Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор
1.1 Факторы, определяющие скорость и поглощение ультразвука в водных растворах биологических соединений 8
1.2 Биохимический состав и структура основных компонентов молока
1.3 Ультразвуковые измерения в молоке 26
Глава 2. Материалы и методы 33
2.1 Резонаторний метод измерения ско рости и поглощения ультразвука
Глава 3. Концентрационные вклады, вносимые основными компонентами молока в скорость и поглощение ультразвука 50
Глава 4. Температурные зависимости скорости и поглощения ультразвука в молоке и растворах основных молекулярных компо нентов молока 63
Глава 5. Структурные вклады, вносимые в ско рость и поглощение ультразвука надмо лекулярными агрегатами в молоке 75
5.1. Акустические вклады, вносимые агрегированием жировых глобул в цельном молоке 76
5.2. Структурные вклады, вносимые в акустические характеристики комплексооб-разованием казеина 78
Глава 6. Построение математической модели и анализ возможности определения концентраций компонентов в молоке по данным акустических измерений 83
Глава 7. Возможность цроведения экспресс-анализа состава молока акустическим методом с применением современных технических устройств 93
Выводы 102
Литература 107
- Биохимический состав и структура основных компонентов молока
- Резонаторний метод измерения ско рости и поглощения ультразвука
- Концентрационные вклады, вносимые основными компонентами молока в скорость и поглощение ультразвука
- Температурные зависимости скорости и поглощения ультразвука в молоке и растворах основных молекулярных компо нентов молока
Введение к работе
Постановка задачи и ее актуальность. Скорость распространения и поглощение ультразвука являются важными характеристиками, отражающими состав и структуру биологических объектов, среди которых значительное место занимают такие биологические растворы, как кровь, лимфа, желудочный сок, молоко и др.
Существенный интерес представляет изучение ультразвуковых характеристик молока - многокомпонентной биологической жидкости, ценность которой, как продукта питания, неоспорима.
Первые попытки применить акустический метод для исследования свойств молока были сделаны два десятка лет назад почти одновременно за рубежом (1-3) и в нашей стране (4). В ходе исследований удалось выявить некоторые закономерности распространения ультразвука в цельном и обезжиренном молоке и найти эмпирические соотношения, связывающие скорость ультразвука в молоке с содержанием в нем молочного жира и сухого обезжиренного остатка (СОЮ).
Полученные данные были использованы авторами цитированных работ для решение актуальной прикладной задачи, связанной с определением концентраций молочного жира и СОМО в молоке акустическим методом (7,8).
Известны также отдельные попытки, предпринимавшиеся в разное время различными исследователями (9,10), с целью использовать другой акустический параметр - поглощение ультразвука, для изучения структурных особенностей отдельных компонентов молока.
В целом, работ по исследованию акустических свойств молока - немного и, по ряду причин, среди которых - узкая технологическая направленность и, вследствие этого, ограниченность ре-шаемых задач; несовершенство акустической аппаратуры; отсутствие систематических исследований в области акустики молока, вопрос о физико-химических факторах, определяющих акустические свойства данного объекта, остался далек от окончательного решения.
В то же время, в последнее десятилетие приложение молекулярной акустики к биофизическим исследованиям получило мощный импульс благодаря появлению прецизионных методов измерения акустических характеристик жидкостей (11,12,77-79) и успешным применением этих методов для выявления связи акустических параметров биологических сред с их объемно-упругими свойствами.
Измерения скорости ультразвука оказались эффективным инструментом в исследовании надмолекулярных биоструктур (73), кон-формапионных перестроек биополимеров (21,22), межмолекулярных взаимодействий (27,32). Новейшие данные свидетельствуют о том, что ультразвуковые измерения нашли применение при изучении нуклеиновых кислот и их производных (28,45), позволили исследовать процессы стопочной ассоциации в растворах нуклеиновых оснований (114), проследить за ходом реакции антиген-антитело (99). Изменения акустических характеристик мышечной и кожной ткани, крови, желудочного сока, сопровождающие переходы типа норма-патология, позволяют разрабатывать новые экспресс-методы медицинской диагностики (99,100). Существенное развитие получают методы ультразвуковой визуализации внутренних органов животных и человека (акустическая топография).
