Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 8
NMDA-каналы 9
Структура 9
Принципы работы NMDA-каналов 16
Блокаторы nmda-каналов 22
Модуляция активности nmda-каналов 26
Блокаторы как инструменты исследования ионных каналов 28
Математическое моделирование действия блокаторов открытых nmda-каналов 31
Местные анестетики 44
Физико-химические свойства ма 44
Действие ма на na -каналы 44
Теории взаимодействия ма с na-каналами 47
Связь структуры ма и их блокирующей активности, 48
Действие мана nmda-каналы. 52
Материалы и методы 53
Выделение пирамидных нейронов гиппокампа 53
Растворы 53
Экспериментальная установка 53
Регистрация токов 54
Обработка данных и математическое моделирование. 55
Результаты исследований 57
Активация nmda-каналов 57
Блокада NMDA-каналов МА 58
Новокаин 59
Новокаинамид 74
Тетракаин 82
Бензокаин. 91
Лидокаин 100
Qx-314 109
Этидокаин 119
L30 127
Обсуждение результатов 131
Блокада nmda-каналов ма 131
Сравнительный анализ блокады NA+- и NMDA-каналов 155
Выводы 161
Благодарности 162
Список литературы
- Принципы работы NMDA-каналов
- Блокаторы как инструменты исследования ионных каналов
- Экспериментальная установка
- Блокада NMDA-каналов МА
Введение к работе
Актуальность проблемы. В большинстве синапсов центральной нервной системы млекопитающих и человека передача возбуждающего сигнала осуществляется с помощью медиатора - глутамата Ионотропные рецепторы глутамата подразделяются на NMDA- (N-метилЛЭ-аспартат), АМРА- (а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-кзоксазол пропионат) и каинатный подтипы. Среди семейства глутаматных рецепторов NMDA-подтип отличается потенциалзависимой блокадой ионами Mg1* (Mayer et al, 1984; Nowak et al., 1984; Ascher and Nowak; 1988), медленной кинетикой активации, неполной десенситюацией (Johnson and Ascher, 1987; Lester et al., 1990), относительно высокой проницаемостью для ионов CaJ* (MacDermott et al., 1986). Эти и другие свойства NMDA-каналов лежат в основе формирования нервной системы на эмбриональной стадии, памяти и способности к обучению (Bliss and Coffingridge, 1993; Asztety and Gustafsson, 1996; Kuflmam et al., 2000), a также патогенеза болезней Паркиясона, Альцгеймера, ишемической болезни мозга, эпилепсии и др. (Doble, 1999; Anmdine and Tyiraanski, 2004; Hynd et al., 2004; Rho, 2004).
Существенный прогресс, достигнутый за последнее время в развитии методов молекулярной биологии и биохимии, позволил установить субъединичный состав, первичную структуру, трансмембранную топологию полипептидной цепи и.т.я. (см. обзоры Dingledine et al., 1999; Mayer and Armstrong, 2004; Wollmuth and Sobolevsky, 2004). Однако представления о трехмерном строении NMDA-каналов и механизме их активации остаются до сих пор неудовлетворительными.
Опыт исследований блокады ионных каналов различными соединениями показал, что результаты таких работ являются ценным источником информации о самих каналах (Mile, 2001). На протяжении ряда лет этот подход используется в работах нашего коллектива для изучения свойств NMDA-каналов (Кошелев и Ходоров, 1992, 1995; Sobolevsky et al, 1999). Настоящая работа является продолжением проводимых в лаборатории исследований В качестве новых инструментов изучения биофизических свойств и функциональной архитектуры NMDA-каналов в ней использованы местные анестетики и их производные (МА) В отличие от ранее применявшихся блокаторов, большинство МА содержит три функциональные группировки: ароматическое кольцо, третичную аминогруппу и полярную (аммдную или эфирную) связь. рК, аминогруппы этих соединений лежит в диапазоне 8.1+9 4 (Strichartz et al., 1990), поэтому при физиологических рН МА находятся преимущественно в заряженной форме. Такое строение МА обусловливает их амфифильные свойства.
^ВЇ*0,,АЛЬНА*І
С Пі 09
4 Цель работы: экспериментальный и теоретический анализ механизмов действия местных анестетиков и их производных на NMDA-каналы пирамидных нейронов гиппокампа крысы.
Задачи исследование
-
В опытах на свежеизолированных нейронах зоны СА1 гиппокампа крысы с помощью метода "пэтч-кламп" (patch-clamp) в конфигурации "целая клетка" изучить зависимость действия МА от- (а) их концентрации и длительности действия; (б) концентрации агониста; (в) мембранного потенциала, (г) состояния воротного механизма канала.
-
На основании полученных данных выяснить, является ли уменьшение амплитуды тока через NMDA-каналы в присутствии МА результатом закупорки ионной поры канала или следствием аллостерического влияния на работу воротного механизма.
