Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ I. Обзор литературы
Глава 1. Антиоксиданты 8
1.1. Ферментативные антиоксиданты 9
1.1.1. Супероксидщтсмугаза 9
1.1.2. Каталаза 10
1.1.3. Г лутатионзависимые ферменты 10
1.2. Соединения с енольной группой 11
1.2.1. Фенольные антиоксиданты 11
1.2.2. Витамин Е 12
1.2.3. Хиноны 12
1.2.4. Флавоноиды 13
1.2.5. Каротииоиды 13
1.2.6. ВитаминС 14
1.2.7. Эстрогены 15
1.3. SH-содержащие соединения 15
L3J. Глутатион 15
1.3.2. Альбумины 16
L3.3. Cys-пероксиредоксин 16
1.3.4. Металлотионин 16
1.4. Хелаторы ионов металлов переменной валентности 16
1.4.1. Сидерофилины 16
1.4.2. Церулоплазмин 17
1.4.3. Мочевая кислота 18
1.5. Антиоксиданты другой природы 18
1.5.1. Мелатонин 18
1.5.2. Гистидинсодержащие дипептиды 19
1.5.3. Органические кислоты, спирты, сахара и амины 19
Глава 2. Радиозащитные вещества и их клиническое применение 20
2.1. Сульфгидрильные соединения 20
2.2. Антиоксиданты и перехватчики свободных радикалов 23
2.3. Ингибиторы ангиотензин-1-превращающего фермента 25
2.4. Иммуиомодудяторы и цитокины 25
2.5, Липополисахариды и простагландины 27
2.6. Соли металлов и металлотионин 28
2.7. ДНК связывающие агенты 28
2.8. РНК, гидролизаты РНК. нуклеозиды 29
2.9. Цитопротекторыые агенты 30
2.10. Соединения вызывающие гипоксию и сосудистоактивные вещества 30
Глава 3. Регуляторная роль АФК 31
3.1, Регуляторные функции АФК 32
3.1.1. АФК сенсоры 32
3.1.2. Изменение внутриклеточного окислительно-восстановительного потенциала 33
3.1.3. Окислительные модификации белков 34
3.1. Регуляторные функцииN0 38
ЧАСТЬ II. Экспериментальное исследование
Глава 4. Материалы и методы исследования 41
4.1. Материалы 41
4.2. Методы 42
4.2.1. Воздействие ионизирующего излучения и тепла 42
4.2.2. Определение концентрации ДНК 42
4.2.3. Очистка моноклональиых антител из асцитной жидкости 42
4.2.4. Иммунофермеытный анализ 43
4.2.5. Определение продукции перекиси водорода 43
4.2.6. Определение количества урацила образовавшегося вДНК при действии тепла 44
4.2.7. Определение продукции ОН-радикалов 45
4.2.8. Определение концентрации восстанавливающего агента 45
4.2.9. Тест на выживание 45
4.2.10. Микроядерный тест 46
4.2.11. Щелочной вариант метода комета-тест 46
4.2.12. Измерение собственной хемилгоминесцешщи белковых растворов 47
ЧАСТЬ III. Результаты исследования и их обсуждение
Глава 5. Влияние иуклеозидов на образование АФК в водных растворах in vitro при воздействии ионизирующего излучения и тепла 48
5.1. Влияние нуклеозидов на образование АФК в водных растворах in vitro при воздействии ионизирующего излучения 48
5.2. Образование АФК в водных растворах in vitro при воздействии тепла и влияние на этот процесс нуклеозидов 50
Глава 6. Влияние нуклеозидов на образование повреждений ДНК под действием ионизирующего излучения и тепла 58
Глава 7. Радиозащитные свойства гуанозина и инозина 65
Глава 8. Возможные механизмы действия защитного действия гуанозииа и инозина при введении их после воздействия ионизирующего излучения 71
8.1. Активация гуанозином и инозином процессов пострадиационного восстановления и репарации 71
8.2. Влияние гуанозина и инозина на элиминацию долгоживущих белковых радикалов 81
Заключение 89
Выводы 91
Список основных сокращений и обозначений 93
Список цитируемой литературы
- Г лутатионзависимые ферменты
- Антиоксиданты и перехватчики свободных радикалов
- Изменение внутриклеточного окислительно-восстановительного потенциала
- Определение продукции перекиси водорода
Введение к работе
Актуальность проблемы. Активные формы кислорода (АФК) постоянно образуются в аэробных клетках в результате нормального метаболизма и при воздействии таких внешних факторов, как ионизирующее излучение, ультрафиолет, ксенобиотики, тепло и т.д. [Bmskov et al,, 2002], Увеличение внутриклеточной концентрации АФК свыше уровня антиокеидантной защиты вызывает «окислительный стресс», который сопровождается опасными для жизнидеятельности клеток процессами, такими как перекисное окисление липидов, окислительная модификация белков и нуклеиновых кислот [Зевков и др., 2001 ]. Окислительные повреждения ДНК тесно связаны с процессами мутагенеза [Cheng et al., 1992], канцерогенеза [Olinski et al., 2002], старения и ряда связанных с ним болезней пожилого возраста [Beclanan, Ames, 1997]. Необратимые повреждения молекул ДИК также являются одной из основных причин пострадиационной гибели животных [Ярмоненко, Вайнсон, 2004]. Значительная часть (60-80%) повреждений ДНК, вызванных радиацией, формируется за счет АФК, образующихся при радиолизе воды [Газиев, 1999]. Установлено, что АФК не только повреждают молекулы клеток, но выполняют в организме еще и сигнальную роль pent et al., 2003].
