Введение к работе
-?-ци^ ктуальность проблемы. Созданная П. Мейзуром в 1963 году фи-
іико-математичеекая модель процесса обезвоживания клеток при за-юраживании биологической суспензии и обобщающая ее двухфакторная еория криоповреждения долгое время играли роль методологической існош при разработке оптимальных режимов криоконсервирования щеточных суспензий. История ее развития убедительно раскрыла >громные потенциальные возможности физико-математического анализа і численного моделирования криобиологических процессов для изуче-тя закономерностей и механизмов криоповреждения и криозащиты, а акже для объяснения результатов криоконсервирования клеток при ех или иных условиях замораживания-отогрева. Однако, пределы при-генимости указанной модели существенно ограничены, в частности, предположениями о постоянстве скорости охлаждения биологической :успензии и о проницаемости клеточных мембран только для молекул юды, тем более, что в криобиологической литературе появились со-ібщения об эффективности кусочно-линейных и экспоненциальных режи-юв охлаждения (Фаррант Дж., 1974; Вильиут И., 1972; Новиков А.Н. і др., 1985), которые не охватываются моделью П. Мейзура. Напри-іер, чрезвычайно эффективным для некоторых клеток оказался так газываемый метод быстрого двухступенчатого замораживания (Фаррант Ыч 1974; Вуд М., Фаррант Дж., 1980). По мнению Дж. Фарранта 1977) эффективность быстрого двухступенчатого замораживания сви-іетельствует против основных положений двухфакторной теории и, в гастности, против того, что скорость охлаждения оказывает сущеет-ієнноє влияние на выживаемость консервируемых с помощью низких емператур клеток. Его аргументы заключаются в том, что при быст-)ом двухступенчатом замораживании скорость охлаждения на двух эта-іах превосходит оптимальное в соответствии с двухфакторной теорией значение, а на этапе экспозиции при субнулевой температуре рав-га нулю и, следовательно, меньше оптимальней екорости. В связи с >тим актуальной стала задача критического пересмотра двухфакторной еории и создания более совершенной количественной модели, описи-шпцей процессы массоперекоса в клеточной суспензии на различных >тапах цикла низкотемпературного консервирования и объясняющей іричину и механизм эффективности нелинейных режимов охлаждения.
- A -
В рамках двухфакторной теории криоповреждения и криозащиты предполагается, что клеточная мембрана в процессе низкотшператур ного консервирования остается интактной, то есть ее состояние не изменяется. Но обезвоживание и оводнение клеток, которые имеют ме сто на всех этапах криоконсервирования, приводят к деформации их мембран даже в отсутствие непосредственного контакта с кристаллами льда. Результаты, полученные в работах В.С.Маркина (1980, 1981 1984), показывают, что при деформации в мембранах могут происходить явления, подобные тем, которые возникают при фазовом переходе липидно-белкового бислоя из жидкокристаллического в твердое гелеобразное состояние, а именно, латеральное разделение липидов, сепарация белков, образование макроскопических разрывов. Считаете (Белоус A.M., Бондаренко В.А., 1982), что фазовое разделение липидов и белков приводит к образованию микродефектов в структуре бислоя на границах твердой и жидкой фаз, вследствие чего нарушает ся барьерная функция мембран. Агрегация белков при латеральном разделении мембранных компонентов ведет к нарушению функционирова ния мембраносвязанных ферментов. В частности, в области температур ниже фазового перехода повышается активность различных фосфо-липаз, вызывающая гидролиз фосфолипидов до лизофосфатидов и свободных жирных кислот, наблюдается метаболический разбаланс между растворимыми и мембраносвязанными ферментными системами. То обсто ятельство, что изотермическая деформация клеточных структур способна вызвать такие же эффекты, как фазовый переход при охлаждени определяет актуальность и целесообразность изучения деформации кл точных структур и обусловленных ею явлений для выяснения причин, механизмов и закономерностей криоповреждення и криозащиты биологи ческих объектов.
Цель работы. Установить причину эффективности быстрых двухст; пенчатых режимов замораживания, а также механизм и закономерности явлений латерального разделения компонентов и нарушения барьерной функции клеточных мембран при их деформации в процессе криоконсер вирования.
Задачи исследования.
I. Методом численного моделирования изучить кинетику изменен) объема клеток, переохлаждения внутриклеточного раствора, концентр ций проникающего и не проникающего через плазматическую мембрану
веществ внутри клеток на этапах изотермической экспозиции клеток в криоконсервирующей среде, охлаждения биологической суспензии до яачала кристаллизации в ней и в процессе кристаллизации при охла-адении с постоянной, кусочно-постоянной и экспоненциально енияса-ощейся скорость» охлаждения.
-
Сформулировать рекомендации по применению нелинейных режи-йов охлавдения для низкотемпературного консервирования биологических объектов.
-
Методом физико-математического анализа установить причини, йеханизмы и закономерности явлений латерального перераспределения мембранных компонентов при различных типах деформации клеточных мембран.