-
С помощью модели Вудхулл оценить в долях мембранного потенциала глубину расположения связывающих участков МА в NMDA-канале.
-
Используя математическое моделирование ионных токов через NMDA-каналы, определить влияние МА на работу воротного механизма NMDA-канала.
-
С помощью сравнительного анализа сродства различных МА к NMDA-каналу оценить вклад функциональных группировок этих соединений в связывание
-
Используя собственные и литературные данные, провести сравнительный анализ блокады Na*- и NMDA-каналов МА.
ШПНОТ новизна;
Впервые проведено систематическое изучение действия пяти местных анестетиков (новокаин (НОВ), бензокаин (БЕНЗ), тетракаин (ТЕТР), лидокаин (ЛИД), этидокаин (ЭТ)) и трех их производных (новокаинамид (НОВА), QX-314 и L30) на ионные токи через NMDA-каналы механически изолированных пирамидных нейронов гиппокампа крысы
Изучена зависимость блокады NMDA-каналов этими соединениями от их концентрации, концентрации агониста и мембранного потенциала.
Показано, что подавление ионных токов через NMDA-каналы протежируемыми МА и постоянно заряженным QX-314 является результатом закупорки ионной поры канала Оценена глубина проникновения в канал протонируемой аминогруппы третичных МА и постоянно заряженной аммониевой группы четвертичного QX-314 Наряду с этим показано существование потенциал-независимого механизма блокады у МА ксилидинового ряда.
Изучена кинетика взаимодействия МА с NMDA-каналами и проанализированы структурные факторы, определяющие ее.
» Л1"'
Проанализировано влияние блокады ионной поры NMDA-канала МА на работу воротного механизма
Проведен систематический анализ связи эффективности блокады NMDA-каналов МА с их структурой Оценен вклад заряженных, полярных и гидрофобных группировок во взаимодействие МА с NMDA-каналами
Научно-практическая ценность. Блокаторы NMDA-каналов считаются перспективными терапевтическими агентами для лечения нейродегенеративных заболеваний, однако введение этих средств в медицинскую практику на текущий момент существенно ограничивается серьезными осложнениями, которые вызывают многое из них Анализ этих явлений показывает, что безопасность применения блокаторов NMDA-каналов зависит от их аффинности, кинетики блокады и взаимодействия с воротным механизмом канала (Rogawski, 2000) Поэтому выявленные в данной работе закономерности блокирующего действия МА на NMDA-каналы и их связь со структурой этих соединений могут быть использованы в дальнейшем для направленного синтеза новых лекарственных препаратов, мишенью действия которых являются NMDA-каналы
Практическая значимость исследования действия МА на NMDA-каналы определяется широким применением этих соединений в медицине для местной, спинальной и других видов анестезии При этом с побочным действием МА на NMDA-каналы могут быть ассоциированы как положительные (предотвращение сенситизации болевой чувствительности), так и отрицательные (характерные для многих блокаторов NMDA-каналов) эффекты применения анестетиков Полученная информация о действии МА на NMDA-каналы может быть использована в дальнейшем для анализа этих явлений и создании усовершенствованных средств для контроля над болевой чувствительностью
Апробации работы Материалы диссертации доложены на Ш Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2004), XLIV и XL VII научных конференциях МФТИ (Долгопрудный, 2001 и 2004), международных семинарах, организованных физиологическим обществом Великобритании (Лидс, 2002; Санкт-Петербург, 2004; Севилья, 2005), VIII Международном далемском симпозиуме по клеточному узнаванию сигналов и их передаче (Берлин, 2003), 32 ежегодной конференции Американского общества по нейронаукам (Орландо, 2002).
Публикации По материалам диссертации опубликовано 7 работ
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения и пяти глав. Работа изложена на 183 страницах, проиллюстрирована 64 рисунками и содержит шесть таблиц. Библиографический список содержит 291 источник
Принципы работы NMDA-каналов
Работу NMDA-канал-рецепторного комплекса можно описать с помощью следующей упрощенной кинетической модели: модель 1 12 2!2 АА и АА (Lester and Jahr, 1992). Где С - закрытое состояние, Сд, Сдд - закрытые состояния, связанные с одной и двумя молекулами агониста, соответственно; 0 дд - открытое состояние, DAA - десенситизированное. Только открытое состояние является проводящим, что отмечено звездочкой. [А] — концентрация агониста.
Активации. Процесс перехода рецепторуправляемых ионных каналов в проводящее состояние включает в себя связывание с агонистом и коагонистом (в случае NMDA-каналов) и открывание канала. Активация NMDA-подтипа глутаматных каналов имеет ряд характерных особенностей, свойственных только данному подтипу каналов, В отличие от других типов глутаматных каналов, NMDA-каналы активируются только при одновременном воздействии агониста и коагониста. Для активации NMDA-каналов необходимо одновременное связывание двух молекул агониста и двух молекул коагониста (Benveniste et al, 1990а).