Явление антимутагенеза - уменьшения частоты спонтанных и индуцированных мутаций под влиянием пуриповых нуклеозидов- было обнаружено впервые свыше 50 лет тому назад на бактериях Escherichia coll [Novick, Szilard, 1952]. Однако молекулярные механизмы их антимутагенного действия до сих пор остаются неясными. В 50-60-х годах прошлого века было обнаружено, что экстракты и гидролизаты РНК из дрожжей защищают от повреждающего действия ионизирующей радиации растения [Лучник, 1958] и животных [Detre, Finch, 1958; Maisinet at, 1959]. Установлено, что радиозащитный эффект проявляется при введении РНК животным как перед, так и после облучения [Roberts et al., 1965; Wagner, Silverman, 1967]. Хотя радиозащитные свойства РНК и ее Гйдролизатов давно известны, механизм их действия и компоненты, определяющие активность этих соединений, до сих пор остаются невыясненными. Позднее были показаны радиозащитные свойства инозина при введении его до воздействия гамма-излучения на морских свинках [Вернигорова и др., 1990], собаках [Чертков, Петров, 1993] и крысах [Вернигорова и др., 2005]. В настоящее время инозин (под коммерческим названием "рибоксин") используется в медицинской практике как кардиопротектор. Недавно приказом Минздрава он разрешен к медицинскому применению в качестве радиозащитного препарата [Вернигорова и др., 2005]. Изучение антиоксидантных и радиозащитных свойств пуриновых рибонуклеозидов, а также механизмов их действия
представляет собой актуальную фундаментальную проблему и имеет существенное значение для применения нуклеозидов в практических медицинских целях.
Цель и основные задачи исследования. Цель работы заключалась в изучении антиоксидантних и радиозащитных свойств природных пуриновьгх и пиримидиновых рибонуклеозидов.
В соответствии с целью были поставлены основные задачи:
Изучить влияние природных пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов на процесс генерации гидроксильных радикалов и перекиси водорода in vitro в водных растворах под действием ионизирующего излучения и тепла.
Исследовать влияние природных пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов на образование повреждений ДНК под действием ионизирующего излучения и тепла.
Оценить радиозащитные свойства природных пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов и исследовать возможные механизмы их радиозащитного действия.
Научная новизна. Впервые установлено, что пуриновые нуклеозиды являются природными антиоксидантами. Они, особенно гуанозин и инозин, значительно уменьшают количество перекиси водорода и гидроксильных радикалов, образующихся в водных растворах при воздействии ионизирующей радиации и тепла in vitro. Впервые показано, что природные нуклеозиды in vitro эффективно предотвращают образование в ДНК 8-оксогуанина (7,8-дигидро-8-оксогуашша) - ключевого биомаркера окислительного повреждения ДНК под воздействием гамма-радиации и урацила - продукта дезаминирования цитозина под действием тепла. Наиболее значительными защитными свойствами обладают гуанозин и инозин. Эти нуклеозиды предотвращают дезамипирование цитозина при воздействии на ДНК ионов уранила. Впервые показано, что гуанозин и инозин уменьшают количество радиационно-индуцированных повреждений ДНК в лейкоцитах мышей, а также значительно нормализуют эритропоэз после воздействия ионизирующего излучения. Обнаружен «кислородный эффект» при тепловом дезаминировании цитозина в ДНК. Гуанозин и инозин проявляют радиозащитные свойства, причем наиболее существенный эффект наблюдается при введении их мышам через 15 мин после воздействия ионизирующего излучения. Эти нуклеозиды, подвергнутые облучению, не оказывали защитного эффекта. Установлен фактор уменьшения дозы для гуанозииа (1,23) и инозина (1,15) при введении нуклеозидов через 15 мин после облучения в концентрации 30 мкг/г. Радиозащитный эффект гуанозииа и инозина при введении животным после воздействия ионизирующей радиации проявляется в результате их цитопротекторного действия на лейкоциты крови, нормализации эритропоэза и более быстрого восстановления повреждений ДНК. Показана принципиальная возможность
реализации радиозащитного эффекта за счет элиминации долгоживущих белковых радикалов, образующихся в клетке в результате воздействия ионизирующего излучения. Научно-практическая ценность. Впервые установлены антиоксидантные свойства гуанозина и инозина (рибоксина). Показано, что данные иуклеозиды препятствуют повреждению ДНК in vitro и in vivo при воздействии ионизирующего излучения и тепла. Полученные резулвтаты свидетельствуют о том, что они могут быть использованы как антиокислители и биологически активные добавки, препятствующие патологическим последствиям окислительного стресса. Впервые показано, что гуанозин и инозин появляют радиозащитпые свойства при введении их животным после воздействия ионизирующего излучения. Эти иуклеозиды могут использоваться как средство модификации радиочувствительности человека и животных, при радиотерапии опухолей в клинике, для уменьшения риска радиационных повреждений биомакромолекул, а также для защиты генома млекопитающих в условиях действия неблагоприятных факторов внешней среды.