-
Установить причину и механизм явления нарушения барьерной функции мембран при гипотоническом лизисе эритроцитов.
Научная новизна. Впервые с помощью физико-математического моделирования расчиташ зависимости переохлаздения внутриклеточного раствора, объела клеток и внутриклеточных концентраций проникающего и не проникающих через плазматические мембраны веществ от температуры при кусочно-линейных и экспоненциальных (двухступенчатых) режимах охлаадения.
Впервые указано и описано явление латеральной сегрегации мембранных компонентов при изотропном растяжении клеточной мембраны как альтернатива образованию в ней макроскопической поры.
Впервые построена физико-математическая модель, описывающая кинетику растворения внутриклеточных кристаллов льда при температуре адаптации в процессе быстрого двухступенчатого замораживания, и объяснен криозащитный эффект этого явления.
Построена новая модель сферификации эритроцитов, отличащаяся от существующих тем, что изменение формы клетки рассматривается как изометрическое преобразование исходной (дискоидной) поверхности клеточной мембраны, и предсказывающая наличие двух точек бифуркации, в которых эритроциты скачкообразно принимают вначале форму, близкую к стоматоциту, а затем - к сфероциту.
Впервые указаны физические причина и механизм неодинакового распределения липидов и белков по монослоям в замкнутых бислойных многокомпонентных мембранах, испытывающих деформацию изгиба.
Теоретически и экспериментально подтверждено, что гипотонический гемолиз эритроцитов происходит вследствие возникновения оди-
ночной макроскопической поры в мембране клетки при ее изотропном натяжении.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Методом физико-математического анализа и численного моделирования процессов массопереноса, протекающих при низкотемпературном консервировании клеточных суспензий, количественно изучена кинетика изменения состава цитоплазмы, объема клеток и переохлаждения внутриклеточного раствора в зависимости от режимов охлаждения, плотности клеток в замораживаемой суспензии и объемной доли осмотически неактивных веществ в клетках.
-
Криозащитный эффект быстрого двухступенчатого замораживания обусловлен понижением степени и длительности переохлаждения внутриклеточного раствора и продолжительности пребывания клеток
в гипертонических растворах на этапе кристаллизации клеточной сус пензии по сравнении с другими режимами охлаждения.
-
Получена количественная оценка для времени растворения внутриклеточного кристалла при изотермической экспозиции клеток в произвольной точке из области сосуществования в замораживаемой суспензии жидкой и твердой фаз.
-
Как изгиб, так и растяжение замкнутых бислойных многокомпонентных мембран вызывает сегрегацию мембранных компонентов, если различны их модули изотермического растяжения и (или) производные от средней площади на молекулу в недеформированном состоянии монослоя по их концентрации.
-
Гипотонический гемолиз эритроцитов обусловлен флуктуаци-оннш образованием одиночной макроскопической поры в мембране.
Теоретическое значение. Построена более общая, чем существующие, теоретическая модель, описывающая процессы массообмена клеток с окружающей их средой при различных условиях замораживания клеточных суспензий, которая позволяет сократить количество опытов, необходимых для разработки способа низкотемпературного консервирования биологического объекта, путем численного моделирования процессов, протекающих при его криоконсервировашта. Теоретически обоснована эффективность быстрых двухступенчатых режимов охлаждения.
С помощью физико-математического моделирования вычислены меняющиеся во времени состав внутриклеточной среды и переохлаждение внутриклеточного раствора, непосредственные количественные изме-
рения которых при современном уровне криобиологических исследований осуществить практически невозможно.
Теоретически обоснован более совершенный, чем существующие, алгоритм измерения коэффициентов проницаемости плазматических мембран клеток.
Развитые в работе теоретические представления могут служить основой для постановки, анализа и трактовки результатов криобиологических экспериментов.
Практическое значение. Результаты диссертации частично отражены в монографии "Биохимия мембран. Замораживание и криопротек-ция", М., Высшая школа, 198?, допущенной Министерством высшего и среднего специального образования СССР в качестве учебного пособия для студентов биологических и медицинских специальностей ВУЗов, а также использованы при разработке способов низкотемпературного консервирования тканевых лимфоцитов (1979), спераї ценных пород рыб (1978) и человека (1984) и определения криорезистентности эритроцитов человека (1988).
Полученные теоретические и экспериментальные данные свидетельствуют о целесообразности внедрения в практику низкотемпературного консервирования биологических объектов экспоненциальных режимов охлаждения и создания необходимой для их осуществления аппаратуры, состоящей из жидкостного криостата, поддерживающего заданную температуру в диапазоне от -20 до -40С, и контейнеров с приспособлением, обеспечивающим регулировку теплоотдачи от них в заполняющую криостат жидкость.
Структура и объем работы. Диссертационная работа содержит введение, обзор литературы, разделы "Результаты собственных исследований", состоящий из двух глав, и "Обсуждение результатов", выводы, список литературы, включающий 130 наименований, иллюстрирована 75 рисунками, 3 таблицами и изложена на 262 страницах машинописного текста.