Введение к работе
Актуальность проблемы. Люминесцентная (флуоресцентная и фосфоресцентная) спектроскопия является одним из мощных инструментов исследования структурных, физико-химических и функциональных свойств белков [Бурштейн, 1976, 1977а; Lakowicz, 1983]. В большинстве случаев использования люминесцентной спектроскопии исследователи измеряют лишь флуоресценцию - излучение, вызываемое переходами между синглетными уровнями возбужденной молекулы, и чаще всего, при температурах выше 0С.
Флуоресценция при низких температурах и фосфоресценция - излучение, обусловленное переходами между триплетными и синглетными уровнями возбужденной молекулы, не получили широкого применения [Permyakov, 1993]. Только триптофановая фосфоресценция белков в растворах при температурах выше 0С, а также в стеклующихся средах при низких температурах применялась для изучения структурной динамики белков [Geacintov & Brenner, 1989; Strambini & Galley, 1980], выявления гетерогенности окружения триптофанилов [Domanus et al., 1979; Purkey & Galley, 1970] и регистрации конформационных изменений в белке [Gabellieri et al. 1988; Li & Galley, 1989].
В то же время, благодаря хорошему разрешению колебательной структуры в спектрах низкотемпературной флуоресценции и особенно фосфоресценции белков, их было бы заманчиво использовать для получения физической информации, касающейся окружения хромофоров в белках. Особенно богатую информацию можно бы было получать из спектров триптофановой люминесценции белков. К сожалению, до сих пор мы не имеем достаточно развитой теории для однозначной интерпретации спектров низкотемпературной люминесценции триптофановых остатков в белках.
Это связано как с отсутствием возможности использовать в качестве адекватных модельных систем замороженные растворы триптофана при изучении низкотемпературной люминесценции белка, гак и с наличием ряда специфических спектральных эффектов в замороженных растворах белков, обусловленных вымораживанием белка с молекулами неводной добавки [Бурштейн, 1976, 1977а; Фшгенко, 1977]. Это осложняет задачу
выявления связи между параметрами люминесценции и свойствами окружения индольного хромофора при низких температурах.
Существенное уменьшение динамичеких факторов влияния на параметры флуоресценции и фосфоресценции а также значительное улучшение разрешения колебательной структуры в спектрах излучения при низких температурах, по сравнению с комнатными, требует другого подхода для интерпретации низкотемпературных спектров, нежели тот, который обычно используетя в люминесцентной спектроскопии белка в случае растворов при температурах выше 0С.
Остается открытым вопрос о чувствительности параметров триптофановой флуоресценции и фосфоресценции при низких температурах к конформационному состоянию белка. Ответ на него мог бы быть важной предпосылкой для расширения возможностей метода собственной люминесценции белка.
Интерпретацию спектров излучения триптофановых остатков в белках при низких температурах существенно затрудняла и сложная электронная структура длинноволновой полосы поглощения триптофана, а также неопределенность в количестве участвующих электронных .переходов в излучении. До сих пор гак и не удалось однозначно ответить на вопрос сколько электронных переходов (один или два) формируют полосу флуоресценции индола и его производных [Конев, 1965; Черницкий, 1972; Бурштейн, 1976; Lami, 1977; Lakowicz, 1983; Демченко, 1988].
Анализ современной литературы показывает, что несмотря на имеющийся значительный прогресс в технике измерения высоко разрешенных спектров возбуждения и излучения, а также в методах квантовохимических расчетов, пока не удается однозначно ответить на все вопросы, касающиеся природы флуоресценции и фосфоресценции триптофана в белке.
Надо отметить, что большинство работ, посвященных исседованиям низкотемпературной люминесценции белков, было выполнено в то время, когда теория электронно-колебательных переходов в органических молекулах не была достаточно развита. Более того, выбор белков, содержащих один остаток триптофана и пригодных для модельных спектральных измерений, был довольно ограниченным и все это затрудняло количественные исследования низкотемпературной люминесценции белков.
Полуколичественная теория электронно-колебательных переходов была создана позднее несколькими авторами [Франк-
Каменецкий и Лукашин, 1975; Морозов и Бажулина, 1989] и получила широкое применение для анализа спектров излучения и поглощения многоатомных молекул. Было показано, что для излучательных переходов, затрагивающих низшие возбужденные состояния молекул, эффективным является использование адиабатического Франк-Кондоновского приближения [Франк-Каменецкий и Лукашин, 1975], в рамках которого распределение интенсивности излучения по частоте в спектре многоатомной молекулы удается выразить аналитически достаточно простой формулой.
Для анализа электронно-колебательных спектров сложных молекул был предложен теоретико-экспериментальный подход [Морозов, Савин, 1985]. Измеренный электронно-колебательный спектр сложной молекулы раскладывают на компоненты на основе физической модели. В результате этого становится возможным сравнивать рассчитанную теоретическую кривую с экспериментальным спектром, выполняя варьирование параметров выбранной физической модели. Такой подход в ряде случаев помогает получить дополнительную иинформацию по сравнению с прямым анализом экспериментального спектрального контура [Морозов и Бажулина, 1989]. Математическим критерием оптимального описания экспериментального электронно-колебательного спектра на базе выбранной физической модели в пределах данной точности измерения считают соизмеримость минимальной среднеквадратичной ошибки разложения с погрешностью измерения спектра [Морозов, Савин, 1985].
