельефа поверхности эритроцита зависит от состояния структур цитоскелета различного размера, плотности распределения мембранных белков, а также количества мембраносвязанного Гб. В ходе данного эксперимента мы исследовали изменение РП изолированных эритроцитов при 5-минутной инкубации клеток с 5 мкМ кальциевого ионофора А23187 в кальциевом и безкальциевом буферах. Было установлено, что после 5 минут инкубации контрольных проб, содержащих ДМСО, независимо от наличия кальция в буфере, амплитуда РП эритроцитов не меняется. При этом, в присутствии кальциевого ионофора, амплитуда РП изолированных эритроцитов увеличивает как в буфере А, так и в безкальциевом буфере (рис. 3.3.4.1).
Динамика изменения рельефа поверхности эритроцитов, обусловленного структурами различного размера (SI 150нм S2), при действии А23187 (M±se, - результаты достоверно отличаются от контроля по t-критерию, р 0.05)
Так, для изолированных эритроцитов в буфере А выявлено увеличение интегрального параметра шероховатости мембраны (S), характеризующего амплитуду РП, на 40% относительно контроля с ДМСО. Амплитуда РП, обусловленная структурами цитоскелета и мембранными белками размером менее 150 нм (фибриллы спектрина, примембранный Гб, БП3), возросла на 32%, вклад белковых структур, превышающих 150 нм, составил 41%. При 5-минутной инкубации изолированных эритроцитов в безкальциевом буфере с 5 мкМ А23187 выявлено увеличение амплитуды РП на 24%, при этом вклад структур цитоскелета и мембранных белков крупнее 150 нм (узловые комплексы, актиновые агрегаты) составил 21%. Вероятно, на структуру цитоскелета влияет как увеличение содержания внутриклеточного кальция, так и встраивание ионофора в мембрану эритроцита, при этом гидрофобные углеводородные группы ориентированы на наружную поверхность клетки, что сопровождается модификацией белок-липидных взаимодействий в мембране. Полученные результаты позволяют предположить, что вход кальция значительно меняет свойства малоразмерных структур цитоскелета и мембранных белков, за счет перераспределения Гб и лабильности интегральных белков мембраны. Кроме того, активация кальций-зависимых протеинкиназ, фосфолипаз и ионных насосов может стимулировать агрегацию молекул спектрина, БП3, 4.2, 2.1 и 2.3. Подобные изменения оказывают влияние как на скорость прохождения молекул газов в клетку, так и на сродство Гб к кислороду и оксиду азота.
Исследование действия ИФР-1 на конформацию гемопорфирина гемоглобина изолированного эритроцита
Исследование конформации гемопорфирина Гб изолированного эритроцита, которая характеризует кислородтранспортную функцию клеток, при действии 40, 13, 7 и 2 нМ ИФР-1 мы проводили методом КР-спектроскопии [127]. Контролем служила суспензия изолированных эритроцитов с аналогичным ИФР-1 объемом буфера А (рН 7.4).
В течение 30-минутной инкубации эритроцитов с ИФР-1 не выявлено изменения величин интенсивностей КР-полос, характеризующих долю комплексов Гб с О2, относительно контроля. Однако, наблюдается тенденция дозозависимого уменьшения числа комплексов оксиГб в изолированных эритроцитах. Так, в присутствии 40 нМ ИФР-1 количество оксигенированного Гб