Анализ молекулярных механизмов взаимодействия синтетических гомологов ретинола1 с компонентами эритроцитарной мембраны и свободным гемоглобином Резван, Сергей Григорьевич

Введение к работе

Актуальность проблемы. Особое место в ряду синтетических токсинов в настоящее время занимают биомиыетики - соединения, молекулы которых структурно гомологичны природным биологически-активным веществам. При попадании их в организм возможно индуцирование трудно предсказуемых реакций, приводящих к патологий жизненно ванных органов и систем. По этой причине одной из важнейших задач биофизики является установление корреляционной связи между структурой молекулы и её биологической активностью.

Разносторонние экспериментальные исследования функциональных свойств биомиметиков позволят оценить вклад отдельных групп атомов, особенности их молекулярной архитектоники в проявлении общей активности изучаемых соединений. К числу биологически-активных синтетиков с выраженными токсическими свойствами относят промежуточные продукты синтеза ретинола!: метилгептенон, дегидролиналоол и jj-ионон. По своей структуре последние представляют собой ненасыщенные, амфифильные алифатические и циклические соединения, обладающие летучестью и высокой проникающей способностью. Химические свойства указанных веществ изучены достаточно подробно, в то время как понимание молекулярных механизмов их биологической активности остаётся неполным.

Для выявления молекулярно-клеточных основ промышленной интоксикации человека синтетическими производными ретинола! представляет особый интерес изучение на модельных системах первичных реакций этих соединений при их взаимодействии с различными биологическими структурами. Исследования такого рода не могли получить должного развития в связи с нерешенной проблемой "доставки" гадрофобного вещества к растворенному в воде объекту исследования. Практически значимый интерес представляет задача по разработке возможных для условий производства методов утилизации синтетических токсинов из окружающей среды.

Цель и задачи работы. Цель работы состояла в исследовании молекулярных механизмов взаимодействия синтетических гомологов ретинола! с компонентами зритроцитарной мембраны и свободным гемоглобином.

Для реализации этой цели необходимо было решить ряд задач.

1. Разработать методику получения молекулярно-диспергирован-ньк шклюзионных комплексов типа "молекула-гость - молекула-хозяин" с использованием метода молекулярного инкапсулирования и провести анализ биологической активности водных растворов синтетических терпеноидов, включённых в ИК-комплексы.

Z. Изучить влияние метилгептенона (МГ). дегидролиналоола (ДГЛ), р-ионсна и ретинола, на структурные свойства эритроцитарных мембран методом осмотических и кислотных эритрограмм.

1. ИсследоЕать спектральные свойства растворов оксигемоглоби-на, модифицированного названными алифатическими и циклическими изопреноидами.

2. Изучить комбинированное действие кетонов (спиртов) и температуры на интенсивность светорассеяния в растворах КЬ0₂.

3. Автоматическими методами кислотно-основного и спектрофото-метрического титрования выявить характер взаимодействия МГ, ДГЛ, р-ионона и ретинола! с ионогеннши группами оксигемоглобина.

Научная новизна. Впервые методом молекулярного инкапсулирования получены водорастворимые инклюзионные комплексы (ИК) гидрофобных веществ (МГ, ДГЛ, р-ионона и ретинола!) с р-циклодекстрином (р-ЦД): в последовательно усложняющемся ряду названных изопренои-дов определен вклад отдельных групп атомов, степени полярности функциональных групп терпеноидных кетонов и спиртов, особенностей их внутримолекулярной архитектоники в проявлении ими общей активности в реакциях гидрофобного, нуклеофильного и электронофильного взаимодействий с указанными биологическими объектами в условиях, приближенных к физиологическим.

Методом автоматической регистрации осмотических эритрограмм определено, что инклюзионные комплексы МГ (ДГЛ) (1-Ю"⁸ * 1-Ю"³ моль/л), р-ионон С1 10^-э-*-1 10~³ моль/л) и ретинол! (1-10~^1г+1-10"³ моль/л) с р-циклодекстрином вызывают снижение осмотической резистентности эритроцитов, по величине которого (в интервале концентраций реагентов 1-Ю"⁶ * 1-Ю"³ моль/л) составлен ряд убывающей активности гемолитических агентов: МГ > ДГЛ > р-ионон > ретинолі.

Показано, что.модификация водных растворов оксигемоглобина синтетическими кетонами (МГ и р-ионон) и спиртами (ДГЛ и ретинол!) (С_мод= 1-Ю"³ + 1-Ю"¹⁰ моль/л) в составе инклюзионных комплексов с р-ЦД индуцирует переход гемопротеида в окисленную форму (MtHb).