В настоящее время мы располагаем набором подробно изученных белков, содержащих по одному остатку триптофана на молекулу (для некоторых из них известна даже трехмерная структура). Кроме того, существует относительно разработанная и проверенная для ряда органических молекул теория электронно-колебательных спектров.
Эти два обстоятельства привели нас к решению возобновить исследования низкотемпературной люминесценции белков на новом уровне, используя достижения современной спектроскопии и физики белка, в надежде расширить возможности метода собственной люминесценции белка.
Цели и задачи исследования Главной целью настоящей работы явилось попытка аналитического описания электронно-колебательных спектров остатков триптофана в белках на основе физической модели и выявление связи между параметрами
низкотемпературной триптофановой флуоресценции и фосфоресценции белка и структурно-физическими свойствами окружения его индольного хромофора. Для достижения этой цели решены следующие задачи:
1. Измерены спектры низкотемпературной триптофановой
флуоресценции и фосфоресценции белков в различных состояниях, отличающихся локализацией их единственного триптофанила.
2. Найден способ адекватного аналитического описания спектров
триптофановой флуоресценции и фосфоресценции белка, измеренных при температуре 77 К.
3. Проверена чувствительность параметров низкотемпературной
триптофановой люминесценции к изменениям конформационного состояния белка. Для этого использовали хорошо известные конформационные переходы в белках, в ходе которых затрагивается окружение индольного хромофора.
4. Выявлено наличие взаимосвязи между отдельными
параметрами триптофановой люминесценции белка при температуре 77 К. Проанализирована их связь с локализацией индольного хромофора в белке. Научная новизна полученных результатов. Впервые к исследованиям низкотемпературной триптофановой флуоресценции и фосфоресценции белков применен теоретико-экспериментальный подход, основанный на теории электронно-колебательных спектров многоатомных молекул. Показано, что электронно-колебательные спектры фосфоресценции и флуоресценции остатков триптофана в белках при >температуре 77 К лучше всего описываются теоретической кривой, рассчитанной согласно модели, предполагающей существование двух независимых серий нормальных компонент, причем в каждой серии проявляется по одному типу колебаний. Впервые таким способом показано, что в полосе фосфоресценции остатков триптофана в белках, по-видимому, проявляются колебания двух типов, частоты которых лежат в диапазонах 650-800 см'1 и 1350-1500 см*1. Предложена интерпретация этих двух типов колебаний, базирующаяся на литературных экспериментальных и расчетных данных и основывающаяся на собственных экспериментальных результатах по замене НгО на D2O. Показано, что серия 1350-1500 см-1 в спектрах фосфоресценции белков соответствует колебаниям типа W5 (колебания бензольного кольца типа В 19а), а серию 650-800 см'1
можно отнести к колебаниям типа W18, т.е. к дыхательным колебаниям индольного кольца. Впервые на примере хорошо известных конформационных переходов в белках, содержащих по одному остатку триптофана (N~>F перехода в сывороточном альбумине человека, кислотного перехода в парвальбумине трески и тетрамеризации мелигтина из пчелиного яда), показано, что параметры низкотемпературной триптофановой люминесценции белков чувствительны к изменениям окружения индольного хромофора. В этих исседованиях использовали как традиционные спектральные параметры, так и дополнительные, полученные в результате подгонки экспериментальных спектров теоретическими кривыми, рассчитанными согласно модели, предполагающей существование в электронно-колебательных спектрах флуоресценции и фосфоресценции двух независимых колебательных серий. Впервые выявлена четкая корреляция между отдельными параметрами низкотемпературной триптофановой фосфоресцении и флуоресценции белков, что дает возможность проведения в дальнейшем более глубоких экспериментальных и теоретических исследований природы этого излучения.
Практическая ценность. Разработанные алгоритмы анализа электронно-колебательных спектров излучения гриптофановых остатков в белках при температуре 77 К можно использовать как для дальнейших исследований природы люминесценции белка, так и для регистрации структурных переходов в белке. Показана целесообразноть использования низкотемпературной люминесценции для исследований природы структурных перестроек в белках.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были доложены на научных семинарах лаборатории функциональной биофизики белка Института теоретической и экпериментальной биофизики РАН, Пущино 1993, 1994 и 1996 г., на ежегодных научных конференциях Институтов теоретической и экпериментальной биофизики и биологического приборостроения РАН, Пущино 1994 и 1995 г. соответственно, на VII Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1991), на II Международной конференции "Успехи современной криобиологии" (Харьков, 1992), на Международной конференции "Физика и химия органических люминофоров-95" (Харьков, 1995).
Публикации Основной материал диссертации опубликован в 5-ти печатных работах.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 4Si страницах текста, содержит 31 рисунок, 3 таблицы, 300 ссылок на используемую литературу и включает: введение, обзор литературы (главы 1-ІЙ), методическую часть, результаты и обсуждение (глава ГУ), выводы, заключительные замечания и список цитируемой литературы.