Значительную роль в развитии биоакустических методов сыграло создание в последнее десятилетие комплекса приборов для прецизионных измерений скорости и поглощения ультразвука в малых объемах жидкостей и ткани (88-95).
Успехи, достигнутые в решении ряда ключевых вопросов биофизической акустики, послужили необходимой основой для начала систематических исследований акустических свойств сложных многокомпонентных растворов, как молоко.
Актуальность исследований, проведенных при выполнении диссертационной работы, связана с необходимостью решения важной народнохозяйственной задачи по разработке эффективных экспресс-методов для анализа состава молока.
Известные попытки создания акустических приборов, предназначенных для определения концентраций компонентов в молоке, предпринимавшиеся в нашей стране (14) и за рубежом (15), показали перспективность метода в решении этой задачи. Однако, имеющиеся на сегодняшний день практические разработки не нашли широкого применения в молочной промышленности по ряду причин, с которых упоминалось выше.
В связи с этим, представлялось необходимым продолжить поиск путей, ведущих к преодолению отмеченных недостатков и с большей эффективностью использовать акустический метод в практике.
Цель работы состоит в исследовании взаимосвязи акустических характеристик молока и его составом и структурой и определении путей использования полученных данных в практических целях.
Научная новизна. Впервые выявлены и количественно проанализированы концентрационные вклады, вносимые в скорость и поглощение ультразвука основными молекулярными компонентами молока.
Произведена количественная оценка вкладов, вносимых в акустические параметры образованием надмолекулярных структур в молоке - агрегатов жировых глобул и мицелл казеината кальция.
Предложена математическая модель, в рамках которой удалось связать скорость и поглощение ультразвука в молоке с содер жанием в нем жира, белков, а также солей и лактозы.
Впервые разработаны основы избирательного экспресс-анализа состава молока акустическим методом.
Практическая ценность работы. Разработанный способ быстрого и нетрудоемкого определения концентраций жира, белков, лактозы и минеральных солей в молоке может найти широкое применение в молочной промышленности для проведения экспресс-анализа состава сборного и индивидуального молока сельскохозяйственных животных, поступащего на приемные пункты; контролирования процесса нормализации по жиру молока в потоке; определения сыро-пригодности молока (по концентрации белков).
Биохимический состав и структура основных компонентов молока
Биохимический состав коровьего молока изучен достаточно хорошо при помощи традиционных физико-химических методов (48-50). Имеющиеся в литературе сведения по этому вопросу (51,52) позволяют с хорошим приближением суммировать данные о содержании основных составных компонентов35 молока, получаемого от нормальных, здоровых особей (Таблица I). Исходя из содержания составных частей в молоке, их делят на основные и второстепенные. К основным молекулярным компонентам молока относятся: липиды (молочный жир), белки, лактоза (молочный сахар) и минеральные соли. С технологической точки зрения, общепринято деление молока на воду, сухое вещество (GB) и сухой обезжиренный молочный остаток (СОМО). Под термином СВ в технологии молочного дела подразумевают совокупность всех растворенных в воде компонентов молока, а под СОМО - совокупность нежировых компонентов молока.
Содержание сухого вещества в образцах нормального молока непостоянно и подвержено колебаниям в силу объективных факторов: породы скота, сезонности, кормления и др. Максимальный разброс концентраций растворенных компонентов СВ, обусловленный этими факторами, можно проследить из данных, сведенных в таблицу I. Основные молекулярные компоненты молока различаются не только содержанием, но и своим строением, агрегатным состоянием, а также величиной диспергированных частиц. Проводимые на протяжение ряда лет, при помощи традиционных химических и физических (оптические, калориметрические и др.) методов, исследования отдельных компонентов молока (48 - 50,53), позволяют с достаточной ж Примечание: Здесь и далее рассматриваются растворенные в воде, основные молекулярные компоненты молока. (для круга задач, решаемых в настоящей работе) полнотой описать структуру и состояние в растворе каздого из основных компонентов молока.
Молочный жир - присутствует в молоке в виде глобул средним диаметром 3-6 мкм (51,52), образующих с водой эмульсию типа "масло в воде".