Как и другие подтипы глутаматных рецепторов NMDA-канальт могут быть активированы 1-глутаминовой кислотой (глутамат). Однако обращает на себя внимание высокая аффинность глутамата к данному подтипу каналов: полунасыщающая концентрация (ECso) для NMDA-рецепторов лежит на три-четыре порядка ниже ECso для не-NMDA-подтипов глутаматных каналов и составляет порядка 1мкМ (Dingledine et al., 1999). Предполагается, что разная аффинность глутамата к NMDA- и не-NMDA-подтипам рецепторов имеет важное физиологическое значение. Поскольку АМРА- и NMDA-каналы часто находятся вместе в одном синапсе, быстрая активация АМРА-подтипа обуславливает быструю деполяризацию в ответ на выделение медиатора пресинаптическим окончанием. Это, в свою очередь, помогает снять блокаду NMDA-каналов ионами Mjf и, таким образом, ускоряет активацию более медленных NMDA-каналов (Dingledine et al., 1999).
Специфическими агонистами, способными избирательно активировать только данный подтип рецепторов, являются 1-аспарагиновая кислота (Asp) и №метилч!-аспартат (NMDA).
ECso для них составляет 16.9 мкМ и 34.9 мкМ, соответственно (Patneu and Mayer, 1990). Роль коагонистов для NMDA-каналов играют глицин и сходные с ним аминокислоты - d-аланин, 1-аланин, гомосерин (в порядке возрастания ЕС50) (Benveniste et al, 1990а). Время жизни комплекса NMDA-рецептор-лиганд составляет около 10-50 мсек, что на два порядка больше, чем у каинатных и АМРА-рецепторов.
Кинетический анализ показывает, что закрытое, агонистсвязанное состояние NMDA-рецепторов является метастабильным, с относительно медленной скоростью перехода в открытое и десенситизированное состояние. Вероятность открывания оценивается как 0.04-0.50 (Dingledine et al., 1999). Время жизни данного подтипа каналов в открытом состоянии находится в диапазоне от 0.05 до 3.6 мсек. Распределение времени открытого состояния содержит 3 компоненты (от 87 мкс до 4.72 мс), закрытого — 5 компонент (от 21 мкс до 2.1 мс), продолжительность пачки открываний 4 компоненты (от 76 мкс до 7.69 мс), кластеров пачек открываний - 3 компоненты (около 16 мс), суперкластеров - 3 компоненты (около 90 мс) (Gibb and Colquhoun, 1992).
Недавно была исследована кинетика активации рекомбинантных NR1/NR2B рецепторов (Banke and Traynelis, 2003). В этой работе было выделено 5 компонент закрытого состояния с постоянными времени 0.1 мс, 0.89 мс, 15.2 мс, 69.6 мс, 1.1 с. Две компоненты с наибольшими постоянными времени были отнесены к десенситизации канал-рецепторпого комплекса. Компоненты с постоянными времени 0.89 мс и 15.2 мс приписаны переходам канала между различными закрытыми состояниями, связанными с агонистом. И, наконец, самая быстрая компонента была связана с открыванием канала. Авторам удалось показать, что время жизни короткоживушего закрытого агонистсвязанного состояния зависит от применяемого коагониста, а время жизни долгоживущего - от агониста. Таким образом, впервые было показано, что в процессе активации NMDA-канала NR1 и NR2 субъединицы претерпевают конформационные изменения независимо друг от друга и идентифицированы этапы активации NMDA-канала, связанные с конформационными изменениями в каждой из этих субъединиц.
Кристаллизация агонистс вязы вающего домена GluR2 субъединицы АМРА-рецепторов без агониста и в комплексе с агонистами или конкурентными антагонистами позволила понять первый этап трансформации связывания агониста и коагониста в открывание глутаматных каналов (Armstrong and Gouaox, 2000). Было показано, что в отсутствие агониста «клешня», образуемая S1 и S2 долями агонистсвязывающего домена, открыта. Связывание агониста приводит к закрыванию «клешни». В этой же работе было продемонстрировано, что агонистсвязывающие домены GluR2 формируют димеры. Образование димеров происходит исключительно за счет контакта S1 долей друг с другом. При этом расщелины между S1 и S2 долями агонистсвязывающих доменов направлены наружу, фрагменты полипептидной цепи,
связывающие SI и S2 доли с трансмембранными сегментами, расположены по одну сторону от димера и с противоположной стороны от аминоконцевого домена. Таким образом, схлопывание S1 и S2 долей приводит к расхождению в стороны концов полипептидной цепи, соединяющих лигандсвязывающий домен с трансмембранными сегментами. Это вызывает растяжение внеклеточных концов трансмембранных сегментов в стороны и приводит к открыванию канала (Armstrong and Gouaox, 2000).