Изучена динамика этого многоступенчатого перехода системы "Мод.+ НЬ0₂ -> Мод.- МШЬ". Установлено, что по суммарной химической активности, вызывающей изменения спектральных свойств растворов гемоглобина в условиях интоксикации (С_мод> 1-Ю"⁵ моль/л) кетонами или спиртами, формируется (как в случае химической модификации эритроцитарных мембран) следующий убывающий ряд: р-ионон > МГ > ретинол! > ДГЛ.

Изучено комбинированное влияние температуры и амфифильных ке-тонов (МГ, (5-ионон) или спиртов (ДГЛ, ретинол!) на конформационные свойства гемоглобина. Выявлен двухфазный характер конформационных переходов в апобелке, обусловленных суммарным вкладом гидрофобных, электростатических и ковалентньгх типов взаимодействия в системе "реагент-апоглобин".

В интервале рН 2*12 при 20 и 37 С установлена пропорциональная зависимость уменьшения буферной емкости растворов гемоглобина и числа ионогеннкх групп от концентрации МГ, ДГЛ, р-ионона и ретинола! Представлены схемы и реакции взаимодействия амфифильных реагентов с апоглобином в кислой, нейтральной и щелочной областях рН.

Практическая значимость. Научные положения и экспериментальные материалы диссертационной работы, выполненной в рамках содружества с Белгородским АО "Витамин", расширяют существующие и формируют новые представления о молекулярно-клеточных механизмах действия синтетических изопреноидов терпеноидного ряда (МГ, ДГЛ, (3-ионона и ретинола!) на структурные свойства эритроцитарных мембран и свободный оксигемоглобин, являющиеся ключевыми звеньями кис-лородтранспортной и адаптационно-защитной систем организма.

Выявленные концентрационная и видоспецифическая (от типа реагента и биологического образца) зависимости повышения гемолитической активности зритроцитов и процессов химической деструкции гемоглобина ксенобиотиками могут быть включены в перечень профилактических и терапевтических мероприятий с целью разработки эффективных методов предупреждения профессиональных заболеваний человека в условиях промышленной интоксикации.

Впервые установленные минимально действующие концентрации синтетических изопреноидов позволяют рекомендовать Минздраву РФ пересмотреть утвержденные и выработать объективные нормы ПДК и ОБУВ для условий промышленного синтеза витамина A_t и других каро-

тиноидов.

Разработка и внедрение предложенной модели молекулярного фильтра позволят снизить концентрацию летучих токсинов в промышленной зоне и тем самым снизить риск интоксикации организма человека.

Материалы работы используются в учебном процессе биолого-поч-векного факультета Воронежского государственного университета при чтении спецкурсов "Биоэлектроника и электрические методы измерения в биологии", "Электробиология" и при выполнении лабораторных работ малого и большого "Практикумов по биофизике", курсовых и дипломных работ студентами-биофизиками 4-5 курсов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на VII Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1991); Научных сессиях Воронежского госуниверситета (Воронеж, 1988, 1990, 1994); Международном симпозиуме "Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов" (Воронеж, 1995); Международной научной конференции "Математические модели нелинейных возбуждений, переноса, динамики, управления в конденсированных системах и других средах" (Тверь, 1996); Совещании-семинаре "Первичные фотофизические и фотохимические процессы в биосистемах различных уровней организации" (Воронеж, 1996).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 статей к 3 тезисов.

На защиту выносятся следующие положения

1. Метод молекулярного инкапсулирования гидрофобных веществ (МГ, ДГЛ, р-ионон и ретинол!) и получение их водорастворимых комплексов с (3-циклодекстрином.

2. Инклюзионные комплексы МГ, ДГЛ, р-ионона и ретинола! с р-циклодекстрином индуцируют снижение осмотической резистентности эритроцитов человека.

3. Ряд убывающей активности гемолитических агентов:

МГ > ДГЛ > (5-ионон > ретинол^

4. Метгемоглобин - конечный продукт воздействия МГ, ДГЛ, р-ионона и ретинола! на водные образцы оксигемоглобина.

5. Схемы химических процессов структурных модификаций белковых макромолекул (гемоглобин), индуцированных промежуточными продуктами синтеза витамина Aj.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа включает 165 страниц машинописного текста, 23 таблицы,'53. рисунка. Состоит из введения, девяти глав, заключения, выводов и приложения. Список литературы содержит 236 работ, из них 149 отечественных и 67 зарубежных.