Основной компонент молочного жира - триглицериды, составляющие примерно 99$ внутрисодержимого глобул (ядро), диглщери-ды - 0,2 0,5$ и моноглицериды - 0,02$. По модели, предложенной Ф.Кингом и др. (53) к ядру глобулы с внутренней стороны примыкает мономолекулярный слой фосфолипидов (лецитин) толщиной 25 А. Лецитиновый слой окружен эвглобулином - оболочечным белком, непосредственно контактирующим с гидратной оболочкой глобулы. Вследствие полярного строения, фосфолипиды являются хорошими эмульгаторами, что приводит к образованию пленки на границе раздела фаз: вода - масло (51).
Липофильная часть фосфолипидов обращена к жировому ядру, а гидрофильная - к воде. Таким образом, оболочка жировых глобул состоит из нескольких слоев - мономолекулярных фосфолипидов, обо-лочечного белка и гидратной воды. Эвглобулины жировой оболочки обладают хорошо выраженной адгезионной способностью (51,54), способствующей слипанию глобул в комочки без нарушения их дисперсного состояния с последующим всплытием образовавшихся конгломератов на поверхность (процесс отстоя сливок в цельном молоке).
При температуре тела животных (38С) триглицериды жировых глобул находятся в жидком состоянии. После отбора пробы молока, с понижением температуры начинается кристаллизация триглицери-дов (55,56), с одновременным расслоением их, ввиду наличия в
Белки молока подразделяются на несколько фракций, различных по аминокислотному составу и свойствам (58-61). Среди них основным является казеин, присутствующий в молоке в виде казеин-кальций фосфатного комплекса (ККФК). ККФК легко может быть выделен из молока ферментативным сбраживанием (62). Остающиеся в растворе белки (сывороточные) подразделяются на растворимую в ОД растворе сульфата аммония, фракцию лактальбуминов и нерастворимую - лактоглобулинов.
Систематическое изучение свойств и структуры белков молока, проводимое в течение ряда лет традиционными физико-химическими методами (61-64), позволило накопить достаточно сведений о состоянии этих белков в растворе.
Казеин-кальций фосфатный комплекс в молоке образован субъединицами казеина (суммарная мол.масса около 30000), которые находятся в следующем стехиометрическом соотношении - $МіІЇ& гл-е jfiy&M - отдельные субъединицы (фракции) казеина (65). Фракции сильно различаются растворимостью и чувствительностью к ионам кальция, посредством которых карбоксильные группы и остатки фосфорной кислоты отдельных полипептидных цепей объединены в субмицеллы (66). Несколько сотен таких образований объединяются в крупные, шарообразной формы, структуры -мицеллы МФК (66). Средний диаметр мицелл около Ю 5 см, а мол. масса - (0,3 0,5)х10-15г (51).
Гидрофильные группы Л - казеина образуют, в основном, гидратную оболочку мицеллы ККФК, удерживая ее в растворе. Устойчивость коллоидной формы белка обеспечивается наличием двойного электрического слоя, за счет противостояния отрицательно заряженных групп карбоксила Я - казеина, положительно заряженному слою ионов кальция (51). Заряд на поверхности мицелл способст- ! вует сильной гидратации и растворению основного белка молока -казеина - с образованием коллоидной структуры.
Резонаторний метод измерения ско рости и поглощения ультразвука
Резонаторний метод или метод интерферометра постоянной длины основан на использовании стоячих ультразвуковых волн в объеме резонатора, заполненном исследуемой средой.
Шдификация резонаторного метода, проведенная в конце 60-х гг. Эггерсом и Функом (85), позволила существенно расширить возможности резонаторного метода. Сконструированный ими прибор позволял определять скорость и затухание ультразвука в малых (I см ) объемах жидкостей, что достигалось путем анализа отдельных участков амплитудно-частотной характеристики (АЧХ) акустического резонатора и измерять частоты, соответствующие определенным точкам на АЧХ (рис. 4). Следя за шириной выбранных резонансных пиков на уровне половинной мощности (ШМ) можно определить поглощение ультразвука в среде, заполняющей резонатор, а по частотам, соответствующим максимумам на АЧХ - скорость ультразвука.