Вслед за GluR2 в 2003 г. были получены кристаллические структуры комплексов агонистсвязывающего домена NR1 субъединицы с глицином и конкурентными антагонистами (Furukawa and Gouaux, 2003). Так же как и агонистсвязывающий домен GluR2, агонистсвязывающий домен NRI состоит из двух долей S1 и S2. Участок связывания глицина находится в щели между ними. В комплексе с глицином щель домена находится в закрытом состоянии (Furukawa and Gouaux, 2003). Однако, в своих экспериментах Furukawa and Gouaux (2003) не наблюдали димеризации агонистсвязывающих доменов NR1. Тем не менее, механизм активации NMDA-каналов может быть сходным с таковым у АМРА-каналов, а отсутствие димеризации глицинсвязывающих доменов в экспериментах Furukawa and Gouaux (2003) может быть обусловлено необходимостью N-концевого домена для димеризации NR1 субъединиц (Meddows et al., 2001). Кроме того, сообщается о димеризации агонистсвязывающего домена, полученного из более длинных фрагментов полипептидной цепи NR1 субъединиц (Ivanovic et al., 1998).
Следующим молекулярным звеном в трансформации связывания агониста в открывание глутаматных каналов является высоко консервативная аминокислотная последовательность SYTANLAAF (Kohda et al., 2000; Jones et al., 2002). Эта последовательность находится в С-конце третьего трансмембранного сегмента - идеальное положение для передачи информации о связывании агониста ионной поре канала. Замена аланина на треонин в 654 положении (Lurcher mutation) в 52, АМРА- и каинатных субъединицах приводила к формированию постоянно открытых каналов (Zuo et al., 1997; Kohda et al., 2000). И хотя эквивалентная мутация в NMDA-субъединицах не приводит к образованию постоянно открытых каналов (Kohda et al., 2000), мутации некоторых соседних аминокислот в пределах этого фрагмента имеют такое действие (Kashiwagi et al., 2002). С помощью замены аминокислотных остатков этой последовательности в NMDA-субъединицах на остатки цистеина было показано перемещение этого фрагмента при связывании агониста (Jones et al., 2002). Кроме того, показано, что мутации SYTANLAAF последовательности оказывают сильное влияние на чувствительность NMDA-каналов к ингибированию протонами, что косвенно свидетельствует об участии этого фрагмента в активации каналов (Low et al., 2003).
Блокаторы как инструменты исследования ионных каналов
В условиях существующих ограничений современных физико-химических методов исследование блокады ионных каналов органическими соединениями оказалось эффективным подходом к изучению функциональной архитектуры ионных каналов. В 1952 г, Hodgkin and Huxley предсказали, что натриевая и калиевая проводимость нейрональной мембраны связаны с различными структурами. Экспериментально это удалось доказать только после открытия специфических блокаторов натриевых (тетродо- и сакситоксин, Narahashi et al., 1964; Narahashi et al., 1967) и калиевых (тетраэтиламмоний (ТЭА), Hille, 1967) каналов. В дальнейшем соединения, избирательно блокирующие ионные каналы, широко использовалось для разделения компонент электрической активности нейрональной мембраны и изучения, таким образом, отдельных типов каналов.
Изучение блокады К+-каналов ТЭА дало наиболее убедительное доказательство того, что каналы по строению являются порами, а не переносчиками (Armstrong, 1971). В этой работе было показано, что гиперполяризация клеточной мембраны и увеличение внеклеточной концентрации ионов К+ ускоряет деблокирование калиевых каналов ТЭА, что свидетельствует о том, что К+-каналы является порами.
С помощью блокаторов была оценена плотность каналов на единицу площади мембраны. Moore et al., 1967, первыми применили для этого радиоактивно меченные тетродо- и сакситоксин. Плотность натриевых каналов, оцененная в этих и других экспериментах, оказалась 10-з-Ю 000 мкм"2 в зависимости от вида ткани (НШе, 2001).
Применение проникающих и блокирующих соединений позволило определить размеры наружного и внутреннего вестибюлей различных типов каналов, селективного фильтра. Таким образом, было установлено, что диаметр селективного фильтра К+-каналов 1.7 А (НШе, 1973), Са2+ -каналов - 6 A (McCleskey and Aimers, 1985), размер фильтра Ка+-каналов - 3.1 5.1 А (НШе, 1971; 1972), ацетилхолиновых рецепторов - 6.5 6.5 A (Dwyer et al., 1980), глутаматных рецепторов NMDA-подтипа -5.5 A (Zarei and Dani, 1995; VUlarroel et al,, 1995; Wollmuth et al., 1996), He-NMDA-подтипа - 7.5 A (Burnashev et al., 1996). Диаметр вне- и внутриклеточного вестибюлей К+-канала приблизительно равен диаметру молекулы ТЭА (8 A, Arm, 1971; Arm and Hille, 1972). Геометрические размеры NMDA-каналов, оцененные с помощью блокаторов, уже были приведены ранее.