ЧАСТЬ I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Г лутатионзависимые ферменты
К ним относят соединения, имеющие в своей структуре ароматическое кольцо, связанное с одной или несколькими гидроксильными группами (АгОН) [Рогинский, 1988]. Такие соединения являются перехватчиками перекисных и алкоксильных радикалов в реакциях: RO + ArOH ROH + ArO R0 2 + АгОН -» ROOH + АгО ArO + RO 2- R02ArO АгО + АгО - Аг202
Классическим представителем фенолов является синтетический антиоксидант пробукол (2,2-бис[3,5-ди (грет-бутил )-4-гидроксифе-нилтио] пропан), обладающий более выраженной ингибирующей активностью в отношении ПОЛ, чем эндогенные антиоксиданти [Baumstark el а]., 1992; Gotoh el al., 1992], при этом низкая токсичность пробукола способствовала его широкому клиническому применению для профилактики атеросклероза у людей с гиперхолестеринемией [Лякишев и др., 1995].
Известен с ] 926 года как фактор, содержащийся в высоких концентрациях в семенах пшеницы и масле семян салата, предотвращающий стерильность крыс, питавшихся прогорклыми липидами. В чистом виде первые два токоферола а и [Ї были выделены из зародышей пшеницы в 1936 году [Evans et al, 1936]. Витамин Е имеет четыре формы, проявляющие антиоксидантную активность: а, В, у и 6 токоферолы [Brigelius-Flone, Traber, 1999]. Они синтезируются в клетках растений и находятся преимущественно в маслах. Токоферолы эффективно элиминируют: супероксидный апион-радикал [Zhou, Zheng, 1991], синглетный кислород [liaiser et al., 1990], пероксирадшсалы [Suarna et al, 1992], ОН-радикал [Miura et al., 1993], индуцированные ROO- и ОН-радикалами процессы ПОЛ [Zhou, Zheng, 1991] и окисление липидов низкой плотности [Brigelius-Flone, Traber, 1999]. На группе состоящей более чем из 2000 пациентов страдающих атеросклерозом коронарных сосудов, показано, что при приеме витатина Е в течение 2 лет частота инфарктов миокарда с летальным исходом уменьшается на 77% [Stephens et al., 1996].
Впервые убихинон был выделен в 1958 году и охарактеризован как бензохинон, присоединенный к ненасыщенной изопреноидной боковой цепи. Типичные убихиноны, выделенные из бактерий, содержат от шести до десяти изопреновых звеньев. В организмах млекопитающих в основном представлены формы с девятью или с десятью такими звеньями. Одним из представителей хинонов является коэнзимом Q, который функционирует в цепи переноса электронов [Зенков и др., 2001]. Помимо коэнзимома Q в группу хинонов входит также менахинон (витамин К2) - производное 2-метил-1,4-нафтохинона, замещенное в положении 3 остатком полиизопреиовощ а также родохинон, который встречается у некоторых пурпурных бактерий. Аналогично коэнзимому Q данные хнноны участвуют в цепях переноса электронов и, обладают способностью отдавать и связывать протоны. Убихиионы эффективно элиминируют: пероксирадикаяы [Бурлакова, Храпова, 1985], алкоксильные радикалы, супероксид анион- и ОН-радикалы [Зенков и др., 2001].
Являются полифенольными соединениями и образуют гетерогенную группу отличающихся по химической структуре и свойствам [Cook et al., 1996]. Структурной основой всех флавоноидов является флавоновое ядро. В зависимости от структуры ядра выделяют собственно: флавонолы, флавоны, флаваноны, катехины, антоцианидины, изофлавоны, дигидрофлавонолы, халконы [Graf el al., 2005].
Флавоноиды широко представлены в овощах, фруктах, цветах, семенах растений, орехах, коре деревьев и поэтому являются важной составной частью рациона питания животных и человека [Schijlen et al., 2004]. В растениях флавоноиды служат для защиты от грибковых паразитов, гербицидов, окислительных повреждений и способствуют опылению [Cushnie, Lamb, 2005].
Флавоноиды ингибируют процессы ПОЛ на стадии инициации, взаимодействуя с супероксид анион-и ОН-радикалами [Torel et al., 1986].