Блок-схема электронной части установки, разработанной ав - 36 торами приведена на рис. 5. Исследуемый образец В помещается между двумя плоско-параллельными пластинами передающего и приемного преобразователей, расстояние между которыми жестко зафиксировано (акустическая база резонатора). Пьезопреобразователи изготовлены из кварца. Передающий преобразователь, возбуждаемый настраиваемым генератором синусоидальных колебаний I, создает в образце S ультразвуковое поле стоячей волны на характеристических частотах fi . Контроль частоты осуществляется частотомером 4. Волна, воздействуя на поверхность приемного преобразователя, вынуждает его вырабатывать на частотах fi четкие пики напряжения (см.рис. 4) амплитудой J tnax, - Пики усиливаются усилителем 2 и, после детектирования 3 наблюдаются на экране осциллографа 5 (или измеряются вольтметром 6).
Так как, акустическая база резонатора - . - фиксирована, для ее определения достаточно один раз прокалибровать используемый резонатор в жидкости с известными параметрами LL} ct (например водных растворах электролитов) и использовать в дальнейшем, для вычислений абсолютных значений X,yLC .
При конструировании резонаторов определяющим является вопрос обеспечения высокой точности измерений скорости и поглощения ультразвука. Наличие подвижных элементов в акустическом резонаторе, разработанном Эггерсом и Функом (85), и резонаторах, сконструированных ранее (86,87), резко увеличивает погрешность измерения скорости, вследствие нестабильности величины и неэффективной системы термостатирования резонатора.
Существенный прогресс был достигнут в результате работ, проведенных в середине 70-х годов советскими исследователями, разработавшими прецизионные методы измерения скорости и поглощения ультразвука (88-95). Создать устройства, предназначенные для проведения точных относительных измерений акустических ха-рактеристик жидких сред объемом ОД - 0,8 см , которые были свободны от недостатков, присущих описанной аппаратуре, удалось группе авторов под руководством А.И.Сарвазяна в Институте биологической физики АН СССР.
В начале измерений генератор настраивается на заданный резонансный пик резонаторной ячейки по максимуму сигнала на выходе амплитудного детектора. Затем, при помощи фазовращателя, проводится сначала грубая настройка системы в резонанс, после этого на фазовращатель поступает сигнал девиации фазы и система настраивается точно. Точной настройке соответствует наименьшая девиация частоты, так как в области вершины резонансного пика крутизна ШХ максимальна (рис. 4).
Благодаря обратной связи средняя частота сигнала генератора, регистрируемая частотомером, удерживается на максимуме резонансного пика, и по ней определяется скорость ультразвука в среде, заполняющей резонатор. Девиация частоты при заданном изменении фазы характеризует добротность резонатора и, соответственно, поглощение ультразвука в исследуемой среде.
Ряд разработанных Сарвазяном с соавт. приборов (88,91) построен по принципу автогенератора, в котором акустическая ячейка - резонатор служит элементом обратной связи, соединенным с выходом и входом полосового усилителя. В полосе пропускания усилителя должно находится не более двух резонансных пиков ячейки. Тогда, при достаточном коэффициенте усиления усилителя и при возникновении положительной обратной связи, для некоторой частоты, лежащей вблизи собственных частот генератора, в системе возникает генерация. При первоначальной настройке прибора с помощью фазовращателя, включенного в замкнутую цепь, частота генерации устанавливается в точке, соответствующей максимальной крутизне фазочастотной характеристики. При изменении скорости ультразвука в резонаторе частота генерации изменяется на пропорциональную величину.
Введение в цепь обратной связи дополнительной фазосдви-гающей цепочки изменяет частоту генерации на величину, пропорциональную крутизне 5ЯХ и, соответственно, обратно пропорциональную величине поглощения ультразвука в резонаторе. Описанная система позволяет измерять малые относительные изменения скорости и поглощения ультразвука в резонаторе.
Ключевым элементом в разработанных приборах является конструкция акустического резонатора. При выполнении настоящей работы необходимо было использовать акустический резонатор, который обеспечивал бы проведение прецизионных измерений скорости и поглощения ультразвука в малых объемах исследуемых растворов. Нами был выбран резонатор внутренним (рабочим) объемом 0,8см с максимальной добротностью порядка (6 4- 7)xI0 , подробное описание конструкции которого, приводится в (95). Внешний вид и разрез акустической ячейки, предназначенной для измерения акустических характеристик жидкостей, показаны на рис. 7 и рис. 8.