Исследование блокады ионных каналов позволило установить природу и локализацию их воротного механизма. В частности, на основе наблюдения инактивации токов через К -каналы в присутствии производных ТЭА было предложено, что инактивационные ворота представляют собой частицу, которая может входить в ионную пору и перекрывать проход для проникающих ионов (Armstromg, 1971). Эта гипотеза в дальнейшем получила подтверждение в экспериментах с использованием смеси протеолитических ферментов Streptomyces griseus (проназы) (Armstrong et al., 1973). Добавление проназы в цитоплазму гигантского аксона кальмара избирательно устраняло инактивацию Na+OKOB. Это доказало, что (1) инактивационные ворота - это подвижный белок, прикрепленный к внутриклеточной стороне Na -канала, (2) активационные и инактивационные ворота канала - это две разные структуры. Позже Hoshi et al. (1990), Zagotta et al. (1990) показали, что, действительно, инактивационная частица представляет собой олигопептид, состоящий из 20 аминокислотных остатков N-конца поли пептидной цепи субъединиц Na -каналов, и, прикрепленный к каналу посредством следующих 60 аминокислотных остатков.
При исследовании блокады К -каналов производными ТЭА было установлено, что блокирующий участок находится во внутриклеточном вестибюле, причем большую часть времени доступ к нему перекрыт активационными воротами (Armstrong, 1966; 1969). В аналогичных экспериментах с местными анестетиками, панкурониумом и тиазиновыми красителями также была установлена внутриклеточная локализация активационных ворот Na+-канала (Strichartz, 1973; Yeh and Narahashi, 1977;Cahalan, 1978).
Изучение влияния блокады тетраалкиламмониевыми соединениями на работу воротного механизма NMDA-каналов позволило установить, что тетрабутиламмоний препятствует десенситизации канала, однако полностью не запрещает его закрывание. В отличие от блокады тетрабутиламмонием, блокада тетрапентиламм опием не позволяет каналу закрыться и десенситизироваться. Существование двух блокаторов, один из которых полностью препятствует только десенситизации, а второй — как десенситизации, так и закрыванию канала, показывает, что активационные и десенситизационные ворота NMDA-канала являются различными структурами (Кошелев С.Г. и Ходоров Б.И., 1995, Соболевский, 1999; Sobolevsky A.I. et al., 1999; Соболевский и Ходоров, 2000).
Применение дикатионных производных аминоадамантана (IEM-1460, 1593, 1594, 1754 и др.) и фенил цикл огексана (IEM-1925 и др.) с переменной длиной промежуточной алкильной цепи позволило установить, что участок связывания блокатора в NMDA- и АМРА-канале состоит из гидрофобной и нуклеофильной частей, причем в NMDA-каналах обе части прилегают друг к другу, а в АМРА-каналах гидрофобный и нуклеофильный участки находятся на расстоянии = 10 A (Bolshakov et а]., 2000).
С помощью исследования блокады NMDA-каналов дикатионными производными адамантана: IEM-1754 и 1860 - было установлено существование и положение участков связывания проникающих моновалентных ионов (Antonov et al., 1998). Авторы показали, что скорость блокирования 1ЕМ-соединениями уменьшается при увеличении концентрации Na в наружной среде и Cs+ во внутренней среде, а скорость деблокирования уменьшается при увеличении концентрации Na+ в наружной среде. Эффект наружных ионов не зависел от мембранного потенциала. В отличие от этого, эффект внутренних ионов уменьшался вплоть до полного исчезновения при понижении мембранного потенциала. Это показывает, что в наружном вестибюле канала существует(ют) участок(ки) связывания проникающих ионов, причем количественный анализ данных позволил установить, что этот участок связывания находится за пределами мембранного поля. Если он занят, блокатор не может ни попасть в канал, ни покинуть его. Математическое моделирование показало, что экспериментальные данные лучше всего описываются в предположении, что таких участков два для наружных проникающих ионов и один - для внутренних. В этой же работе было показано, что увеличение концентрации внутриклеточных ионов Cs+ потенциал-независимым образом уменьшает скорость перемещения IEM-1754 с поверхностного на глубокий участок связывания. Эти данные указывают на то, что во внутриклеточном вестибюле существует еще один участок связывания проникающих катионов, за который конкурируют аминогруппа 1ЕМ-1754 и внутриклеточные ионы.