В настоящий момент выделено и охарактеризовано более 600 различных каротиноидов, среди которых наиболее изученным и часто встречающимся является Р-каротин. Молекулы всех каротиноидов имеют в своей структуре полиеновуго цепь с чередующимися двойными связями, однако их концевые группы могут отличаться. К каротиноидам относятся ликопины, араксантины, лютеины, ксантофиллы [Paiva, Russell, 1999]. Показано, что каротиноиды являются эффективными антиоксидантами [Palozza, Krinsky, 1992] и обладают антиканцерогенным действием, что делает их важным элементом защиты генома клеток от окислительных повреждений [Gutteridge, Quinlan, 1992; Rousseau et al., 1992]. Для р-каротина характерна высокая тканевая специфичность: при назначении диеты с 3%-ным содержанием Р-каротина количество гидроперекисей фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина в эритроцитах снижалось в 50 и 13 раз соответственно, и не изменялось в плазме, легких и печени, хотя содержание антиоксиданта повышалось во всех изучаемых тканях [Nakagawa et al., 1996]. Каротиноиды являются эффективными тушителями синглетного кислорода. ]02 + р-каротин - 02 + 3(Р-каротин)
Шести углеродный лактои который синтезируется из глюкозы [Sebastian et al, 2003]. Аскорбиновая кислота - наиболее важный антиоксидант плазмы крови человека, ее содержание в плазме в норме составляет 20-60 мкМ [Halliwell et al., 1990]. Многие клетки имеют механизмы активного транспорта аскорбиновой кислоты, реализованные преимущественно через глюкозный транспортер [May, Qu, 1995], поэтому в клетках аскорбат может накапливаться в ммллимолярных концентрациях [Washko et al., 1991]. Витамин С обнаружен практически во всех тканях млекопитающих, однако больше всего его содержится в надпочечниках, гипофизе и вюгочковой железе; в меньшей степени он представлен в печени, селезенке, поджелудочной железе и головном мозге [Зеиков и др., 2001]. В биологических субстратах аскорбиновая кислота обладает чрезвычайно широким спектром антиоксидантных свойств, в число элиминируемых ею АФК входят: НОСІ [Halliwell et al., 1987], супероксидный анион-радикал [Gotoh et al., 1992], синглетный кислород, H(V, R02\ гидроксилъный радикал [Зеиков и др., 2001]. Кроме того, витамин С обезвреживает нитрозамииы и озон [Sebastian et al., 2003].
Антиоксиданты и перехватчики свободных радикалов
Некоторые алифатические спирты, включая этанол [Burnett et al., 1951], пропилен гликоль [Alexander et al., 1955], глицерин [Alper, 1962] и т.п. являются хорошими перехватчиками свободных радикалов. Кроме алифатических спиртов показано радиопротекторное действие ряда органических кислот, таких как пировииоградная кислота, муравьиная кислота, каприловая кислота и салициловая кислота [Alexander et al., 1955]. Тем не менее, эти факты представляют только академический интерес, так как спирты и органические кислоты в концентрациях необходимых для радиоциониои защиты весьма токсичны.
Исследования in vitro и in vivo с хорошо растворимыми в воде нитроксидами, показали, что нитроксиды проявляют радиозащитные свойства при введении до воздействия ионизирующего излучения [Mitchell et al., 1990]. Показано, что темпол (низкомолекулярный нитроксид, C9H18NO2, 4-гидрокси-2,2,6,6-тетраметил-пиперидинооксил) свободно проникает через клеточную мембрану и элиминирует супероксид радикал по принципу суиероксиддисмутазы [Hahn et al., 1999]. Этот нитроксид при введении за 10 минут до воздействия радиации снижает вероятность смерти мышей [Hahn et al, 1992], предотвращает потерю волосяного покрова мышами и человеком [Cuscela et al, 1996], защищает от повреждений слюнные железы [Vitolo et al., 2004]. Было показано, что нитроксиды с шестичленным циклом, как у темпола, восстанавливаются быстрее, чем пятичленньте. Перехват свободных радикалов и индукция гипотензии и гипоксии костного мозга лежат в основе механизма радиопротекторного действия этих соединений [Hahnetal., 1994; Hahn et al., 1998].
Полисахариды, подобные декстрану [Blondal, 1957] или мукополисахаридам, достаточно активны в локальной защите кожи [Bacq, 1962]. Установлено, что три полисахарида выделенных из дрожжей (MNZ, GLP/Bo4 и GLP/Bo5) и один из родотолуры (MNR) оказывают существенный протекторный эффект при введении за 15 минут до воздействия ионизирующего излучения, факторы уменьшения дозы составляет 2,16; 1,93; 1,8 и 1,94 соответственно [Maisin et al., 1986]. Так же известны радиозащитные свойства такого полисахарида, как хитозан [Скрябин и др., 2002]. Показано, что при внутривенном и внутримышечном введении низкомолекулярного хитозанадо воздействия у-излучения в дозе 8 Гр существенно повышается выживаемость мышей и морских свинок [Ильин и др., 2004].