Концентрационные вклады, вносимые основными компонентами молока в скорость и поглощение ультразвука
Положительный знак коэффициента СЦ ; указывает на то, что рост концентрации і -го компонента в растворе сопровождается увеличением скорости ультразвука в растворе; отрицательный - свидетельствует об обратной зависимости.
Для белков молока, их отдельных фракций, лактозы и минеральных солей концентрационные вклады положительны по знаку, но различаются по величине (см. табл. I). Сравнительно велик удель - 53 НЕЙ концентрационный вклад, вносимый солевой смесью в молоке -(0,72 ± 0,01) м.с. мг см . Качественно эта величина хорошо совпадает с данными, полученными различными авторами, исследовавшими концентрационную зависимость скорости ультразвука в водных растворах электролитов (16,24). Скорость ультразвука в растворах таких соединений почти полностью определяется гидратацион-ным фактором кажущейся сжимаемости соединения.
Концентрационные вклады в скорость ультразвука для тотального изолированного казеина, его oCs- фракции, а также лак-тальбумина и лактоглобулина близки по величине, положительны по знаку. Рассчитанные величины &/. для этих соединений попа Т —т я дают в интервал 0,25 - 0,30 м.с мг см , что хорошо согласуется с данными по ультразвуковой велосимметрии глобулярных белков, приведенными в работах (29,106).
Существенно меньший вклад в величину Сі вносит казеин-кальций фосфатный комплекс в молоке. Рассчитанная величина Ct , для этого соединения равнялась (0,19 ± 0,02) м. мг см и была близка к величине & для глобулярных белков с большой молекулярной массой и белковых агрегатов (29). Мы предположили, что существенное различие в величинах &І для изолированного и агрегированного (ККФК) казеина, обусловлено структурной организацией этого компонента молока. Более подробно этот вопрос рассмотрен в главе 5 настоящей работы.
Измерения скорости ультразвука в цельном и обезжиренном молоке, проведенные при 25С, позволили выявить и количественно проанализировать концентрационный вклад, вносимый жиром молока (табл. 2). Линейный характер зависимости скорости ультразвука для этого компонента подтверждается графиком, показанным на рисунке II.
Исследовали также концентрационные зависимости поглощения ультразвука для каждого из рассматриваемых молекулярных компонентов молока. По полученным данным удалось провести разделение и количественную оценку доли концентрационных вкладов, вносимых жиром, лактозой, белками и их отдельными фракциями, а также минеральными солями (табл. 2). Можно видеть, что эти зависимости также, как и зависимости типа Л LL -fC&i) с хорошим приближением могут быть описаны линейными функциями в области.
Концентрационный вклад солевой смеси положителен по знаку и существенен по величине. Изучение состава солевой смеси, содержащей ионы Лд , Jtn , цитрата, и сопоставление данных о величине поглощения ультразвука в водных растворах электролитов (24,98), дало основание заключить, что наличие именно этих ионов играет значимую роль в возникновение поглощения ультразвука в водном растворе смеси электролитов. Наличие существенного релаксационного вклада в области частот около 7 мгц для UlnSOq, а
Концентрационный вклад, обусловленный лактозой пренебрежимо мал, даже когда этот компонент присутствует в растворе, в концентрации, близкой к 50 4- 60 мг.см (максимально допустимая концентрация лактозы в нормальном молоке).
Рассчитанные величины концентрационных вкладов; вносимых в параметр щ молочным жиром, казеином, ККФК, aCs - казеином, а также сС - лактальбумином и J3 - лактоглобулином приводятся в 3-й графе таблицы 2. Концентрационные зависимости параметра Vi для этих компонентов отражены графически на рис. 13. Можно убедиться в том, что линейный вид зависимости сохраняется во всем интервале изученных концентраций.
Вычисленные значения CL-i и Ос для основных молекулярных компонентов молока позволяют теоретически рассчитать скорость и поглощение ультразвука в молоке, используя имеющиеся литературные данные о составе объекта (51,52).