Экспериментальная установка
Для исследований отбирались крысы линии Wistar в возрасте 14-21 день. Животное декапитировалось, кости черепа удалялись, производился вертикальный разрез полушария, проходящий через гиппокамп. Далее вручную получали поперечные срезы гиппокампа толщиной около 300-500мкм. Срезы быстро помещали в инкубационную камеру, заполненную предварительно насыщенным карбогеном (9б%Ог и 4%СОг) инкубационным раствором. Инкубация производилась 3-4 часа при температуре 32С в условиях постоянного перемешивания раствора и продува карбогеном. Далее срезы переносились в экспериментальную камеру, заполненную «внешним» раствором. Изоляция отдельных нейронов осуществлялась из зоны СА1 гиппокампа методом «вибродиссоциации» по Воробьеву (Vorobjev, 1991). Отбор клеток для экспериментов производился по визуальным критериям: жизнеспособные клетки имели гладкую, контрастную поверхность; погибающие нейроны теряли контрастность, равномерность окраски, наблюдалась грануляция внутриклеточного содержимого. В начале регистрации контроль качества клеток производился с помощью кратковременного скачкообразного изменения потенциала на мембране клетки до -40 мВ. Живые клетки отвечали на деполяризацию мембраны кратковременной генерацией токов амплитудой порядка 1-3 нА.
Раствор для инкубации имел следующий состав (в мМ): NaCI 124, К.С1 3, СаСЬ 2, глюкоза 10, ЫаНСОз 26. Экспериментальная камера заполнялась «внешним» раствором (в мМ) NaCI 140, KCI 5, СаСЬ 2, глюкоза 15, HEPES 10, глицин ЗцМ, рН7.3. Растворы аспартата, а также аспартата с блокаторами готовились путем добавления к внешнему раствору соответствующих количеств концентрированных (не менее чем в 30 раз) водных растворов данных веществ. Раствор для заполнения пипеток имел следующий состав (в мМ): CsF 140, NaCI 4, HEPES 10; рН7.2.
Экспериментальная камера представляла собой чашку Петри диаметром 40 мм, закрепленную на предметном столике микроскопа (Leitz Diavert, Germany). Командный и регистрирующий электроды представляли собой серебряную проволоку диаметром 0.2 мм. Регистрирующий электрод находился внутри стеклянной микропипетки, заполненной раствором электролита специального состава. Командный электрод соединялся с раствором в экспериментальной камере при помощи солевого мостика - стеклянной трубки, заполненной 3 мМ раствором КС1. Микропипетки из боросиликатного стекла (ругех) изготовлялись на микрокузнице МЭ-4 (Россия) и имели сопротивление 3-8 МОм. Раствор для заполнения микропипеток фильтровался (диаметр пор 0.2 мкм). Заполнение микропипеток электролитом осуществлялось с помощью тонкого полого волоска. Микропипетка закреплялась в держателе, расположенном на трехкоординатном манипуляторе (Narashige МО-102, Japan). Сигнал с электрода поступал на первичный усилитель. Принципиальная схема первичного усилителя представлена в работе Hamill et al. (1981), сопротивление обратной связи 1 ГОм. С первичного усилителя сигнал поступал на блок аналоговой обработки, где он усиливался и проходил фильтр Бесселя четвертого порядка с fc = 1 кГц. Далее сигнал поступал параллельно на осциллограф (Nihon Kohden, Япония) и на вход компьютерной платы АЦП (ADC 12 SQ), где о» преобразовывался в цифровой вид. Токи оцифровывались с частотой 1 кГц. Оцифрованный сигнал записывался в память компьютера в виде файлов. Напряжение, определяющее мембранный потенциал, подавалось на командный электрод с ЦАП, находящегося на той же плате, что и АЦП.
Подача растворов к клетке осуществлялась с помощью системы быстрой аппликации, изготовленной в нашей лаборатории (С.Кошелев и А.Соболевский). Постоянная времени смены растворов данной системы 5-30 мс (Соболевский, 1999). Управление системой быстрой аппликации осуществлялось через интерфейс платы ЦАП. Удаление избытка раствора из экспериментальной камеры осуществлялось с помощью системы забора, состоящей из соединяющих трубок, собирающей емкости и компрессора.
Запись, управление системой аппликации и электрической стимуляции осуществлялось с помощью программы smex-1, написанной в нашей лаборатории (С. Кошелев).
Регистрация токов осуществлялась методом «пэтч-кламп» в конфигурации «целая клетка». При этом регистрируются токи, протекающие через всю поверхность клетки в условиях фиксации мембранного потенциала. Метод основан на образовании плотного контакта между кончиком пипетки и клеточной мембраной, который создает изоляцию участка мембраны, находящегося под пипеткой, от окружающей среды. Далее мембрана под пипеткой прорывается и таким образом устанавливается электрический контакт между внутриклеточной средой и раствором электролита микропипетки. Трансмембранные токи фиксируются с помощью усилителя обратной связи, соединенного с раствором электролита в пипетке (рис. 9).