Витамин Е обеспечивают защиту организма от ионизирующего излучения [Копораска, 1996]. Установлено, что токоферолы эффективно нейтролизуют супероксидный анион радикал [Zhou and Zheng, 1991], синглетиый кислород [Dimascio et ah, 1990; Kaiser et al., 1990], пероксирадикалы [Suarnaet al, 1992], ОН радикалы [Miuraet aL 1993], а также индуцированные ROO- и ОН-радикалами процессы перекисного окисления липидов [Zhou and Zheng, 1991]. Показано, что витамин Е уменьшает количество окислительных повреждений липидов и ДНК печени крыс при тотальном облучении [Yoshimura et al., 2002], Масло из бобов сои, которое содержит большое количество витаминов А и Е, обеспечивает мышам надежную защиту от продуктов радиоактивного распада урана и полония [Harapanhalli et al., 1994], Воднорастворимая производная витамина Е (токоферол моноглюкозид), эффективно защищает ДНК in vitro от воздействия гамма-радиации, а также мышей после внутрибрюшинного или перорального введения [Nair et al., 1999]. В настоящее время токоферол сукцинат является самой эффективной формой витамина Е используемой для защиты от радиационных повреждений [Prasad et al, 2002].
Среди ферментативных антиоксидантов радиозащитные свойства проявляют разные формы СОД. Введение СОД до воздействия радиации уменьшает уровень радиационных повреждений ДНК [Weiss, 1997; Augustine et al.s 2005]. СОД при введении вскоре после облучения снижает тяжесть фиброза легкого [Chen et al., 2004] при введении до воздействия радиации устраняет мукозит в полости рта и ротовой части глотки, а также легочный фиброз [Carpenter et al, 2004], 28-кДа l-Cys-пероксиредоксин VI, белок-протектор, новый представитель недавно обнаруженного семейства "тиол-специфических антиоксидантов" [Пешенко и др., 1996; Peshenko et al., 1996; Novoselov et al., 1999]. Белок секретируется в слизь, покрывающую эпителий верхних дыхательных путей млекопитающих [Новоселов и др., 2000]. Основной функцией этого 28-кДа белка-протектора является разрушение органических и неорганических перекисей, образующихся под воздействием активных форм кислорода. Белок 28-кДа l-Cys-пероксиредоксин VI вносит основной вклад в нейтрализацию АФК (70-80 %) в трахее и бронхах легких, являясь преобладающим белком среди водорастворимых белков слизи [Новоселов и др., 2000]. К настоящему времени методами молекулярной биологии показано, что это семейство "тиол-специфических белковых антиоксидантов" отличается высокой консервативностью и его представители присутствуют практически во всех живых организмах от бактерий и растений до человека [Novoselov et al., 1999].
Мелатонин (К[-ацетил-5-метилокситрипамин), гормон шишковидной железы, очень эффективный перехватчик свободных радикалов и антиоксидант [РІегі et al., 1994; Reiter, 1995; Pierre її che, Laborit, 1995; Vijayalaxmi et al., 1996]. При введении мелатонина мышам до воздействия ионизирующей радиации наблюдалось существенное уменьшение хромосомных аберраций в сперматогониях и сперматоцитах, а так же количества микроядер в красном костном мозге [Badr et al., 1999].
Для некоторых экстратов растений и травяных вытяжек в исследованиях in vitro и in vivo показано их радиопротекторное действие. Радиозащитные свойства объясняются их антиоксидантними свойствами [Kumar et al., 1996; Hsu et al,, 1999; UmaDevi, Ganasoundari, 1999; Uma Devi et al., 1999; Chaudhary et al., 1999; Kamat et al., 2000]. Однако, ни о каких испытаниях или их клиническом использовании пока не сообщается.
Ингибиторы ангиотензин-1-превращающего фермента и блокаторы ангиотензин-П тип-1 рецептора, оказались эффективными в профилактике радиационно-индуцированиого поражения легких и почек у экспериментальных животных [Ward et al., 1993; Moulder et al., 1998] и человека [Cohen, Robbins, 2003; Moulder et al., 2004; Nayak, 2005]. Различные ингибиторы ангиотензин-1-превращающего фермента, такие как пенциламин, пентоксифишщ, элаиноприл и т.п., тестировались на радиозащитные свойства, Каптоприл (меркапто-2-метил В-З-пропанол-Ъ-пролип), широко применяется как антигипертензивное средство [Molteni et al., 2000]. Показано, что каптоприл, существенно нормализует вызванную радиацией раннюю реакцию легких у крыс [Ward et al., 1993]. Терапевтическое действие каптоприла частично приписывается предотвращению индуцированному ионизирующим излучением увеличению легочного артериального давления, которое приводит отекам легких. Кроме того, вызванные радиацией повреждения легких, ведут к пневмониту и чрезмерным фиброзам. Ингибиторы ангиотензин-Тпревращающего фермента и блокаторы ангиотензин-П тип-1 рецептора предотвращали эти реакции, Пенциламии - является слабым ингибитором аигиотензин-1-превращающего фермента, однако это эффективный антифиброзный агент, обладающий антивоспалительными качествами [Ward et al,, 1983]. Использование ингибиторов ангиотензин-1-превращающего фермента и блокаторов ангеотеизин рецептора открывает новые возможности в радиотерапии при высоких дозах облучения и позволяет существенно лучше устранять их побочные эффекты. Тем не менее, действие этих лекарственных средств является тканеспецифическим, поскольку сообщалось, что каптоприл не обеспечивает никакой защиты, желудочно-кишечного тракта [Moulder, Fish, 1997].
