Введение к работе
Актуальность проблемы. Возможность двухфотонного поглощения была теоретически предсказана еще в 30-е годы Марией Геп-перт-Майер. Ей было показано, что существует отличная от ігуля вероятность одновременного поглощения двух квантов, пропорциональ-ная произведению интенсивностей двух световых потоков, если поглощаются два кванта с разными энергиями (цветной эксперимент), или квадрату интенсивности, если приложена всего одна мода (одноцветный эксперимент) [Л1]. Поэтому при одинаковых мощностях поглощаемого излучения переход молекул в возбужденное состояние в результате однофотонного поглощения происходит в среднем через каждые 10" - 10" с, а в результате двухфотонного поглощения - не чаще чем в 10"3 с [Л2].
Первые эксперименты по регистрации двухфотонного поглощения в молекулярных системах были выполнены Кайзером и Гарретом уже в 1961 году, сразу же после создания лазеров. В их одноцветных экспериментах излучением рубинового лазера (^=694,3 нм) возбуждалась голубая люминесценция (^.=425 нм) кристалла фтористого кальция с примесью ионов европия (СаТгіЕи 2+) [ЛЗ]. Кванта красного света недостаточно для возбуждения голубой люминесценции и только при одновременном поглощении двух квантов требуемая энергия может быть получена:
Ш+Ш = Ег-ЕЕ где Ef - энергия верхнего возбужденного уровня, Eg - энергия основного уровня.
В последующих работах двухфотонное поглощение наблюдалось в некоторых органических кристаллах: пирене, антрацене, 3,4-бен-згшрене [Л4], бензойной и ацетилсалициловой кислотах [Л5], нафталине [Л6]; в органических жидкостях: бензоле [Л7] и антрацене [Л8].
В настоящей работе показано, что двухфотонное поглощение лазерного излучением видимого диапазона характерно для многих био-логическігх молекул - белков, нуклеиновых кислот и некоторых физиологически активных веществ. При этом специфика объектов ис-следоваїшя потребовала создания оригинальной конструкции лазерного двухфотонного спектрометра и методики измерения сечений двухфотонного поглощения биомолекул.
Двухфотонные эффекты начинают проявляться уже при плотностях мощности порядка 105 Вт/см2. Такие плотности достижимы в некоторых методах лазерной медицины, однако при этом двухфотонные эффекты не рассматриваются в качестве побочных результатов взаимодействия излучения с веществом. Учитывая тенденцию к росту мощности используемых в медицине источников лазерного излучения, изучение двухфотонного поглощения лазерного излучения биоорганическими молекулами актуально для составления общей картины биофизических процессов, определяющих специфику воздействия лазерного излучения на организм и объясняющих биологические эффекты и, вероятно, более отдаленные последствия.
С середины 90-х годов сфокусированное лазерное излучение эффективно используется в медицинской практике для двухфотонного возбуждения фармацевтических препаратов, вводимых в опухолевые ткани (фотодинамическая терапия) и селективного поражения бактерий Salmonella (ORNL's Biological and Environmental Research Program, USA).
Флуоресцентные метки с двухфотонным возбуждением могут составить основу сверхчувствительных аналитических методов. Нижний предел детектирования флуоресцентных меток при линейном возбуждении составляет 10 5 - 10 6 молекул в пробе, а при двухфотонном возбуждении - около 1000 молекул в пробе. При этом нижний предел понижается с ростом эффективности двухфотонно-возбуждаемой люминесценции метки.
Актуально развитие методов двухквантовой спектроскопии в направлении получения дополнительной информации о молекулярной структуре и процессах вігутри- и межмолекулярного переноса энергии возбуждения. Определенные перспективы могут быть связаны с предложенными в данной работе методами оценки эффективных размеров л-электронных облаков молекул и параметров нелинейности сложных органических и биологических молекул.
И наконец, поиск веществ с большими сечениями двухфотонного поглощения и эффективной двухфотонно-возбуждаемой люминесценцией (квадрофоры), в том числе, и среди биоорганических молекул, актуально для развития некоторых прикладных направлений нелинейной оптики: 1) разработки методов фотодинамической терапии раковых заболеваний с двухфотонным возбуждением фотосенсибилизаторов; 2) флуоресцентной конфокальной микроскопии с двухфотонным
возбуждением; 3) построения объемных изображений с помощью двухфотонно-возбуждаемой люминесценции; 4) создания объемных оптических носителей ішформации на фотохромних материалах с двухфотошюй записью и считыванием.
Цель н задачи исследования. Целью работы явилось изучение двухквантовых эффектов взаимодействия лазерного излучения с биологическими и органическими молекулами.
В связи с этим поставлены следующие задачи:
-
Разработать автоматизированный лазерный спектрометр для исследовашы спектров возбуждения и спектров двухфотонно-возбуж-даемой люминесценции биоорганических молекул.
-
Показать возможность существования двухфотонного поглощения лазерного излучения видимого диапазона различными типами биологических молекул и молекул биологически активных веществ.
3: Разработать метод измерения сечений двухфотонного поглощения биомолекул не зависящий от пространствеїшьіх и временных характеристик лазерного излучения (метод двухквантового эталона).
-
Показать связь сечений двухфотоіпюго поглощения с молекулярной структурой (модель я- электронного облака).
-
Теоретически и экспериментально исследовать двухступенчатые процессы взаимодействия лазерного голучешш с красителями и разработать метод исследования переноса энергии возбуждения с высоких возбужденных синглетных состояний (метод характеристических зависимостей).