Для этого проделывались следующие манипуляции. Для предотвращения засорения кончика пипетки посторонними объектами, в микропипетке предварительно создавалось положительное давление 30-50 мм рт. ст. После этого она погружалась в раствор. Производилась компенсация контактной разности потенциалов. Далее микропипетка подводилась к клетке. Вблизи клетки давление в микропипетке изменяли на отрицательное (-30 + -40 мм рт.ст.), в результате чего клетка присасывалась к микропипетке. На командный электрод подавался потенциал -100 мВ. О прорыве клеточной мембраны можно было судить по кратковременной генерации Ыа+-токов большой амплитуды в ответ на деполяризующий импульс. Качество гигаомного контакта считалось удовлетворительным, если ток утечки не превышал 200 пА. Клетку на микропипетке подводили к системе аппликации. После чего запускалась программа, управляющая ходом эксперимента.
Регистрация токов проводилась при комнатной температуре. Потенциал на мембране и рН омывающего раствора, за исключением специально оговоренных случаев, составляли -100 мВ и 7.3, соответственно.
Измерение значений тока и усреднение экспериментальных кривых осуществлялась с помощью компьютерной программы, написанной в нашей лаборатории (С.Кошелев). Статистический анализ данных проводился с помощью компьютерной программы Microcal Origin 6.0 (Microcal Software, Inc, USA). Экспериментальные данные представлены как х + Ах, где х - среднее значение измеренной величины, Ах - стандартное отклонение. Исследование статистической значимости различия между средними проводилось с помощью однофакторного дисперсионного анализа (one-way ANOVA). Величина уровня значимости была принята равной р = 0.05.
Блокада NMDA-каналов МА
Различие между величинами подавления пикового тока при втором и третьем импульсе Асп с НовА не было статистически значимым (р = 0.30). Величина тока в конце первого применения Асп с НовА составляла 12.4+1.2% от уровня контроля (n = 7). При втором и третьем импульсе амплитуда стационарного тока совпадала и была равна 9.2±1.0% от уровня в контроле. Различие между степенью подавления тока в конце первого и второго импульсов Асп с НовА было близким к уровню значимости (р = 0.06).
Три последних записи на рис. 23а иллюстрируют токовые ответы на стимуляцию Асп после сочетанного применения Асп с НовА. Во время первого и второго применения Асп амплитуда пикового и стационарного тока возрастала, но оставалась ниже амплитуды тока в контроле. Полное восстановление амплитуды происходило только во время третьего применения Асп.
На рис 236 отложены средние значения степени подавления пика и плато тока в зависимости от номера стимула при Е[, = -100мВ и -60 мВ. Как видно из графика, при Еь = -60мВ степень подавления пика и плато тока была меньше. Несмотря на это, действие НовА также как и при Еь = -100мВ имело кумулятивный характер.
Зависимость блокады NMDA-каналов НовА от мембранного потенциала. На рис. 24а и б представлены образцы токовых кривых, зарегистрированных в ответ на индивидуальное применение Асп и в сочетании с 0.3 мМ НовА, при различных мембранных потенциалах в диапазоне от -100 до +40 мВ. При сдвиге мембранного потенциала в положительную сторону подавление NMDA-тока НовА ослаблялось вплоть до практически полного его исчезновения при +40 мВ. Т.к. рКа НовА 9.42 (Strichartz et al., 1990), то при рН 7.3, при котором проводились эксперименты, 99% молекул НовА находилось в протонированной форме. Ослабление блокады НовА при сдвиге мембранного потенциала в положительную сторону свидетельствует о том, что механизмом блокады этого МА является закупорка ионной поры канала.
На графике рис. 24е отложены средние значения степени подавления тока при различных мембранных потенциалах. Зависимость блокады НовА от потенциала была аппроксимирована уравнением 3 (сплошная линия). Значения параметров ICso(O) и 8 в уравнении 3 составили 2.3+0.4 мМ и 0.90+0.05, соответственно (n = б).
Кинетика взаимодействии НовА с NMDA-каналами в присутствии Асп. Спад и восстановление тока в ответ на добавление и удаление 0.2 мМ НовА из омывающего раствора в течение действия Асп был монотонным (рис. 25). Кинетика блокирования и деблокирования имела биэкспоненциальный характер. Амплитуда быстрого компонента спада и восстановления тока составила 0.56+0.05 и 0.25±0.3, соответственно. Постоянные времени блокирования тока -56±5 мс и 0.86±0.9 с; постоянные времени восстановления тока 87±19 мс и 1.6+0.2 с.