Экспериментальная проверка предположения о том, что состав молока является основным фактором, определяющих акустические характеристики объекта - скорость распространения и поглощения ультразвука, была проведена в настоящей работе следующим образом: ставили серию экспериментов, в которых измеряли величины
Температурные зависимости скорости и поглощения ультразвука в молоке и растворах основных молекулярных компо нентов молока
Исследовали температурную зависимость скорости и поглощения ультразвука для растворов лактозы, солевой смеси, казвин-кальций фосфатного комплекса, альбуминов и глобулинов, а также молочного жира в диапазоне температур 15-40С. Кривые, отражающие ход температурных кривых для рассмотренных соединении показаны на рисунках 14-16.
Характерной особенностью поведения температурных кривых скорости ультразвука в растворах рассматриваемых компонентов является уменьшение величины ALLAC с ростом температуры раствора, что качественно согласуется с ходом температурных кривых скорости ультразвука в растворах ряда биологических соединений, изученных другими авторами (101,102).
Существенная большая по сравнению с прочими компонентами молока, величина температурных коэффициента скорости ультразвука для жира, приводит к значительному различию в температурных наклонах кривых, отражающих ход зависимости: лЦ - (Т0) для цельного и обезжиренного молока (рассматриваются ниже).
Одной из задач, поставленных в диссертационной работе, было исследование температурных зависимостей скорости и поглощения ультразвука в цельном, обезжиренном молоке и молочной сыворотке. Температурная зависимость приращения скорости ультразвука для цельного, обезжиренного молока и молочной сыворотки. Качественное изображение. прирост скорости ультразвука в обезжиренном молоке - ли. (Г) по аддитивной схеме расчета этой акустической характеристики. Температурный наклон кривой ДІІ-УСТ0) дал обезшіренного молока рассчитанный из наших измерении этого параметра в образцах сборного и индивидуального молока с допустимой вариабельностью состава, также подчиняется условию аддитивности по компонентам:
Вариабельность содержание нежировых компонентов молока (табл. I) приводит к тому, что рассматриваемая кривая может располагаться в пределах заштрихованной области на показанном рисунке. Аналогичная зона, ограничивающая расположение кривой ALL-VCT0) ДЛЯ цельного молока, имеет несколько большую площадь, ввиду вариабельности концентраций веществ СОМО и молочного жира в цельном молоке.
Различие в наклонах температурных кривых скорости ультразвука в цельном и обезжиренном молоке приводит к появлению характеристической температурной зоны (13 16С) вблизи которой приращение скорости ультразвука в молоке не зависит от концентрации жирового компонента и целиком определяется веществами СОМО. Геометрические размеры характеристической зоны полностью определяются размерами заштрихованных областей ограничивающих расположение кривых АИ- СТУ для цельного и обезжиренного молока на координатной плоскости. Зона вырождается в точку пересечения кривых АІІ- СТУ Для конкретных образцов цельного и обезжиренного молока. Существование такой характеристической температурной точки было впервые выявлено в работах (1-3,5). Однако авторы не дали корректного объяснения наблюдаемому явлению и обошли молчанием факт существования температурной зоны.
Теми же авторами было впервые предложено использовать температурную зависимость скорости ультразвука в молоке для быстрого определения в нем концентрации молочного жира и суммарной концентрации вещества СОМО (1,6). Критическое рассмотрение такого способа анализа состава молока и поиск более эффективных путей использования возможностей акустического метода в этом плане проведено нами в заключительных разделах диссертационной работы.
На основании полученных нами экспериментальных данных удалось выявить температурную зависимость поглощения ультразвука в цельном и обезжиренном молоке, а также молочной сыворотке. Наблюдается слабая зависимость параметра л (dA) от температуры. Можно полагать, что потенциальная информативность измерений поглощения ультразвука в молоке и его фрагментах близка к информативности измерений этого параметра в любой из точек в диапазоне 15 - 40С. Это означает, что при анализе возможности определения состава молока акустическим методом введение дополнительных температурно-зависимых координат для величины (d/l ) нецелесообразно. Больший интерес может представлять сочетание данных по скорости и поглощению ультразвука в испытуемой образце молоке, с учетом линейного характера исследованных концентрационных и температурных зависимостей акустических параметров. Изучение имеющихся литературных данных о методах определения концентраций жира, белков, лактозы в молоке (I07-III) показывает, что одним из ключевых вопросов при разработке метода является метрологическое обеспечение прибора и методики.