Изменение внутриклеточного окислительно-восстановительного потенциала
Млекопитающие обладают по-крайней мере двумя Н2С 2-сенсорами, один из которых находится в неироэпителиальных тельцах легкого и отвечает за сужение дыхательных путей при повышении уровня Н2О2 [Lopez-Bameo, 1994; Fu et al., 2000], а другой выполняетту же функцию применительно к кровеносным сосудам, находясь в клетках каротидного синуса [Wyatt et al., 1995]. Оба Н2О2- сенсора очень близки по своей структуре и состоят из двух независимых белковых систем, локализованных в плазматической мембране упомянутых выше клеток: ЫАДФН-оксидазы и К -канала, активируемого перекисью водорода. Предполагается, что эта система работает так: НАДФЫ-оксидаза окисляет внутриклеточный НАДФН и переносит электрон через мембрану на ее внешнюю сторону. Там происходит одноэлектронное восстановление 02 до 0{. Происходит реакция 2 02 + 2КҐ - Н202 Н- 02. Перекись водорода реагирует с К+-каналом, канал стабилизируется в своей открытой коиформации, изменятся мембранный потенциал на плазматической мембране. Изменение потенциала ведет к выработке серотонина, который в случае легочных неироэпителиальных клеток служит медиатором расширения дыхательных путей [Скулачев, 2001]. Кроме тога, недавно было сообщено о том, что НгО; активирует НАДФН-оксидазу, генерирующую супероксид в клетках гладких мышц сосудов и фибробластах [Li et al., 2001]. Это означает, что образование Н202, скажем, клетками каротидного синуса способно включить автокаталитический механизм, амплифицирующий сигнал перекиси водорода. Совершенно очевидно, что такой каскад может резко усилить способность АФК блокировать доставку 02 в ткани [Скулачев, 2001]. Вероятно перекись водорода воздействует не только на К+ каналы. Показано, что Н2О2 вызывает достоверное дозозависимое повышение концентрации кальция в эндотелиальных клетках человека и крысы [Volk et aL, 1997], в одноядерных клетках периферической крови [Korzets et al., 1999] и в клетках высшего растения -арабидопсиса [Pei et al., 2002]. Кроме того, установлено, что перекись водорода, супероксид анион и синглетньш кислород причастиы к активации Са" - каналов плазмолеммы животных; [Kourie, 1998] и растительных клеток [Lecourieux et al., 2002], а также инозитол-1,4,5-трифосфат- и риаыодин чувствительных Са2г - каналов саркоплазматического ретикулума [Kourie, 1998].
Кроме сенсоров чувствительных к перекиси водорода существуют суперокид-аниои сенсеры, расположенные в полости носа, однако их действие может быть опосредованно образованием Ц2Ог при дисмутации супероксид-аниона [Гольдштейн, 2002]. Впервые физиологическое влияние суперокид аниона на обмен серотонина в тканях трахеи и бронхов было показано Крюгером [Kmeger, Smith, 1959], После ингаляции смесью содержащей повышенную концентрацию суперокид анион радикалов так же наблюдается возбуждение сенсорных нейронов, некоторые изменения в структурах ядер гипофиза (в передней доле гипофиза возрастает число гормон-продуцирующих адеиоцитов, особенно адренокортикотропоцитов и шреотропоцитов), стимуляция выработки кортизозола, активация дофаминэргической системы мозга и тиреотропной функции [Гольдштейн, 2002].
По сравнению с внеклеточной окружением, в цитозоле обычно поддерживается постоянный окислительно-восстановительный потенциал. Это достигнуто за счет окислительно-восстановительной буферной системы внутриклеточных тиолов, прежде всего глутатиона (GSH) и тноредоксина (TRX). Высокие соотношения востановленого GSH и TRX к окисленному достигаются за счет деятельности глутатиои- и тиоредоксинредуктазы, соответственно. Обе из этих окислительно-восстановительных систем противодействуют внутриклеточному окислительному стрессу, уменьшая концентрацию Н2О2 и R.OOH [Thannickal, Fanburg, 2000]. Накапливающиеся сведения о роли АФК свидетельствуют, что GSH и TRX участвуют в клеточной сигнализации [Liu et al., 2005] и поддержании гомеостазаклетки [Yamawaki et al., 2003].