Зависимость действия НовА от мембранного потенциала, а - образцы токовых кривых, зарегистрированных в ответ на стимуляцию Асп при различных мембранных потенциалах в диапазоне от -100 до +40 мВ. б - токовые кривые, зарегистрированные при сочетанном применении Асп и 0.3 мМ НовА после насыщения кумулятивной блокады при тех же мембранных потенциалах, что и в а. в - средние значения степени подавления тока, 1в/1с, при различных мембранных потенциалах (п=6).
NMDA-токи в условиях постоянного присутствия НовА в растворе. Для изучения этого вопроса использовался экспериментальный протокол, примененный ранее для Нов. После контрольного воздействия Асп (рис. 266, первая токовая кривая) в омывающий клетку раствор было добавлено 50 мкМ НовА. Через 0.5-2 минуты NMDA-каналы были снова активированы Асп. Токи, зарегистрированные в этом эксперименте, сравнили с ранее полученными на той же клетке ответами при одновременном применении Асп и НовА в той же концентрации (рис. 26а). Как видно из рисунка, блокада НовА имела кумулятивный характер, независимо от того применялся ли он одновременно с агонистом или находился постоянно в омывающем клетку растворе. Это говорит о неспособности НовА взаимодействовать с NMDA-каналами в отсутствие агониста.
Независимость действия НовА от концентрации агониста. На рис. 27а показаны образцы токов, зарегистрированных в ответ на индивидуальное применение Асп в различных концентрациях (серые кривые) и в сочетании с 40 мкМ НовА (черные кривые). На рис. 276 показаны средние значения степени подавления стационарного тока (l-WIcs) при концентрациях Асп от 3.7 мкМ до 100 мкМ. Степень подавления стационарного тока не зависела от концентрации агониста (р = 0.13, п = 14), что позволяет исключить конкурентный механизм блокирования NMDA-каналов НовА.
Влияние блок-алы НовА на работу воротного механизма NMDA-каиала. Потенциалзависимость блокады НовА указывает на то, что ее механизмом является закупорка ионной поры. Какое действие оказывает блокада НовА на работу воротного механизма NMDA-канала? Кумулятивный характер блокады НовА (рис. 23) свидетельствует о том, что этот МА не мешает закрыванию канала и диссоциации комплекса канал-агонист. Независимость действия НовА от концентрации Асп (рис. 27) указывает на то, что блокада не препятствует десенситизации блокированных каналов (согласно критериям Sobolevsky et ah, 1999а, табл. 1). В соответствии с этим наилучшим образом для описания действия НовА подходит модель 6.
Однако отношение плато/пик в присутствии НовА, так же как и в присутствии Нов, даже после насыщения кумулятивной блокады было ниже, чем это предсказывается моделью 6 (Sobolevsky et al., 1999а). Как и в случае блокады Нов, уменьшение отношения плато/пик не может быть объяснено ни медленной кинетикой блокирования, ни усилением десенситизации блокированных каналов и требует привлечения предположения о дополнительном механизме подавления NMDA-токов, отличного от закупорки ионной поры канала молекулой блокатора.
Концентрационная зависимость блокады NMDA-каналов Тетр. На рис. 28а показаны токовые кривые, зарегистрированные в ответ на сочетанное применение Асп с Тетр в концентрации от 75 мкМ до 600 мкМ и наложенные на записи токов, полученных при контрольном применении одного Асп. Eh= -100 мВ. В присутствии Тетр амплитуда пикового и стационарного токов была ниже, чем в контроле. В отличие от действия предыдущих двух соединений, блокада Тетр сохранялась неизменной в ряду последовательных применений Асп с МА (данные не показаны). Подавление стационарного тока превосходило блокаду пикового тока. После одновременного удаления агониста и блокатора из омывающего раствора ток кратковременно возрастал до некоторой величины, превышающей стационарный уровень блокированного тока, после чего монотонно уменьшался до нуля (явление, называемое в англоязычной литературе «hook», рис. 28а, вставка). Однако кривая следового тока после сочетанного воздействия Асп и Тетр полностью лежит выше контроля, что указывает на то, что Тетр не вызывает задержку деактивации следового тока (рис. 28а, вставка).
На рис. 286 показаны усредненные значения подавления пикового и стационарного тока при различных концентрациях Тетр и аппроксимация концентрационной зависимости уравнением 2. Сдвиг кривой дозо-зависимости блокады пикового тока вправо относительно кривой для стационарного тока отражает более глубокую блокаду стационарного тока. Полублокирующие концентрации, IC50, определенные по пику и плато тока, составили 0.41±0.02мМ и 0.24±0.02 мМ, коэффициент Хилла 1.21±0.04 и 1.32±0.09, соответственно (п=16).