Научная новизна. В результате проведенных исследований разработаны новые экспериментальные методы и подходы формирующие новое направление - двухфотонная лазерная спектроскопия биологических молекул. Полученные экспериментальные результаты, установленные закономерности и их шггерпретащш определяют основные защищаемые положения.
На защиту выносятся:
1. Автоматизированный лазерный спектрометр для исследования спектров двухфотонно-возбуждаемой люминесценции и люминесценции из высоких возбужденных состояний биоорганических молекул и органических красителей и спектры двухфотоішо-возбуждаемой люминесценции органических и биологических молекул, измеренные впервые.
-
Метод двухбайтового эталона для измерения сечений двух-фотонного поглощения органических и биологических молекул не зависящий от пространственных и временных флуктуации лазерного излучения, концентрационные зависимости сечений и значения сечений двухфотошюго поглощения ряда органических молекул, биологических молекул и молекул биологически активных веществ, измеренные впервые.
-
Модель л-электронного облака, позволяющая на основе измерений сечений двухфотонного поглощения оценить эффективные размеры эффективных я-электронных облаков и значения эффективных радиусов электронных облаков органических и биологических молекул.
-
Метод характеристических зависимостей, основанный на измерениях с помощью управляемого аттенюатора возбуждающего излучения зависимости интенсивности коротковолновой люминесценции из высоких возбужденных состояний от интенсивности возбуждения и определение параметров нелинейности - показателя участия данного высшего синглетного состояния в процессах переноса энергии возбуждения.
-
Представление о биологической ткани как нелинейной оптической среде приводящей к появлению в ней гармоник основного излучения в процессе распространения излучения видимого диапазона.
Практическая ценность. Метод двухквантового эталона позволяет измерять сечения двухфотошюго поглощения до 10" см с/фот мол, что по чувствительности на два порядка выше ранее существующих методов измерений сечений. Метод может быть легко реализован при измерениях на других длинах волн и с другими источниками лазерной накачки и найти широкое применение для поиска эффективных материалов для практических приложений (фотохром-ных материалов, красителей для двухфотонной фотодинамической терапии, сред для объемных транспарантов). Измеренные сечения двухфотонного поглощения являются фундаментальными константами и могут составить основу таблиц нелинейных оптических характеристик органических и биологических молекул. Вводимая классификация - сильных и слабых квадрофоров позволяет проводить отбор и сравнение молекул - перспективных кандидатов для прикладных применений, использующих двухфотонно-возбуждаемую люминесценцию.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на 1 Всесоюзном биофизическом съезде (Моск-ва,1982), V Всесоюзном симпозиуме по химии и физике белков и пептидов (Баку, 1980), VI Симпозиуме по конформационным изменениям биополимеров в растворах (Тбилиси, 1985), ХПІ Международной конференции по когерентной и нелинейной оптике (Минск, 1988), XV Международной конференции по когерентной и нелинейной оптике (Санкт-Петербург,1995), XI Международной конференции по когерентной и нелинейной оптике (Москва, 1998), Международной кон-ферешщи "Лазер-91" (Сан-Диего,США,1991), на Международном со-вещании "Биолюминесценция в экологии и образовании" (Красноярск, 1994), на Международных научно-технических конференциях "Актуальные проблемы электронного приборостроешм" (Новосибирск, 1992,1994,1996, 1998), на X и XI Международной Вавиловской конференции Новосибирск, 1990,1997), на 2 Европейском биофизическом конгрессе (Орлеан, Франция, 1997), на 1 Корейско-Российском симпозиуме "КОРУС-97" (Ульсан, Южная Корея,1997,) на научных семинарах в институтах СО РАН: биоорганической химии, автоматики и электрометрии, лазерной физики (Новосибирск), биофизики (Красноярск).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 36 работ. Материалы диссертационной работы отражены в шести научно-исследовательских отчетах по программам Университеты России "Физика лазеров и лазерные системы" - МЛЦ МГУ (1993,1994,1996) и "ФИЗМАТ" (1993,1994,1995).
Личный вклад автора состоял в проведении всех экспериментальных и теоретических работ по теме диссертации. Автору принадлежит идея измерения сечений ДФП с калибровкой каналов спектрометра по эталону (метод эталона), эксперименгально реализованная совместно с сотрудниками лаборатории лазерной спектроскопии; модель л- электронного облака и все расчеты размеров электронных облаков органических и биологических молекул и все биофизические интерпретации двухфотонных взаимодействий лазерного излучения с биологическими молекулами.
Список используемых сокращений. БАВ - биологически активные вещества, ВВСС - высшие возбужденные синглетные состояішя, ДФВЛ - двухфотонно-возбуждаемая люминесценция, ДФП - двухфо-тоннос поглощение, МСБ - р-бис-О-метилстерилбензол, 5'dAMP - 5'-
дезоксирибо-аденин монофосфат, 5'dCMP - 5'-дезоксирибо-цитозші монофосфат, 5'dAGP - 5'-дезоксирибо-гуашш монофосфат, 5'dATP -5'дезоксирибо-тимин монофосфат, DODCI- 3,3-диэтилоксадикарбо-цианиниодид, РОРОР - 1,4-ди-(5-феншюксазолил-2) бензол.
Структура работы. Диссертационная работа изложена на 320 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, четырех глав с изложением результатов работы, заключения, выводов и списка литературы (188 источников, в т.ч. 115 - зарубежных). Диссертация иллюстрирована 96 рисунками и 13 таблицами.