Показано, что GSH регулирует окислительно-восстановительную передачу сигналов за счет изменения тотального уровня GSH [Droge et al., 1994; Sen et al., 1997], а также за счет изменения отношения его окисленной формы (GSSG) к восстановленной (GSH) [Knoepfel et al,, 1994; Henschke, Elliott, 1995]. Как установлено, клеточное истощение GSH связано с уменьшением количества клеточных делений в эндотелиальных клетках сосудов [Whisler et al., 1995] и увеличением в фибробластах [Cantin et al., 1990]. Ингибирование роста в эндотелиальных клетках сосудов TGF-f31 (transfonning growth factor pi) на фоне истощения GSH, по крайней мере частично, изменяет его антипролиферативный эффект [Das et al., 1992]. Установлено, что автофосфорилирование рецептора PDGF (platelet-derived growth factor) ингибируется низкими уровнями GSH в клетке [Rigacci et al., 1997]. В ядре, GSH регулирует связывание фактора транскрипции Sp-1 с ДНК [Thannickal, Fanburg, 2000].
TRX - не большой многофункциональный белок с двумя редокс-активными цистеинами (Cys-Gry-Pro-Cys) [Nakamura et al., 1997]. Показано, что TRX может регулировать деятельность некоторых белков за счет прямого связывания с ними. Установлено, что TRX - ингибирует апоптоз сигнал регулирующую киназу ASK-1 (apoptosis signal-regulating kinase-1) за счет связывания с ее терминальной областью и, что и TNF-a (tumor necrosis factor) и АФК активируют ASK-1, вызывая его диссоциацию с TRX [Saitoh et al., 1998]. Определено, что TRX может взаимодействовать на прямую с глюкокортикоидным рецептором, это взаимодействие проявляется наиболее существенно в условиях окислительного стресса [Makino et al., 1999]. Есть также свидетельства, что TRX может перемещаться из цитозоля в ядро в ответ на окислительный стресс и регулировать там экспрессию генов через ядерный фактор Ref-1 (redox factor-]), который влияет на фактор транскрипции АР-1 [Hirota et al., 1997]. Также известен подобный эффект влияния TRX на связывание NF-kB с ДНК [Hirota et al., 1999]. Кроме того, TRX регулирует другие факторы транскрипции: р53 [Pearson, Merrill, 1998] и PEBP2/CBF [Akamatsu et al., 1997]. Вероятно, редокс-сигнализация, осуществляемая TRX может регулироваться еще и на уровне изоформ. Так показано, что цитозольный и митохондриальный тиоредоксин в одинаковых условиях окисляются с разной скоростью [Hansen et al., 2006].
Определение продукции перекиси водорода
В нашей лаборатории, для количественного определения 8-оксогуаиина в ДНК, разработай неконкурентный иммуноферментный анализ с использованием моноютанальиых антител, специфичных к 8-оксо гуанину [Брусков и др., 1999].
Образцы ДНК (350 мкг/мл) денатурировали кипячением на водяной баие 5 мин и охлаждали во льду 3-4 мин. Аликвоты (42 мкл) наносили на дно лунок иммуиофермеитиых планшет. ДНК иммобилизовали с помощью простой процедуры адсорбции при инкубации в течение 3 ч при 80С до полного высыхаиия раствора [Нігауаша et al., 1996]. Блокировали неспецифические места адсорбции, используя 300 міси раствора, содержащего 1% сухого обезжиренного молока в 0,15 М Трис-HCl буфере, рН 8,7, и 0,15 MNaCl. После этого планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение ночи (14-18 ч). Образование комплекса антиген-антитело (100 мкл/лунку) с антителами, специфичными к 8-OG (в разведении 1:2000), проводили в блокирующем растворе путем инкубации в течение 3 ч при 37С. Дважды промывали (300 мкл/лунка) раствором 50 мМ Трис-НСІ буфер, рН 8,7, и 0,15 MNaCl с 0,1% тритоном Х-100 после 20 мин инкубации. Затем формировали комплекс с конъгагатом (анти-мышипым иммуноглобулином, меченным пероксидазой хрена (1:1000) в блокирующем растворе (80 мкл/лунка), инкубируя 1,5 чпри 37 С. Потом промывали лунки 3 раза аналогично тому, как описано выше. Далее добавляли хромогенний субстрат - 18,2 мМ ABTS и перекись водорода (2,6 мМ) в 75 мМ цитратном буфере, рН 4,2 (100 мкл/лунку). По достижении окрашивания, реакцию останавливали добавлением равного объема 1,5 мМ NaNj в 0,1 М цитратном буфере, рН 4,3. Оптическую плотность образцов измеряли на планшетном фотометре (Titertek Multiscan, Финляндия) при Я=405 им.
Для количественного определения перекиси водорода в водных растворах, использовали высокочувствительный метод усиленной хемилюминесценции в системе люминол-р-йодофенол-пероксидаза хрена. В качестве хемилюмииометра использовали жидкостный сцинтилляционный счетчик "Бета-1" (Украина) для измерения -излучения, работающий в режиме счета одиночных фотонов (без схемы совпадений) или хемилюминометр Биотокс-7А (Россия). Опытные образцы подвергали воздействию рентгеновского излучения или прогревали в флаконах из полипропилена, в термостате U-10 (Priifgerate-Werk Medigen, Германия) при разных температурах (с точностью до ± 0,1 градуса) в течение различных временных интервалов. Концентрацию образовавшейся перекиси водорода рассчитывали используя калибровочные графики, для построения которых измеряли интенсивность хемилюминесценции образцов содержащих добавленную перекись водорода известной концентрации. Исходную концентрацию Ы202 используемую для калибровки определяли спектрофотометрически при длине волны 240 нм с коэффициентом молярного поглощения 43,6 (М"1 х см"). Образцы помещали в полипропиленовые флаконы (Beckman, США) и добавляли по 1 мл "счетного раствора" содержащего: 1сМ Трис-HCl буфер рН 8,5, 50 мкМр-йодфенол, 50 мкМ люминол, 10 нМ пероксидазы хреиа при определении наномолярных концентраций Н2О2. "Счетный раствор" готовился непосредственно перед измерением. Чувствительность метода позволяет опеределять Н2О2 в концентрации 1нМ. При определении концентрации НгОг использовались значения измерений не менее трех образцов, по которым определяли среднее значение и среднеквадратичное отклонение. 4.2.6. Определение количества урацила образовавшегося в ДИК при действии тепла Раствор ДНК (300 мкг/мл, в 1 мМ фосфатном буфере) с добавлениями нуклеозидов в концентрации 1мМ и/или уранил ацетата в закрытых полипропиленовых флаконах (Beckman, США) прогревали в течение 24 ч при температуре 80С в термостате U 10 (Prufgemte-Werk Medingen, Германия), После прогрева раствор концентрировали на роторном вакуумном испарителе RVO - 64 (Чехословакия) до 1 мл (в 5 раз) и очищали ДНК от продуктов тепловой депуринизации и депирвмидинизации на хроматографической колонке (0,01 х 0,76 м) с сефадексом LH-20, Колонку элюировали бидистиллироваииой водой (далее - "вода") (1 мл/мин). Очищенную ДНК концентрировали до 1 мл и инкубировали с 1 единицей урацил-ДНК-гликозилазы [Lmdahl et al., 1977] в течение 14 ч при температуре 37С. Выщепленый урацил, выделяли на хроматографической колонке (0.01 х 0,76 м) с сефадексом LH-20 и регистрировали спектрофотометрически с помощью УФ-детектора 308 (Венгрия) при длине волны 259 нм. Фракцию урацила концентрировали до 1 мл и определяли концентрацию урацила на спектрофотометре Uvikon 923 В (Kontron Instruments, Италия), Коэффициент молярного поглощения при длине волны 259,5 нм считали равным 8200 (М"1 х см"1).
При воздействии кислородом или азотом, раствор насыщали в стеклянных безкалиевых флаконах для жидкостного сцинтилляционного счета путем интенсивного барботирования в течение 30 мин при скорости подачи газа, определяемой ротаметром УЗ (Россия), не менее 2 л/мин. Барботирование раствора не приводило к изменению концентрации ДНК. Концентрация растворенного кислорода, измеренная электродом Кларка при 20С5 составляла, в среднем, в фосфатном буфере (1 мМ, рН 6,8), уравновешенном воздухом-0,28 мМ; при дополнительном насыщении раствора кислородом - 0,59 мМ, азотом - 0,14 мМ.
Осуществляли с помощью реакции с кумарин-3-карбоновой кислотой (ККК), продукт гидроксилирования которой - 7-гидроксикумарин-З-карбоновая кислота (7-ОН-ККК) -является удобным флуоресцентным зондом для определения образования этих радикалов [Черников, Брусков, 2002]. В раствор ККК в воде (0,5 мМ, рН 3,6) вносили 0,2 М фосфатного буфера (рН 6,8), далее добавляли нуклеозиды (1мМ). Опытные образцы (и контроль) подвергали воздействию рентгеновского излучения или прогревали в полипропиленовых флаконах в термостате U10 (Германия) при температуре 80С ± ОД С в течение 2 часов. Флуоресценцию продукта реакции ККК с гидроксильным радикалом - 7-ОН-ККК, измеряли на спектрофлуориметре SFM 25А (Kontron Instruments, Италия) с А х = 400 нм, Xtm = 450 шм. Калибровку производили с помощью коммерческой 7-ОН-ККК.
ДТНБ растворяли в 1 мМ фосфатном буфере в концентрации 50 мкМ, хранили в холодильнике и использовали в течение двух дней. Нуклеозиды растворяли в растворе ДТНБ непосредственно перед началом эксперимента. Раствор прогревали в полипропиленовых флаконах с плотно завинчивающимися крышками (Beckman, США) в ультратермостате U10 при температуре 60С, 30 мин. В течение 40 мин после окончания воздействия пробы фотометрировали на спектрофотометре Uvikon 923 В (Kontron Instruments S.p.a., Италия) в стандартных кюветах, определяя поглощение при 412 нм. Концентрацию ТНБ (5-тио-2-нитробензоЙная кислота) - восстановленной формы ДТНБ - в пробах рассчитывали, полагая коэффициент молярного поглощения равным 12 000 М-1 х см"1 при 412 нм [Clancy et al., 1990].